Évaluation de l'arborisation dendritique dans le gyrus denté de la région de l'hippocampe chez la souris

L’objectif général de l’expérience suivante est d’étudier l’étendue de l’arborisation dendritique dans l’hippocampe d’un modèle murin. Ceci est réalisé par deux méthodes différentes. Dans la première méthode, les dendrites sont tracées manuellement et en temps réel sur toute l’épaisseur de chaque section.

Après le traçage, l’ensemble de l’arbre dendritique peut être reconstruit et analysé. À l’aide du diagramme en éventail, l’analyse de divers diagrammes en éventail dérivés de différentes souris peut être utilisée comme moyen de comparaison objectif. La deuxième méthode consiste à visualiser l’arborisation dendritique avec une imagerie à profondeur de champ étendue.

Enfin, une méthode panoramique est utilisée pour assembler plusieurs images à fort grossissement afin de produire une image composite à haute résolution pour l’évaluation qualitative et quantitative des dendrites dans toute la région d’intérêt. Les recherches de l’AMI découlent de mon laboratoire. Le principal avantage de ces techniques par rapport aux métaux existants est la facilité d’utilisation et la rapidité d’acquisition et de collecte de données.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, telles que l’évaluation de la dendritique dans les régions cérébrales affectées et l’évaluation des effets de différentes thérapies sur les dendrites. Dans cette procédure, un jour après que le cerveau de la souris ait été fixé dans 4 % d’aldéhyde paraforme, placez-le dans une solution de saccharose pour la déshydratation pendant 48 heures à quatre degrés Celsius. Retirez les cerveaux du saccharose et placez-les directement sur des blocs de cuivre posés sur de la glace sèche.

Remplissez le bloc d’OCT et marquez l’orientation du cerveau en utilisant le bulbe olfactif comme point de repère. Coupez des sections de 70 microns d’épaisseur à moins 20 degrés Celsius à l’aide d’un cryostat et placez-les dans une solution cryoprotectrice et maintenez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Incuber les sections dans du peroxyde d’hydrogène dans du méthanol pendant 30 minutes à température ambiante, puis les réchauffer à 37 degrés Celsius dans du TBS pendant une demi-heure.

Incuber les sections avec du Triton à 0,3 % et du sérum de cheval normal pendant 45 minutes à température ambiante avant de les colorer avec l’anticorps DCX le lendemain. Lavez les sections trois fois de suite dans du TBS et incubez les sections avec un antigo de cheval biotinylé pendant deux heures à température ambiante. Lavez les sections trois fois consécutives dans du TBS pendant 10 minutes chacune et incuberez-les avec une lumière B, C pendant 1,5 heure.

À température ambiante, ajoutez du peroxyde d’hydrogène à la solution DAB et incubez immédiatement les sections dans cette solution pendant cinq minutes et terminez la réaction en les lavant trois fois avec du TBS glacé suivi d’une. Laver en TT BS à température ambiante. Déshydratez les sections à l’aide d’une série de solutions d’éthanol.

Cinq minutes chacune, transparent et xylène, puis couvrez-le à l’aide de DPX. Une fois les sections complètement sèches, nettoyez l’excès de DPX sur les surfaces des lames à l’aide d’une lame tranchante et placez-les un par un sur la platine de balayage du microscope. Le système de visualisation est composé d’un microscope équipé d’un joystick de platine de balayage et d’une caméra couleur 12 bits.

Ensuite, démarrez le programme neuro lucita et ouvrez un nouveau fichier de données. Placez un point de référence sur l’écran en cliquant à n’importe quel endroit avec le pointeur de la souris pour activer toutes les icônes du panneau d’outils de la fenêtre du programme. Cliquez ensuite sur l’icône du joystick libre dans la barre d’outils et utilisez le joystick pour localiser le gyrus denté de l’hippocampe.

Dans la première section de l’onglet Outils de la fenêtre du programme, sélectionnez Gestionnaire de sections de série. Cliquez sur l’icône de nouvelle section dans le coin inférieur gauche de la fenêtre pour ouvrir la fenêtre de configuration de la section série. Ensuite, sélectionnez la fenêtre de configuration de la section de série et entrez le nombre total de sections contenant des régions hippocampiques.

Sélectionnez ensuite l’intervalle d’évaluation et entrez l’épaisseur de la section. Commencez à tracer la région du gyrus denté en cliquant sur l’icône de dessin de contour à main levée dans la barre d’outils. Tracez ensuite le contour de la couche de cellules granulaires dentées.

Sélectionnez 100 x dans le menu d’agrandissement. Ajoutez ensuite une goutte d’huile d’immersion sur la section et passez l’objectif à 100 x. Localisez les corps cellulaires granulaires dentés et les dendrites sous cet objectif.

Ensuite, concentrez-vous sur un neurone sélectionné et cliquez sur l’icône de traçage des neurones. Sur la barre d’outils, tracez la circonférence du corps de la cellule granulaire dentée. Une fois le traçage terminé, cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner Terminer le corps de la cellule.

Commencez maintenant à tracer les dendrites manuellement et les directions X, Y et Z, et suivez chaque branche à l’aide du joystick et du bouton du moteur Z Au niveau d’un nœud de bifurcation ou de trifurcation, sélectionnez l’option correspondante. Dans le menu déroulant, tracez chacune des branches qui découlent de ces nœuds à la fin de chaque branche. Faites un clic droit et sélectionnez Fin dans le menu déroulant.

À l’aide des icônes des touches fléchées dans la fenêtre du logiciel. Sélectionnez au hasard une autre cellule de granule denté et répétez la procédure de traçage comme cela vient d’être démontré. Enregistrez l’intégralité du traçage.

Démarrez maintenant neuro lucita explorer pour l’analyse des neurones. Ouvrez le premier fichier de données NRX à partir de la première souris du groupe expérimental. Ajoutez le fichier NRX de la deuxième souris du groupe expérimental et continuez jusqu’à ce que tous les fichiers NRX de ce groupe soient ajoutés.

Sous l’onglet analyse, sélectionnez ventilateur dans le diagramme pour ouvrir la fenêtre ventilateur dans l’analyse, cochez la case dendrites et cliquez sur afficher pour les liens et les motifs de ramification des dendrites pour ce groupe de souris. Dans cette procédure, connectez le microscope à un appareil photo numérique. Placez une section sur la platine de balayage connectée au microscope et passez à un objectif 10 x.

Ensuite, déplacez la scène vers la zone d’intérêt. Démarrez un programme de capture vidéo et appuyez sur le bouton d’enregistrement. Dès que le bouton d’enregistrement est enfoncé, utilisez le bouton de mise au point macro pour vous déplacer du haut vers le bas de la section pendant un total de quatre secondes Avant d’enregistrer le fichier vidéo résultant, utilisez maintenant le logiciel gratuit Image J pour convertir les fichiers vidéo a VI dans un format non compressé.

Démarrez un programme d’analyse d’images et ouvrez le fichier VI. Allez dans le menu de processus et cliquez sur Profondeur de champ étendue. Sélectionnez le fichier vidéo correspondant dans les options de sortie.

Sélectionnez Générer une image composite de meilleure mise au point dans les options d’analyse de la mise au point. Sélectionnez les options d’éclairage normalisé et de contraste local max. Cliquez ensuite sur Créer pour générer une image résultante, qui représente tous les pixels focalisés sur l’axe Z.

Ensuite, enregistrez l’image résultante. Dans cette étape, placez une section sur la platine de balayage reliée au microscope. Déplacez la scène vers la zone d’intérêt.

Démarrez ensuite le programme d’acquisition d’images à l’aide d’un objectif 10x, acquérez et enregistrez des images haute résolution de la région d’intérêt, en vous assurant d’avoir au moins 10 % de chevauchement entre les images. Exécutez ensuite l’éditeur de composite d’images pour assembler les images par la suite. Allez dans le menu Fichier et cliquez sur nouveau panorama.

Sélectionnez le dossier dans lequel les images sont stockées. Ensuite, sélectionnez les images qui appartiennent à la même région et appuyez sur OK. Appuyez sur le bouton d’exportation vers le disque et enregistrez l’image.

Cette image représente une image à très haute résolution de la zone d’intérêt qui pourrait être utilisée pour l’analyse. Cette figure montre la visualisation de l’arborisation dendritique avec et sans méthodes EDFI. La méthode traditionnelle pour trouver le meilleur plan de mise au point a été comparée à l’EDFI et à des valeurs significativement plus élevées de l’aire dendritique.

En utilisant la méthode EDFI ont été trouvés. La quantification de la longueur et du volume occupés par les dendrites dans différents ordres de ramification est illustrée ici. La longueur et le volume maximum ont été atteints dans l’ordre un.

Voici un histogramme de la longueur dendritique des cellules granulaires dentées. La majorité des segments dendritiques des DDR de coloration DCX avaient une longueur de 13 à 26. Cette ligne pointillée rouge représente la distribution normale des données présentées à la suite de cette procédure.

D’autres méthodes classiques comme neuro Lucid pourraient être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant le volume et la surface occupés par les dendrites. Cette technique que nous vous avons montrée ici aidera énormément les chercheurs dans le domaine de la neurobiologie non seulement à évaluer l’ation des structures neuronales, mais aussi à évaluer les petites structures non neuronales comme la microglie dans les sections cérébrales épaisses. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer l’étendue des projections neuronales dans un laps de temps relativement court.