Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans

L'objectif général de cette procédure est d'identifier les protéines membranaires exprimées dans SIA coli pour des analyses structurales et fonctionnelles. Premièrement, les bactéries sont récoltées, lysées et analysées par électrophorèse SDS-PAGE afin de visualiser les protéines GFP correctement repliées par fluorescence en gel. Dans un deuxième temps, la production des e coli destinés à exprimer les protéines membranaires d'intérêt est amplifiée et une fraction membranaire totale est préparée à partir des cellules après induction de l'expression des protéines.

Enfin, la fraction membranaire totale est solubilisée dans quatre détergents différents et la monodispersité des protéines GFP solubilisées par détergent est analysée par chromatographie d'exclusion stérique. En définitive, les protéines peuvent être suivies par fluorescence et les profils d'élution tracés afin d'évaluer l'agrégation, la monodispersité et la présence de GFP libre dans les échantillons.

La production de protéines membranaires recombinantes pour des études structurales et fonctionnelles reste techniquement difficile en raison de leur faible solubilité et de leur instabilité intrinsèque une fois extraites dans des détergents. L'expérience montre que l'analyse de plusieurs variants de protéines membranaires, tels que des orthologues provenant d'espèces différentes, peut améliorer le taux de succès de l'expression des protéines membranaires. La fusion à des protéines vertes fluorescentes permet de signaler un repliement authentique.

La première étape de notre protocole fondé sur la GFP pour le criblage de l'expression de protéines membranaires chez E. coli consiste à utiliser la fluorescence en gel de lysats détergents provenant de cellules entières afin d'identifier les constructions de protéines membranaires destinées à une analyse ultérieure, en fonction du niveau d'expression observé lors du criblage. Le comportement des protéines membranaires en présence de différents détergents est ensuite évalué par détection de fluorescence couplée à une chromatographie d'exclusion stérique. Cette approche fournit des informations sur la monodispersité des complexes protéine-détergent. Pour analyser l'expression bactérienne induite par l'IPTG, commencez par transférer un millilitre de culture d'E. coli traitée à l'IPTG, en double, provenant de blocs profonds de 24 puits provenant de culture nocturne vers des blocs profonds de 96 puits, scellez les blocs, puis centrifugez les cellules pendant 10 minutes à 6 000 ×g à température ambiante.

Ensuite, retournez le bloc pour décantation du milieu en tapotant doucement sur une serviette en papier afin d'éliminer tout liquide résiduel. Refermez la plaque et conservez les cellules à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes. Décongelez les pastilles pendant 20 minutes à température ambiante, puis utilisez une pipette multicanal pour resuspendre complètement les cellules dans 200 microlitres de tampon de lyse.

Traitez les cellules avec 20 microlitres de solution DLPI en agitant à 1000 tr/min et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite 25 microlitres de 10 % de doda multiside à chaque puits et incubez les cellules pendant encore 60 minutes sous agitation. Après le traitement au DDM, centrifugez le bloc profond et transférez 10 microlitres du lysat clarifié dans une plaque de microtitration, puis ajoutez 10 microlitres de tampon de charge pour gel SDS-PAGE.

Chargez maintenant le gel avec 10 microlitres de solution tampon de lyse par puits et faites migrer le gel à une tension constante comprise entre 100 et 120 volts, en chambre froide, pendant deux à 2,5 heures, lorsque le diaphragme atteint le fond. Placez le gel sur un système d'imagerie équipé d'un filtre à lumière bleue pour détecter les protéines de fusion afin de passer à une culture cellulaire à plus grande échelle. Après la transformation d'une cellule compétente E. coli, sélectionnez une colonie et placez-la dans 10 millilitres de bouillon nutritif pour une croissance nocturne à 37 degrés Celsius.

Le lendemain matin, diluez cinq millilitres de la culture de la nuit dans 500 millilitres de bouillon nutritif et poursuivez la croissance des cultures sous agitation à 250 tr/min et à 37 degrés Celsius. Lorsque la DO à 595 nanomètres est d'environ 0,5, induisez l'expression en ajoutant de l'IPTG à une concentration finale de un millimolaire, puis remettez la culture dans l'agitateurs pendant la nuit, cette fois à 20 degrés Celsius. Le lendemain matin, récoltez les cellules par centrifugation et conservez les pastilles à moins 80 degrés Celsius.

Pour préparer les membranes cellulaires, resuspendre les troisièmes pellets à température ambiante dans cinq millilitres de PBS par gramme de culot cellulaire, en augmentant le volume si nécessaire jusqu'à ce que la viscosité diminue et atteigne une consistance fluide. Puis ajouter du chlorure de magnésium à une concentration finale de un millimolaire, de l'ADN à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre et un comprimé d'inhibiteur de protéase préemballé par 20 grammes de culot cellulaire aux cellules.

Ensuite, lyser les cellules à l'aide d'un disrupteur cellulaire refroidi à une pression de 30 KPSI, puis centrifuger les cellules non lysées et les débris pendant 15 minutes à 30 000 ×g et à 4 °C. Transférer le surnageant dans un tube d'ultracentrifugation et recueillir la fraction membranaire totale en centrifugeant le surnageant pendant une heure à 200 000 ×g et à 4 °C. Puis, utiliser l'homogénéisateur cellulaire pour resuspendre le culot membranaire dans 10 millilitres de PBS glacé afin de solubiliser les membranes pour chaque détergent à utiliser.

Prélevez 900 microlitres de la suspension membranaire dans un tube de centrifugation poly de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite 100 microlitres de chaque détergent fraîchement préparé dans les tubes de 1,5 millilitre appropriés et incubez les mélanges à quatre degrés Celsius avec un léger agitage. Après une heure, récupérez par centrifugation les fractions détergent et soluble à l’aide d’une ultracentrifugeuse de table, en veillant à ce que les tubes soient remplis au moins à moitié, puis conservez le surnageant pour une analyse par chromatographie d’exclusion stérique détectée en fluorescence ou par analyse FEC.

Ensuite, utilisez une colonne de filtration par gel de taille équatoriale présentant une large gamme de fractionnement, en utilisant un tampon de flux à un débit de 0,3 millilitre par minute. Puis injectez 100 microlitres d’un échantillon de membrane solubilisé sur la colonne au même débit, et surveillez le profil d’élution à l’aide d’optiques de fluorescence. Enfin, importez les données de volume d’élution et d’intensité de fluorescence dans un programme de tableur pour une représentation graphique, et analysez le matériau membranaire solubilisé restant par fluorescence en gel.

Comme démontré précédemment, la famille de protéines mentionnée est essentielle à la division cellulaire bactérienne. Sur ces images, une visualisation représentative par fluorescence en gel de 24 constructions sur 47 est présentée. L'intensité des bandes donne une indication du niveau d'expression.

Par exemple, la protéine de fusion dans la bande de la scène quatre est bien exprimée dans les deux souches. Toutefois, les bandes supplémentaires de poids moléculaire inférieur suggèrent que la protéine est partiellement dégradée dans de nombreuses bandes. Il existe une bande dont la taille correspond à celle de la GFP seule.

Par exemple, G quatre et H quatre sont complètement dégradés en GFP libre dans la souche C 41 DE trois P lys S. Alors que dans la souche LEMO 21 DE trois, il reste une certaine quantité de protéine intacte dans ces graphiques. L'analyse de deux constructions ayant bien performé lors du criblage primaire par exclusion stérique avec détection de la fluorescence montre comment les protéines se comportent différemment selon le détergent testé parmi les quatre.

Par exemple, cette protéine a donné uniquement un pic symétrique sans agrégation dans le Dool Multiside, ce qui en fait le détergent de choix pour la purification ultérieure. En revanche, l'autre protéine de fusion a présenté un profil similaire dans tous les détergents testés. Ce protocole peut facilement être étendu pour inclure, par exemple, différentes souches d’e. coli cultivées dans des conditions d'expression variées, ainsi que des détergents supplémentaires dans les criblages primaire et secondaire.

En résumé, le but principal de ce protocole est de permettre le criblage d'un grand nombre de protéines membranaires en termes d'expression et de solubilisation par détergent afin d'identifier des candidats pour des analyses ultérieures.