Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans Escherichia coli

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les protéines membranaires exprimées dans les SIA coli pour des analyses structurelles et fonctionnelles. Tout d’abord, les bactéries sont récoltées, couchées et analysées par la page SDS pour la visualisation des protéines GFP correctement repliées par fluorescence Ingel. Dans un deuxième temps, la production de l’e coli déterminé à exprimer les protéines membranaires d’intérêt est mise à l’échelle et une fraction membranaire totale est préparée à partir des cellules après l’induction de l’expression de la protéine.

Enfin, la fraction totale de la membrane est solubilisée dans quatre détergents différents et la mono dispersité du détergent. Solubilisé. Les protéines GFP sont analysées par chromatographie d’exclusion stérique. En fin de compte, les protéines peuvent être surveillées par fluorescence et les profils eluciens tracés pour évaluer la monodispersité d’agrégation et la GFP libre dans les échantillons.

La production de protéines membranaires recombinantes pour les études structurales et fonctionnelles reste techniquement difficile en raison de leur faible solubilité et de leur instabilité héritée une fois extraites dans les détergents. L’expérience a montré que le criblage de plusieurs variantes de protéines membranaires, telles que les orthologues de différentes espèces, peut améliorer le taux de réussite de l’expression des protéines membranaires. Fusion avec des protéines fluorescentes vertes utilisées pour signaler un repliement authentique.

La première étape de notre protocole basé sur la GFP pour le criblage de l’expression des protéines membranaires et d’E coli utilise la fluorescence primaire des lysats détergents de cellules entières pour identifier les constructions protéiques membranaires pour une analyse plus approfondie basée sur le niveau d’expression dans le criblage. Cela fournit des informations sur la monodispersité des complexes protéiques détergents. Pour analyser l’expression bactérienne induite par l’IPTG, commencez par transférer un millilitre de duplicata de la culture nocturne de 24 blocs de puits profonds dans 96 blocs de puits profonds, scellez les blocs, puis faites tourner les cellules pendant 10 minutes à 6 000 fois G à température ambiante.

Ensuite, retournez le bloc pour décanter le support en tapotant doucement sur une serviette en papier pour égoutter le liquide restant. Fermez à nouveau la plaque et conservez les cellules à moins 80 degrés Celsius après au moins 20 minutes. Décongelez les granulés pendant 20 minutes à température ambiante, puis à l’aide d’une pipette multicanaux pour remettre complètement les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon de lyse.

Traitez les cellules avec 20 microlitres de solution DLPI qui tremblait à 1000 tr/min et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite 25 microlitres de 10 % de doda multiside dans chaque puits et incubez les cellules pendant encore 60 minutes en secouant. Après la centrifugeuse de traitement DDM, le puits profond bloque, puis transfère 10 microlitres de lysat clairci sur une plaque de microtitration et ajoute 10 microlitres de tampon de chargement de gel de page SDS.

Chargez maintenant le gel avec 10 microlitres de la solution tampon de lysat par puits et faites fonctionner le gel à tension constante entre 100 et 120 volts dans une chambre froide pendant deux à 2,5 heures lorsque le diaphragme atteint le fond. Placez le gel sur un imageur avec un filtre à lumière bleue pour détecter les protéines de fusion afin d’augmenter l’échelle des cultures cellulaires. Après avoir transformé un Eloqua d’e coli compétent, choisissez une colonie dans 10 millilitres de bouillon puissant pour une croissance nocturne à 37 degrés Celsius.

Le lendemain matin, diluez cinq millilitres de la culture de nuit dans 500 millilitres de bouillon énergétique et continuez à cultiver les cultures en secouant à 250 tr/min et 37 degrés Celsius. Lorsque la DO à 595 nanomètres est d’environ 0,5, induisez l’expression en ajoutant IPTG à une concentration finale d’un millimolaire, puis replacez la culture dans l’agitateur pendant la nuit, cette fois à 20 degrés Celsius. Le lendemain matin, récoltez les cellules par centrifugation et stockez les granulés à moins 80 degrés Celsius.

Pour préparer les membranes cellulaires. Suspendez à nouveau les troisièmes granulés à température ambiante dans cinq millilitres de PBS par gramme de granule cellulaire, en augmentant le volume si nécessaire jusqu’à ce que la viscosité diminue jusqu’à une consistance liquide. Ajoutez ensuite du chlorure de magnésium à une concentration finale d’ADN millimolaire à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre et un comprimé d’inhibiteur de protéase préemballé pour 20 grammes de pastille cellulaire dans les cellules.

Ensuite, ouvrez les cellules à l’aide d’un perturbateur de cellules réfrigérées à une pression de 30 KPSI, puis granulez les cellules et les débris intacts pendant 15 minutes à 30 000 fois G et quatre degrés Celsius. Transférez le supinate dans un tube d’ultracentrifugation et collectez la fraction totale de la membrane en faisant tourner le supinate pendant une heure à 200 000 fois G et quatre degrés Celsius. Ensuite, utilisez l’homogénéisateur de cellules pour remettre en suspension la pastille de membrane dans 10 millilitres de PBS glacé afin de solubiliser les membranes pour chaque détergent à utiliser.

Aliquote 900 microlitres de la suspension à membrane dans un tube polycentrifi de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite 100 microlitres de chaque détergent fraîchement préparé dans les tubes appropriés de 1,5 millilitre et incubez les mélanges à quatre degrés Celsius avec une végétation douce. Au bout d’une heure, granulez le détergent et les fractions solubles avec une ultra-centrifugeuse de paillasse, en vous assurant que les tubes sont au moins à moitié pleins et retiennent l’agent en décubitus dorsal pour la chromatographie d’exclusion stérique détectée par fluorescence ou l’analyse FEC.

Ensuite, une colonne d’exclusion de taille d’équateur avec une large plage de fractionnement avec un tampon de débit courant à un débit de 0,3 millilitre par minute. Injectez ensuite 100 microlitres d’un échantillon de membrane solubilisé dans la colonne au même débit et surveillez le profil elucien à l’aide d’une optique de fluorescence. Enfin, importez les données de volume elucien et d’intensité de fluorescence dans un tableur pour affichage graphique et analysez le matériau de membrane solubilisé restant par fluorescence inégale.

Comme démontré précédemment, ladite famille de protéines est essentielle à la division cellulaire bactérienne. Dans ces images, un représentant de la visualisation par fluorescence de gel de 24 OUTTA 47 ces constructions est montré. L’intensité des bandes donne une indication du niveau d’expression.

Par exemple, la protéine de fusion dans la scène quatre est bien exprimée dans les deux souches. Cependant, les bandes supplémentaires de poids moléculaire inférieur suggèrent que la protéine est partiellement dégradée dans de nombreuses voies. Il existe une bande dont la taille correspond à la GFP seule.

Par exemple, G quatre et H quatre sont complètement décomposés en GFP libre dans la souche C 41 DE trois P lies S. Alors que dans le LEMO 21 DE trois, il y a une protéine intacte dans ces graphiques. L’analyse de deux constructions qui ont bien fonctionné dans le crible primaire par exclusion de taille détectée par fluorescence démontre comment les protéines se comportent différemment selon lequel des quatre détergents a été testé.

Par exemple, cette protéine n’a donné qu’un pic symétrique avec l’agrégation de la litière dans Dool Multiside, ce qui en fait le détergent de choix pour la purification ultérieure. En revanche, l’autre protéine de fusion présentait un profil similaire dans tous les détergents testés. Ce protocole peut être facilement étendu pour inclure, par exemple, différentes souches d’E. coli cultivées dans différentes conditions d’expression et des moyens de dissuasion supplémentaires dans les criblages primaires et secondaires.

En résumé, l’objectif principal de ce protocole est de permettre de cribler un grand nombre de protéines membranaires en termes d’expression et de détergentisation afin d’identifier des candidats pour une analyse plus approfondie.