Name: Évaluation de larborisation dendritique dans le gyrus denté de la région de lhippocampe chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Découvrez deux méthodes d'imagerie pour visualiser et quantifier l'arborisation dendritique dans l'hippocampe de souris : le traçage en temps réel et l'imagerie à profondeur de champ étendue. Ces techniques complémentaires permettent d'analyser la morphologie neuronale avec précision.

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Cette recherche a été soutenue par des subventions de la Fondation LuMind, de Research Down Syndrome et de l’Alzheimer’s Association (AS). Le CP a été partiellement soutenu par une subvention de développement du corps professoral du College of Nursing and Health Professions de l’Université d’État de l’Arkansas.

NOTE: Des expériences ont été menées en conformité avec les normes éthiques approuvés par le Comité de la recherche animale au système de soins de santé Anciens Combattants Palo Alto. 1. Golgi-Cox Coloration <ol><li> l&#39;extraction du cerveau et de la coloration <ol><li> Le 1er jour, anesthésier profondément souris avec 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine avant euthanasie par exsanguination. </li><li> Retirez délicatement la calotte crânienne et disséquer le cerveau. <ol><li> Première enlever la peau sur le dessus du crâne, en plaçant une paire de ciseaux courbes sur le dessus du cervelet et doucement couper à travers la calotte crânienne parallèle au sillon central avec la pointe du ciseau tourné vers l&#39;extérieur, se déplaçant dans la direction vers le bulbe olfactif. Répétez ce processus sur les deux côtés. </li><li> Utilisez un pincet chirurgicale pour soulever la calotte crânienne en le tournant vers les bulbes olfactifs et rompre. Ensuite, retournez le crâne à l&#39;envers et utiliser une pioche pour couper à travers l&#39;optiquenerfs et desserrer le cerveau. Enfin, utilisez le choix de séparer le cerveau de la moelle épinière au niveau du foramen magnum. </li></ol></li><li> Immédiatement immerger le cerveau dans 15 ml de disponible dans le commerce, solution non diluée Golgi-Cox. Rangez le cerveau en solution dans un appareil de Golgi plafonné, 20 ml bouteille en verre à la température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Au 2ème jour, versez lentement la solution et le remplacer par 15 ml de solution fraîche Golgi-Cox. Reboucher la bouteille contenant le cerveau et laisser reposer pendant encore neuf jours dans l&#39;obscurité. </li></ol></li><li> Sectionnement et de scellement <ol><li> Sur le 11e jour, placez le cerveau en solution de saccharose à 30%, préparés ddH 2 O pour la déshydratation. Changer la solution fraîchement préparée avec 30% de saccharose après 12 heures. Incuber le cerveau dans une solution de saccharose à 30% pendant 3 jours à 4 ° C. </li><li> Le 14e jour, remplir le réservoir de la vibratome avec une solution de saccharose à 30% jusqu&#39;à ce que la lame est couvert. Réglez la vitesse à 1 mm / s avec une amplitude de 0,95 mm. </li><li> Éponger les cerveaux avec un Kimwipe pour enlever l&#39;excès d&#39;humidité et retirez le cervelet en utilisant une lame de rasoir pour couper coronaire. </li><li> Fermement monter l&#39;ensemble du cerveau sur la plate-forme de vibratome utilisant superglue et laisser reposer pendant 2-4 min. Insérer la plate-forme avec le cerveau collée dans le réservoir et régler la lame à la partie supérieure du cerveau. </li><li> Utilisation du vibratome, découper le cerveau en 150 sections um d&#39;épaisseur à la température ambiante, sans oublier de changer la lame après chaque 3ème cerveau. </li><li> Ramassez les sections du réservoir à l&#39;aide d&#39;une petite brosse à pointe et plongez-les dans une boîte de Pétri contenant 0,3% de gélatine faite en ddH 2 O. Bien que les sections restent dans la boîte de Pétri, ajouter 0,5 ml de 0,3% de gélatine sur chaque diapositive et utilisez une brosse à se répandre et enduire les SuperFrost + diapositives. </li><li> Prendre doucement les sections immergées de la boîte de Pétri et placez-les sur les lames gélatinisées. Orienter les sections de cerveau parles toucher uniquement sur leurs côtés et non sur les sommets. </li><li> Après environ dix minutes, enrober les sections avec 30% de saccharose avant que le tissu sèche complètement. Puis sécher à l&#39;air les lames préparées dans un endroit sombre dans un rack coulissant pour trois jours. </li><li> Diluer disponible dans le commerce 10x solution de développement à 1x utilisant ddH 2 O. Plonger les lames dans la solution de développement pour les 7-10 min. Rincer les lames trois fois en ddH 2 O. </li></ol></li><li> Déshydration <ol><li> Préparer 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, et des solutions d&#39;éthanol 95% en utilisant distillée ddH 2 O. </li><li> Faire tremper les lames dans des solutions d&#39;éthanol plus en plus élevés pendant 10 minutes chacun. </li><li> Faire tremper les lames dans une solution d&#39;éthanol à 100% trois fois pendant 10 min à chaque fois. </li><li> Faire tremper les lames dans 100% xylène trois fois de suite à 5 min chacun, en gardant les sections dans la solution finale jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient couvercle-glissé. </li><li> Placez une quantité généreuse de DPX (phtalate de di-n-butyle dans le xylène) milieu de montage (absur 1 à 1,5 ml) sur chaque diapositive à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert en plastique. Placez délicatement lamelles pour éviter les bulles. </li><li> Couverture sèche-Air glissé cerveau sections horizontalement pour trois jours. </li></ol></li></ol> 2. Doublecortin coloration <ol><li> Profondément anesthésier (voir l&#39;étape 1.1.1) les animaux. </li><li> Effectuer perfusion cardiaque avec fraîchement préparé paraformaldéhyde à 4% faite dans un tampon phosphate 12. </li><li> Extraire le cerveau (voir 1.1.2) et entreposer dans 45 ml de paraformaldéhyde 4% à 4 ° C pendant la nuit sur un agitateur à bascule. </li><li> Transférez les cerveaux à une solution de saccharose à 30% et d&#39;attendre déshydratation complète pendant 48 heures à 4 ° C. Retirez les cerveaux à partir de saccharose et de les placer directement sur des blocs de cuivre placés sur de la glace sèche. </li><li> Remplir le bloc à température de coupe optimale (OCT) et composé marquer l&#39;orientation du cerveau en utilisant le bulbe olfactif comme point de repère. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un cryostat, couper 70 sections microns d&#39;épaisseur à -20 ºC et placez-lesdans une solution de cryoprotecteur (25% d&#39;éthylèneglycol, 25% de glycerol, dans un tampon de phosphate de sodium 0,05 M, pH 7,4) et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Ajouter une solution de methanol à 50% et 50% cryoprotecteur. Ajouter à cette solution 0,5% de peroxyde d&#39;hydrogène (vol / vol). Incuber les coupes flottantes pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Sections chaudes à 37 ° C dans du TBS (solution saline tamponnée au Tris) pour 30 à 40 min en les plaçant dans un four histologique. </li><li> Incuber les sections avec 0,3% de Triton et 3% de sérum de cheval normal à 45 min à température ambiante avant immunocoloration. Incuber les sections pendant une nuit à 4 ° C dans 3 ml de solution de l&#39;anticorps DCX dilué à 1: 500 dans du TBS avec 0,3% de Triton et 1% de sérum normal de cheval. </li><li> Le lendemain, laver les sections 3 fois de suite dans du TBS (10 min chacun). </li><li> Incuber les coupes avec un anti-chèvre de cheval biotinylé (1: 200 dans du TBS) pendant deux heures à la température ambiante. Laver les sections 3 fois de suite dans du TBS (10 min chacun). </li><li> Incuber tourlet avec ABC Lite (1: 1000) pendant 1,5 heure à température ambiante. </li><li> Ajouter 5 ul de 30% de H 2 O 2 à un comprimé de 10 mg de DAB (3,3 &quot;-Diaminobenzidine) solution dissous dans 15 ml de 1 M de Tris-HCl (pH 7,6). Incuber les sections immédiatement dans cette solution pendant 5 min. </li><li> Terminer la réaction en les lavant avec de la glace froide SCT trois fois suivi par un lavage dans du TBS à la température ambiante. </li><li> Déshydrater sections en utilisant une série de solutions d&#39;éthanol (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 minutes chacun), clarifier dans le xylène, puis lamelle en utilisant DPX comme dans l&#39;étape 1.3. </li></ol> 3. Visualisation <ol><li> Après séchage complet des sections, enlever l&#39;excès de DPX au-dessus des lames avec une lame tranchante, et placez-les sur la scène du microscope à balayage. Le système est composé d&#39;un microscope équipé d&#39;étape de balayage, manette de jeu, et une caméra couleur de 12 bits. </li><li> Démarrez le programme. Ouvrez un nouveau fichier de données. </li><li> Lieuun point sur l&#39;écran de référence en cliquant avec le pointeur de la souris à ne importe quel endroit. Cela permettra d&#39;activer toutes les icônes de la palette d&#39;outils de la fenêtre de programme. </li><li> Cliquez sur l&#39;icône &quot;Joystick gratuit&quot; sur la barre d&#39;outils, puis utilisez le joystick pour localiser le gyrus denté de l&#39;hippocampe dans la première section. </li><li> Dans l&#39;onglet &quot;Outils&quot; de la fenêtre de programme, sélectionnez &quot;chef de section de série&quot;. Cliquez sur l&#39;icône &quot;Nouvelle section&quot; dans le coin inférieur gauche de la fenêtre. Cela va ouvrir la fenêtre &quot;Section de configuration de série&quot;. </li><li> Sélectionnez la fenêtre Section de configuration de série, puis entrez le nombre total de sections qui contiennent des régions de l&#39;hippocampe. Sélectionnez l&#39;intervalle d&#39;évaluation. Entrez l&#39;épaisseur section de coupe (70 um pour DCX et 150 um pour les sections Golgi colorées). </li><li> Commencer à tracer la région de gyrus denté en cliquant sur l&#39;icône &quot;Freehand Dessin des contours&quot; dans la barre d&#39;outils. Décrire la couche de cellules granulaires dentées. &lt;/ Li&gt; <li> Sélectionnez &quot;100X&quot; dans le menu &quot;Agrandissement&quot;. Ajouter une goutte d&#39;huile d&#39;immersion sur la section et passer l&#39;objectif de 100X. Repérez les organismes et les dendrites des cellules granulaires dentés cadre de cet objectif. </li><li> Focus sur un neurone sélectionné et cliquez sur l&#39;icône &quot;Neuron Tracing&quot; sur la barre d&#39;outils. Trace de la circonférence du corps de cellules granulaires dentées. Lorsque vous avez terminé le traçage, cliquez sur la droite pour sélectionner &quot;Terminer cellulaire du corps&quot;. </li><li> Commencer à tracer les dendrites manuellement en X, Y et Z et suivre chaque branche en utilisant le bouton du joystick et z-moteur. À un noeud de bifurcation ou trifurcation, sélectionnez l&#39;option correspondante dans le menu déroulant sur clic-droit. Trace chacune des branches qui découlent de ces noeuds. À la fin de chaque branche clic droit et sélectionnez &quot;Ending&quot; dans le menu déroulant. </li><li> En utilisant les icônes des touches fléchées dans la fenêtre du logiciel de sélectionner au hasard un autre cellules granulaires dentées et suivez la même procédure que described à l&#39;étape 3/9 à 3/10. Enregistrer l&#39;ensemble du tracé. </li><li> Démarrez le logiciel de traçage neuronale. </li><li> Ouvrir le premier fichier de données à partir de la première NRX souris du groupe expérimental. Ajoutez le fichier NRX de la deuxième souris du groupe expérimental. Continuez jusqu&#39;à ce que tous les fichiers NRX de ce groupe sont ajoutés. </li><li> Sous l&#39;onglet Analyse, sélectionnez &quot;Fan Dans diagramme&quot;. Cela ouvre la fenêtre Dans Fan-analyse. Coche «dendrites» et cliquez sur Affichage, qui représente les longueurs et une ramification de dendrites pour ce groupe de souris (Figure 1). </li></ol> 4. EDFI Remarque: cette méthode permet à l&#39;utilisateur d&#39;enregistrer rapidement un grand nombre d&#39;images à travers l&#39;axe des z de chaque champ et de générer une image 2D qui contient tous les pixels focalisés à travers l&#39;axe z. Le résultat sera une image composite qui contient tous les pixels ciblées à partir d&#39;images collectées. <ol><li> Connectez le microscope à une caméra numériqueépoque. Placez les premières sections sur la scène de balayage connecté au microscope, puis passer à un objectif 10X. Déplacez la scène pour la zone d&#39;intérêt. </li><li> Lancer un programme de capture vidéo. </li><li> Appuyez sur le bouton d&#39;enregistrement. Dès que le bouton d&#39;enregistrement est pressée, utilisez le bouton macro-focus de passer du haut vers le bas de la section pour un total de 4 sec. Enregistrez le fichier vidéo résultant. </li><li> Utilisez ImageJ freeware pour convertir les fichiers vidéo AVI dans un format non compressé en ouvrant le fichier et de les enregistrer au format de fichier non compressé. </li><li> Lancer un programme d&#39;analyse d&#39;images et ouvrir le fichier AVI. Aller au menu &quot;Processus&quot; et cliquez sur &quot;profondeur de champ étendue». Sélectionnez le fichier vidéo correspondant. Dans options &quot;de sortie&quot;, sélectionnez &quot;Générer Composite Meilleur-Focus Image&quot;. </li><li> Dans options &quot;Analyse bref&quot;, sélectionnez &quot;normalisé Illumination&quot; et les options &quot;Max&quot; de contraste local. Ensuite, sélectionnez &quot;Cremangé &quot;. L&#39;image résultante représente l&#39;ensemble des pixels focalisés à travers l&#39;axe z (figure 2). </li><li> Enregistrer l&#39;image résultante. </li></ol> 5. Génération Résolution Images très haute NOTE: Cette méthode permet à l&#39;utilisateur de générer automatiquement un faible grossissement et images de très haute résolution à partir d&#39;images à fort grossissement à haute résolution d&#39;une manière automatisée. <ol><li> Placer les sections de la première étape de balayage connecté au microscope. Le microscope est connecté à un appareil photo numérique. Déplacez la scène pour la zone d&#39;intérêt. </li><li> Lancer un programme d&#39;acquisition d&#39;image. </li><li> Utilisez un objectif 10X et d&#39;acquérir et sauvegarder haute résolution (4076 x 3116) des images de la région d&#39;intérêt en se assurant d&#39;avoir au moins 10% de chevauchement. </li><li> Image d&#39;exécution Composite Editor d&#39;assembler des images. </li><li> Allez dans le menu Fichier, puis cliquez sur &quot;Nouveau Panorama&quot;. Sélectionnez le dossier dans lequel les images sont stORed. Sélectionnez les images qui appartiennent à la même région et appuyez sur &quot;ok&quot;. </li><li> Appuyez sur le bouton &quot;Exporter sur le disque&quot; et enregistrer l&#39;image. Cette image représente une image de très haute résolution de la zone d&#39;intérêt qui pourrait être utilisé pour l&#39;analyse et / ou de démonstration (Figure 3). </li></ol>

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Publication frais pour cet article sont parrainés par MBF Bioscience.

Ici, deux méthodes ont été décrites pour quantifier l&#39;ampleur de l&#39;arborisation dendritique dans les neurones matures et les nouveaux-nés en utilisant des méthodes classiques de coloration en collaboration avec RTI et EDFI. L&#39;acquisition d&#39;images haute résolution de neurones fournit une méthode extrêmement utile pour tester les effets délétères des troubles neurodégénératifs et, à son tour, fournit un moyen d&#39;évaluer les stratégies thérapeutiques qui ciblent les neurones de l&#39;hippocampe. <p c...

Modifications dynamiques dans le nombre et la structure des synapses sont les caractéristiques de développement, le vieillissement, et de nombreux troubles neurodégénératifs 1-3. La capacité des neurones à recevoir et à intégrer l&#39;information synaptique dépend de la morphologie dendritique et modifications dynamiques dans les connexions synaptiques. En effet, une corrélation positive existe entre épines dendritiques et le nombre de synapses, qui à la fois un impact fonction cognitive 4. Ainsi, il ne est pas surprenant que les dégradations de nombre d &#39;épines dendritiques ont été associés à un dysfonctionnement cognitif dans un certain nombre de troubles neurologiques 5-7, incitant un grand intérêt pour la quantification des épines dendritiques. Cependant, la quantification de la densité de la colonne vertébrale reste un temps long et fastidieux qui ne parvient pas à générer des informations utiles concernant la topographie et la distribution des synapses à travers l&#39;arbre dendritique. Heureusement, les méthodes de coloration (par exemple, l&#39;appareil de Golgi-Cox et doublecortine (DCX)) en conjonctionavec des techniques d&#39;imagerie sophistiquées peuvent être utilisées pour surmonter les obstacles actuels et produire des images haute résolution de l&#39;arborisation dendritique d&#39;une manière fiable et rapide. Alors que méthode de coloration de Golgi-Cox peut être déployée pour évaluer l&#39;état de l&#39;arborisation dendritique dans tous les neurones 8, DCX peut être déployé pour étiqueter neurones nouveau-nés en particulier dans le gyrus denté et la zone sous-ventriculaire 9, une considération importante étant donné que la neurogenèse se produit à la fois ces régions tout au long de la durée de vie 10,11. Après la coloration, deux méthodes d&#39;imagerie ont été déployés pour évaluer les caractéristiques dendritiques: i) l&#39;imagerie en temps réel (RTI) et ii) la profondeur de l&#39;imagerie de champ (EDFI) étendu. La technique RTI fournit un moyen de retracer et de quantifier la longueur et l&#39;ordre des arborisation le long des segments et des branches dendritiques individuelles. Ainsi il permet une estimation de la surface totale et le volume occupé par chaque arbre dendritique. Plus de specifically, dans le procédé RTI l&#39;utilisateur identifie de façon continue les segments et recentre itérative comme le neurone traçage logiciel recueille les x, y et z des coordonnées de la structure dendritique et reconstitue la trajectoire de la structure dendritique en 3D. En comparaison, la méthode EDFI fournit un moyen assez simples et rapides pour évaluer la densité dendritique dans des échantillons de tissus assez épaisses en générant une image composite, fournissant des informations sur l&#39;ensemble de l&#39;axe z. Pour ce faire, l&#39;utilisateur enregistre des fichiers vidéo à haute définition sur toute l&#39;épaisseur de la section puis utilise un logiciel pour rechercher les images vidéo pour identifier les points dans lequel un pixel est entièrement mis au point. Par la suite, les pixels ciblées sont fusionnés et intégrés dans une haute résolution, image 2D composite. Cette image composite contient tous les pixels qui sont de mise au point quelle que soit leur position dans l&#39;axe z. L&#39;analyse qualitative et quantitative de ces images en 2D peut être utilisé par la suite pour déterminer la densitéramification dendritique de chaque zone. Enfin, nous présentons une méthode pour générer panoramique images de très haute résolution pour l&#39;analyse et l&#39;évaluation des dendrites dans toute une région d&#39;intérêt. Cette technique peut être déployé pour surmonter le manque d&#39;accès à très haute résolution et les appareils photo numériques coûteux. En utilisant cette méthode, permet de capturer des images en série à différents endroits le long du x et y axes et ensuite automatiquement des points les ensemble en utilisant un logiciel (par exemple, Image Composite Editor). En particulier, ce procédé peut être utilisé pour l&#39;évaluation qualitative et quantitative de l&#39;arborisation dendritique dans un assez large domaine.

<table><tbody><tr><td>Solution de coloration Golgi-cox modifiée&nbsp ;</td><td>Magasin Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>à 4&deg ; C jusqu’à l’utilisation</td></tr><tr><td>1x Solution de développement (Stock 10x)</td><td>Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>magasin à 4&deg ; C jusqu’à ce qu’il utilise</td></tr><tr><td>30 % de saccharose,Sigma</td><td></td> <td>CAS # 57-50-1</td><td>faire frais &nbsp ; en ddH2O</td></tr><tr><td>0,3 % Gélatine</td><td>Sigma</td><td>CAS # 9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>NA Solutions d’éthanol classées (20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 80 %, 90 %, 95 %. 100 %)</td><td>Sigma</td><td>CAS 603-003-00-5</td><td></td></tr><tr><td>NA Xylène</td><td>Sigma</td><td>CAS # 1330-20-7</td><td>NA</td></tr><tr><td>DPX Medium</td><td>EMS&nbsp ;</td><td>#13510</td><td>NA</td></tr><tr><td>Superfrost (+) blanc</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71869-10</td><td>NA</td></tr><tr><td>Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>#4811-703</td><td>NA</td></tr><tr><td>DCX Anticorps</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8066</td><td>4 C</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma</td><td>Numéro CAS 91-95-2 &nbsp ;</td><td>-20</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-tek</td><td>4583</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>Numéro CAS 77-86-1</td><td>Na</td></tr><tr><td>Microscope ABC Lite</td><td>Vector</td><td>PK4000</td><td>NA</td></tr><tr><td>Appareil</td> photo numérique <td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo numérique</td><td>Nikon</td><td>DS-Ri1</td><td></td></tr><tr><td>12 bits&nbsp ;</td><td>QImaging&nbsp ;</td><td>01 MBF2000RF-CLR-12</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida System</td><td>MBF Bioscience</td><td>V.10</td><td></td></tr><tr><td>Image Composite Editor</td><td>Microsoft</td><td>1.4.4.0</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td>F 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Image Pro Plus</td><td>Mediacy</td><td>Versin 7.00</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de l&#39;arborisation dendritique dans le gyrus denté de la région de l&#39;hippocampe chez la souris

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

L’arborisation dendritique s’est avérée être un marqueur fiable pour l’examen de l’intégrité structurelle et fonctionnelle des neurones. En effet, la complexité et l’étendue de l’arborisation dendritique sont bien corrélées avec la plasticité synaptique dans ces cellules. Une méthode fiable d’évaluation de l’arborisation dendritique est nécessaire pour caractériser les effets délétères des troubles neurologiques sur ces structures et pour déterminer les effets des interventions thérapeutiques. Cependant, la quantification de ces structures s’est avérée être une tâche formidable compte tenu de leur nature complexe et dynamique. Heureusement, des techniques d’imagerie sophistiquées peuvent être associées à des méthodes de coloration conventionnelles pour évaluer l’état de l’arborisation dendritique, ce qui fournit un moyen d’évaluation plus fiable et plus rapide. Vous trouverez ci-dessous un exemple de la façon dont ces techniques d’imagerie ont été associées à des méthodes de coloration pour caractériser l’arborisation dendritique chez les souris de type sauvage. Ces méthodes d’imagerie complémentaires peuvent être utilisées pour évaluer qualitativement et quantitativement l’arborisation dendritique qui s’étend sur une zone assez large dans la région de l’hippocampe.

L&#39;étendue de l&#39;arborisation résultant de cellules granulaires du dentate existants et nouveaux-nés a été analysée chez des souris de type sauvage en utilisant soit Golgi-Cox ou DCX coloration (figure 1). Segments de cellules dendritiques DCX-positifs ont été trouvés pour être de 13 à 36 microns de long. La distribution normale de longueur dendritique a été testé en utilisant le test de Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p &lt;0,01, Liliefors p &lt;0,001; les figures 4 et 5)...

Nous décrivons deux méthodes de visualisation et de quantification de l’arborisation dendritique dans l’hippocampe de modèles murins : l’imagerie en temps réel et l’imagerie en profondeur de champ étendue. Alors que la première méthode permet un traçage topographique sophistiqué et une quantification de l’étendue de la ramification, la seconde permet une visualisation rapide de l’arbre dendritique.

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier l'importance de l'arborisation dendritique dans l'hippocampe d'un modèle murin. Cet objectif est atteint par deux méthodes différentes. Dans la première méthode, les dendrites sont tracées manuellement en temps réel sur toute l'épaisseur de chaque section.Après le traçage, l'arbre dendritique entier peut être reconstruit et analysé. L'analyse à l'aide de diagrammes en éventail provenant de différentes souris peut servir de moyen objectif de comparaison. La deuxième méthode consiste à visualiser l'arborisation dendritique par imagerie à profondeur de champ étendue.Enfin, une méthode panoramique est utilisée pour assembler plusieurs images à fort grossissement afin d'obtenir une image composite à haute résolution permettant l'évaluation qualitative et quantitative des dendrites dans toute la région d'intérêt. Cette procédure sera démontrée par GI mobi. AMI recherche flows de mon laboratoire. Le principal avantage de ces techniques par rapport aux méthodes existantes réside dans leur facilité d'utilisation et la rapidité de l'acquisition et de la collecte des données.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurobiologie, comme l'évaluation de l'arborisation dendritique dans les régions cérébrales affectées et l'analyse des effets de différentes thérapies sur les dendrites. Dans cette procédure, un jour après que le cerveau de souris ait été fixé dans du paraformaldéhyde à 4 %, placez-le dans une solution de saccharose pour la déshydratation pendant 48 heures à quatre degrés Celsius. Retirez les cerveaux du saccharose et placez-les directement sur des blocs de cuivre posés sur de la glace sèche.Remplissez le moule avec du OCT et marquez l'orientation du cerveau en utilisant le bulbe olfactif comme repère. Découpez des sections de 70 micromètres d'épaisseur à moins 20 degrés Celsius à l'aide d'un cryostat, puis placez-les dans une solution cryoprotectrice et conservez-les à moins 20 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Incubez les sections dans un mélange d'oxyde d'hydrogène dans du méthanol pendant 30 minutes à température ambiante, puis réchauffez-les à 37 degrés Celsius dans du TBS pendant une demi-heure.Incuber les sections avec du Triton 0,3 % et du sérum de cheval normal pendant 45 minutes à température ambiante avant la coloration avec l'anticorps anti-DCX le jour suivant. Rincer les sections trois fois consécutivement dans le TBS et incuber les sections avec un anticorps secondaire marqué à la biotine de cheval pendant deux heures à température ambiante. Rincer les sections trois fois consécutivement dans le TBS pendant 10 minutes à chaque fois, puis les incuber avec une lumière B, C pendant 1,5 heure.À température ambiante, ajouter le peroxyde d'hydrogène à la solution de DAB et incuber immédiatement les sections dans cette solution pendant cinq minutes, puis arrêter la réaction en les lavant trois fois avec du TBS glacé, suivi d'un seul lavage. Rincer dans du TTBS à température ambiante. Déshydrater les sections à l'aide d'une série de solutions d'éthanol.Cinq minutes chacun, dans du clear et du xylène, puis posez une lame couvre-objet en utilisant du DPX. Une fois que les coupes sont complètement sèches, nettoyez l'excès de DPX sur les surfaces des lames à l’aide d’une lame bien aiguisée et placez-les une par une sur le plateau de balayage du microscope. Le système de visualisation est constitué d’un microscope équipé d’un joystick pour le déplacement du plateau et d’une caméra couleur de 12 bits.Ensuite, démarrez le programme Neuro Lucita et ouvrez un nouveau fichier de données. Placez un point de référence à l'écran en cliquant n'importe où à l'aide du pointeur de la souris afin d'activer toutes les icônes du panneau d'outils de la fenêtre du programme. Cliquez ensuite sur l'icône joystick libre dans la barre d'outils et utilisez le joystick pour localiser le gyrus denté de l'hippocampe.Dans la première section de l'onglet outils de la fenêtre du programme, sélectionnez le gestionnaire de sections séries. Cliquez sur l'icône de nouvelle section située dans le coin inférieur gauche de la fenêtre pour ouvrir la fenêtre de configuration des sections séries. Ensuite, sélectionnez la fenêtre de configuration des sections séries et indiquez le nombre total de sections contenant des régions hippocampiques.Ensuite, sélectionnez l'intervalle d'évaluation et saisissez l'épaisseur de la section. Commencez à tracer la région du gyrus denté en cliquant sur l'icône de dessin de contour libre dans la barre d'outils. Délimitez ensuite la couche des cellules granulaires du gyrus denté.Sélectionnez 100 x dans le menu de grossissement. Ensuite, ajoutez une goutte d’huile à immersion sur la section et passez à l’objectif 100 x. Localisez les corps cellulaires et les dendrites des cellules granulaires du gyrus denté avec cet objectif.Ensuite, concentrez-vous sur un neurone sélectionné et cliquez sur l'icône de traçage du neurone. Sur la barre d'outils, tracez le périmètre du corps cellulaire de la cellule granulaire du gyrus denté. Une fois le tracé terminé, cliquez avec le bouton droit pour sélectionner « terminer le corps cellulaire ».Commencez maintenant à tracer manuellement les dendrites dans les directions X, Y et Z, et suivez chaque branche à l’aide du joystick et du bouton du moteur Z. En un nœud de bifurcation ou de trifurcation, sélectionnez l’option correspondante. À partir du menu déroulant, tracez chacune des branches issues de ces nœuds à l’extrémité de chaque branche. Cliquez avec le bouton droit et sélectionnez « terminaison » dans le menu déroulant.À l'aide des icônes des touches fléchées dans la fenêtre du logiciel, sélectionnez aléatoirement un autre neurone granulaire du gyrus denté et répétez la procédure de traçage comme vient d'être démontré. Enregistrez l'intégralité du tracé.Lancez maintenant Neuro Lucita Explorer pour l'analyse des neurones. Ouvrez le premier fichier de données NRX provenant de la première souris du groupe expérimental. Ajoutez le fichier NRX de la deuxième souris du groupe expérimental et continuez ainsi jusqu'à ce que tous les fichiers NRX de ce groupe soient ajoutés.Sous l'onglet analyse, sélectionnez l'option éventail dans le diagramme pour ouvrir la fenêtre d'analyse en éventail, cochez la case dendrites et cliquez sur afficher pour visualiser les liaisons et les motifs de ramification des dendrites pour ce groupe de souris. Dans cette procédure, reliez le microscope à une caméra numérique. Placez une section sur la platine de balayage connectée au microscope et passez à un objectif 10 x.Ensuite, déplacez la platine vers la zone d'intérêt. Lancez un logiciel d'acquisition vidéo et appuyez sur le bouton d'enregistrement. Dès que le bouton d'enregistrement est enfoncé, utilisez le bouton de réglage grossier de la mise au point pour passer du haut vers le bas de la section pendant une durée totale de quatre secondes. Avant d'enregistrer le fichier vidéo résultant, utilisez maintenant le logiciel gratuit Image J pour convertir les fichiers vidéo au format AVI en un format non compressé.Démarrez un programme d'analyse d'images et ouvrez un fichier VI. Allez dans le menu traitement et cliquez sur la profondeur de champ étendue. Sélectionnez le fichier vidéo correspondant dans les options de sortie.Sélectionnez l'option « générer une image composite au meilleur focus » dans les options d'analyse de mise au point. Sélectionnez les options d'illumination normalisée et de contraste local maximal. Cliquez ensuite sur « créer » pour générer une image résultante, qui représente tous les pixels nets sur l'ensemble de l'axe Z.Ensuite, enregistrez l'image obtenue. À cette étape, placez une section sur la platine de balayage reliée au microscope. Déplacez la platine vers la zone d'intérêt.Ensuite, lancez le programme d'acquisition d'images en utilisant un objectif 10 x, acquérez et enregistrez des images haute résolution de la région d'intérêt, en veillant à obtenir au moins 10 % de recouvrement entre les images. Exécutez ensuite le logiciel de composition d'images pour assembler les images par la suite. Allez dans le menu Fichier et cliquez sur Nouveau panorama.Sélectionnez le dossier dans lequel les images sont stockées. Ensuite, sélectionnez les images appartenant à la même région et appuyez sur OK. Appuyez sur le bouton exporter vers le disque et enregistrez l'image.Cette image représente une photographie de résolution extrêmement élevée de la zone d'intérêt, pouvant être utilisée pour l'analyse. Cette figure montre la visualisation de l'arborisation dendritique avec et sans les méthodes EDFI. La méthode traditionnelle de recherche du plan de mise au point optimal a été comparée à l'EDFI, révélant des valeurs significativement plus élevées de la surface dendritique.Les résultats ont été obtenus à l'aide de la méthode EDFI. La quantification de la longueur et du volume occupés par les dendrites selon différents ordres de ramification est présentée ici. La longueur et le volume maximaux ont été atteints au premier ordre.Voici un histogramme de la longueur dendritique des cellules granulaires du gyrus denté. La majorité des segments dendritiques des DDR marqués par la DCX avaient une longueur comprise entre 13 et 26. Cette ligne pointillée rouge représente la distribution normale des données présentées suite à cette procédure.D'autres méthodes classiques, comme Neuro Lucid, pourraient être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires concernant le volume et la surface occupés par les dendrites. Cette technique que nous vous avons présentée aidera considérablement les chercheurs dans le domaine de la neurobiologie à évaluer non seulement l'organisation des structures neuronales, mais aussi celle de petites structures non neuronales, comme les microglies, dans des sections épaisses de cerveau. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'évaluer l'importance des projections neuronales en un temps relativement court.

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Découvrez deux méthodes d'imagerie pour visualiser et quantifier l'arborisation dendritique dans l'hippocampe de souris : le traçage en temps réel et l'imagerie à profondeur de champ étendue. Ces techniques complémentaires permettent d'analyser la morphologie neuronale avec précision.

Évaluation de l'arborisation dendritique dans le gyrus denté de la région de l'hippocampe chez la souris

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