Name: Génération de la RCA cellules T pour la thérapie adoptive dans le contexte de glioblastome norme de diligence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Découvrez la génération de cellules T CAR anti-EGFRvIII pour le traitement du glioblastome chez la souris. Cette méthode combine radiothérapie cérébrale et temozolomide avec l'immunothérapie adoptive.

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Les auteurs tiennent à remercier la Dre Laura Johnson et le Dr Richard Morgan d’avoir fourni la construction rétrovirale CAR. Les auteurs remercient également Giao Ngyuen pour son aide à la dosimétrie pour l’irradiation du cerveau entier. Ce travail a été soutenu par une subvention NIH NCI 1R01CA177476-01.

Ce protocole est basé sur un modèle expérimental où 10 souris sont traitées avec 10 cellules T 7 CAR chacun. Cela signifie que 10 8 cellules CAR T seront nécessaires; le rendement devrait être surestimée par 5 x 10 -1 7 x 10 8 pour tenir compte de la perte de la viabilité. Le protocole suivant est mis à l&#39;échelle pour générer environ 200 x 10 6 cellules. Les cellules sont ensuite administrées par voie intraveineuse à la femelle C57BL / 6 de souris avec des tumeurs de 9 jours établis syngéniques de EGFRvIII positif intracrâniennes, développé à partir des lignes existantes de cellules de mélanome de KR158B astrocytome ou B16. Concomitamment avec la RCA génération de lymphocytes T, des souris porteuses de tumeurs sont administrés des doses cliniquement pertinentes de lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) et de WBI (16,5 Gy). Les souris ont été maintenus et élevés dans des conditions exemptes d&#39;agents pathogènes à Duke University Medical Center (DUMC). Toutes les expériences animales ont été effectuées selon des protocoles approuvés par la Duke University Institutional protection des animaux et l&#39;utilisation Comité (IACUC). 1. Administration de Témozolomide à des souris porteuses de tumeurs Jours 0 à 4: <ol><li> Calculer le nombre total de souris à injecter et à multiplier par 0,5 pour déterminer le volume de solution TMZ nécessaire (par exemple, 30 souris x 0,5 ml = 15 ml TMZ) et ajouter 1,5 ml à ce volume pour tenir compte des retombées (16,5 ml TMZ ). </li><li> Multipliez ce volume total de 3 mg / ml pour déterminer le poids de lyophilisé TMZ nécessaire (par exemple, 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Peser cela dans un 50 ml conique. ATTENTION: TMZ est toxique par inhalation, ingestion et contact avec les yeux, la peau et les muqueuses. Consultez travail sécurité de l&#39;institution et / ou la santé de l&#39;environnement et le département de bien-être pour les recommandations sur la réduction des risques d&#39;exposition. </li><li> Multipliez le volume total de 0,15 pour déterminer le volume de diméthylsulfoxyde (DMSO) nécessaire (par exemple, 16,5 x0,15 = 2,475 ml de DMSO). Filtre stériliser ce volume de DMSO (plus un supplément de 2 ml pour tenir compte des retombées) à travers un filtre de 0,2 um dans un tube stérile. Ajouter 2,475 ml de DMSO stérile pour la poudre TMZ. </li><li> Placer la solution TMZ / DMSO dans un bécher d&#39;eau sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 10-15 min. Une fois TMZ est entièrement dissous, la solution devrait devenir de couleur jaune pâle; si la solution devient rose, le TMZ est dégradée, et une nouvelle solution devrait être préparée par un nouveau lot de TMZ. </li><li> Calculez le volume approprié de solution saline stérile nécessaire en multipliant par 0,85 le volume total (0,85 x 16,5 ml = 14,025 ml de solution saline). Ajouter 15 ml de solution saline stérile à 50 ml d&#39;une conique. Bien que le TMZ est dissout dans le DMSO, la chaleur du sérum physiologique à 65 ° C. </li><li> Vortexer la solution / DMSO TMZ faire en sorte que la poudre soit complètement dissoute TMZ et ajouter lentement une solution saline chauffée à la solution / DMSO TMZ. </li><li> Immédiatement après la préparation, charger entièrement 15 x 1 ml Seringue tuberculinees avec une solution TMZ pour l&#39;administration à des souris porteuses de tumeurs établies de quatre jours. </li><li> Répétez cette procédure sur les jours 1 à 4 pour un total de cinq administrations TMZ. </li></ol> 2. Cerveau Global irradiation des souris porteuses de tumeurs Jours 2 à 4: <ol><li> Allumez l&#39;irradiateur à rayons X et le laisser se réchauffer-à pleine tension. Assurez-vous que le filtre approprié est en place et entrée la tension appropriée et les paramètres actuels (figure 2A). NOTE: La dosimétrie de l&#39;irradiateur sera établie au préalable pour déterminer les paramètres de tension et la disposition de grille (figure 2A, B) approprié. </li><li> Calculer la longueur de temps qui est nécessaire pour aboutir à 5,5 Gy d&#39;irradiation aux rayons X. Par exemple, si les rayons X sont livrés à un taux de 2 Gy / min, puis 2,75 min est nécessaire pour livrer un total de 5,5 Gy. Saisissez le durée appropriée. NOTE: Le tableau 2 présente la souris WBI doses And leurs équivalents cliniques chez l&#39;homme. Dans le contexte de gliomes de haut grade, 60 Gy fractionnée WBI (deux fractions Gy, 5 jours / semaine pendant 6 semaines) est la norme clinique des soins, et l&#39;équivalent murin utilisé ici est de 16,5 Gy (5,5 Gy x 3). </li><li> Préparer une solution fraîche de la kétamine / xylazine pour l&#39;anesthésie systémique par addition de 2 ml de kétamine et de xylazine 1 ml à 17 ml de sérum physiologique telle que la solution finale est de 10 mg / ml de kétamine et 1 mg / ml de xylazine. </li><li> Peser et administrer des souris 10 ul de la kétamine / xylazine par voie intraperitoneale par gramme de poids corporel, tels que les animaux reçoivent une dose de kétamine à 100 mg / kg et 10 mg / kg de xylazine. Souris devrait être pleinement sous sédation et respiration visiblement moins de 2 minutes de la kétamine administration / xylazine. </li><li> Pour maintenir l&#39;humidité ophtalmique chez les animaux sous sédation, frottez doucement une petite quantité de larmes artificielles onguent sur chaque œil. </li><li> Placer sous sédation souris sur la grille de telle sorte que les têtes sont positionnées dans la zone qui reçoit la plus élevée des rayons X enintensité (figure 2B, C). corps de blindage de la nuque vers le bas avec la taille appropriée tuyau de plomb de bloquer la livraison systémique rayons X (figure 2D). </li><li> Passer souris positionné sous le faisceau de rayons X de telle sorte que le laser désignant le point focal du faisceau de rayons X est à la coordonnée (0,0) sur la configuration de la grille. Commencez livraison X-ray. </li><li> Lorsque la livraison de rayons X est terminée, retirez les animaux de l&#39;irradiateur et les placer sur un coussin chauffant chaud. Ne pas abriter des animaux sous sédation avec des animaux conscients que les animaux ont repris conscience suffisante pour maintenir couchée sternale. Une fois que les animaux peuvent maintenir couchée sternale, placer des animaux conscients de retour dans leurs cages appropriées. </li><li> Répéter ce procédé aux jours 3 et 4 pour un total de trois doses fractionnées de rayonnement. </li></ol> 3. transfection Jour -1: <ol><li> Préparer médias D10 en ajoutant 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS) à 500 ml de M par Dulbeccoodified milieu Eagle (DMEM). </li><li> Préparer T milieux cellulaires (TCM) en ajoutant 5,5 ml de L-glutamine, 5,5 ml de pyruvate de sodium, 5,5 ml d&#39;acides aminés non essentiels, et 5,5 ml de pénicilline / streptomycine (pen / strep) à 500 ml de milieu RPMI-1640. Ensuite, ajouter 550 pi de 2-mercaptoéthanol et 550 ul de gentamicine. Enfin, ajoutez 50 ml de FBS. </li><li> Récolte in vitro des cellules HEK293T cultivés dans et amener à une concentration de 7,5 x 10 6 cellules / ml dans les médias de D10. </li><li> Plaque de support 10 ml de D10 et ajouter 1 ml de suspension de cellules HEK293T dans chacun des 16 x 10 cm de poly-D-lysine (PDL) des plaques revêtues. </li><li> Incuber pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol> Jour 0: <ol start="6"><li> Remplacez le support avec 10 ml D10 frais au moins 30 min avant la transfection de cellules. </li><li> Déterminer la quantité de vecteur plasmidique, PCL-Eco vecteur et réactif de transfection liposomale nécessaire pour la transfection en multipliant le nombre total de plaques + 1 (16 + 1 = 17) de 14,1 ugvecteur plasmidique (14,1 x 17 = 239,7 ug), 9,9 ug PCL-Eco vecteur (9,9 x 17 = 168,3 ug), et 60 pi de réactif de transfection liposomale (60 x 17 = 1020 pi). Tous les réactifs doivent être à température ambiante avant de préparer les solutions. </li><li> Étiqueter deux tubes A et B. Dans le tube A, ajouter 239,7 ug vecteur plasmidique et 168,3 ug PCL-Eco vecteur (1,5 x 17) ML-sérique réduite du milieu de Eagle (RS-MEM) modifié. Dans le tube B, ajouter 1 020 pi de réactif de transfection liposomale à (1,5 x 17) ml RS-MEM. </li><li> Incuber A et B séparément pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Mélanger A et B ensemble doucement (vortex pendant 1-2 sec ou inverser plusieurs fois) et incuber pendant 20 min à température ambiante pour former lipide / le complexe d&#39;ADN. </li><li> Ajouter goutte complexe lipide / ADN sage de cellules HEK293T en boîte de 10 cm. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 6-8 heures ou toute la nuit (ne pas dépasser 24 heures). </li><li> Après 6-8 heures d&#39;incubation, remplacez milieu avec 12 ml de TCM frais pour la production virale. Ce support plaquésera utilisé lors de la Journée 2 comme surnageant viral T transduction cellulaire. </li></ol> 4. La splénectomie et T Préparation des cellules Jour 0: <ol><li> Verser 10 ml de TCM dans un conique de 50 ml et placer sur la glace pour la collecte de la rate. </li><li> Sacrifiez le nombre approprié d&#39;animaux par asphyxie au CO2 et la décapitation secondaire: La place des animaux dans une cage recevoir CO 2 à un débit de 10 à 30% du volume cage / minute, par directives de l&#39;American Veterinary Medical Association (pas plus de cinq animaux peuvent être sacrifiée simultanément) jusqu&#39;à ce que se termine de la respiration et pendant deux minutes par la suite. Retirer les animaux de la chambre de CO 2 et de décapiter. REMARQUE: Une rate d&#39;un vieux 6-12 semaines féminine souris C57BL / 6 donnera environ 4,5 à 5 x 10 7 splénocytes. Ici, quatre rates seront récoltées pour environ 200 x 10 6 cellules. </li><li> Placez la souris de sorte que son côté droit vers le haut, etvaporiser avec 70% d&#39;éthanol. Avec la pince, saisir une mince pli de la peau en dessous de la cage thoracique gauche et couper une légère incision avec des ciseaux. Peler la peau, prenez soin d&#39;une mince repli du péritoine avec une pince, et couper une petite cavité. </li><li> La rate est un petit organe allongé rouge, et sombre qui ressemble à un haricot aplati; délicatement saisir la rate avec la pince et de l&#39;accise en coupant le tissu conjonctif environnant. Placez les rates excisées dans le conique contenant 10 ml de TCM sur la glace. </li><li> Verser rates sur une maille de tamis de 70 pm et ventiler par brassage avec l&#39;extrémité émoussée de l&#39;intérieur d&#39;une seringue de 5 ml pour générer une suspension à cellule unique. Un maximum de deux rates devraient être ventilées par passoire. </li><li> Utilisez un petit volume de TCM à laver soigneusement la crépine suivante désagrégation de recueillir des splénocytes restants. Piscine toute rates ventilées en une suspension à cellule unique. Apportez volume final à 50 ml avec MTC pour un lavage d&#39;uneD tourner à 300 g pendant 10 min. </li><li> Préparer une solution de tampon de lyse par addition de 1 x 5 ml de tampon de lyse 10X et 45 ml d&#39;eau stérile. Pour éliminer les globules rouges, remettre le culot dans 5 ml de 1x tampon de lyse par rate dans un 50 ml conique, bien mélanger en pipetant doucement monter et descendre. Si plus de 5 rates, utiliser un tube de centrifugeuse de 250 ml. Passer conique ou tube de centrifugeuse dans un bain d&#39;eau à 37 ° pendant 5 min. </li><li> Retirer la réaction de lyse à partir du bain d&#39;eau et ajouter TCM à un rapport 1: 1 avec du tampon de lyse pour neutraliser la réaction. Laver par centrifugation à 300 g pendant 10 min. </li><li> Aspirer surnageant et le culot entièrement remettre en suspension dans TCM (2 ml / rate, 8 ml au total pour 4 rates) par aspiration et refoulement. </li><li> Compter les cellules en ajoutant 10 ul de suspension de cellules à 190 pi de bleu trypan (1:20 de dilution). Multiplier le nombre obtenu en l&#39;un des quatre points de grille de carrés de 20 x 10 x 4 volume total (8 ml) pour obtenir le nombre total de cellules (par exemple, des cellules 125 x 20 x 10 4 </sjusqu&#39;à&gt; x 8 ml = 200 x 10 6 splénocytes). </li><li> Diluer les cellules à une concentration de 2 x 10 6 cellules / ml dans du TCM, supplémenté avec 2 pg / ml de concanavaline A (ConA) et 50 UI / ml recombinant interleukine-2 humaine (rhIL-2). Ainsi, pour 200 x 10 6 splénocytes, ajouter 92 ml médias à 8 ml de cellules, 200 ug ConA, et 5000 UI rhIL-2. </li><li> Ajouter 2 ml de cellules dans chaque puits de plaques de culture tissulaire à 24 puits traitées, de telle sorte que 4 x 10 6 cellules sont dans chaque puits (par exemple, 100 ml de cellules, il faudra environ 4 plaques). </li><li> Incuber pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol> 5. transduction Jour 1: <ol><li> Calculer le nombre de culture non-tissu traité plaques à 24 puits nécessaires pour la transduction en multipliant le nombre de rates récoltées par deux (8 plaques sont nécessaires pour quatre rates). </li><li> Ensuite, on calcule le volume requis de fragment de fibronectine humaine recombinante (RHFF) solutionnécessaire pour plaques de revêtement en multipliant (nombre total de puits + 3) x 0,5 ml (8 x 24 puits des plaques = 192 = 195 + 3) x 0,5 ml = 97,5 ml. </li><li> Préparer 97,5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant RHFF à une concentration de 25 ug / ml en multipliant le volume total de 25 ug (97,5 x 25 = 2437,5 pg). Ajouter cette quantité de RHFF à 97,5 ml de PBS. </li><li> Culture non traitée tissu Coat plaques à 24 puits par addition de 0,5 ml de solution PBS / RHFF par puits. </li><li> Incuber pendant une nuit à 4 ° C. </li></ol> Jour 2: <ol start="6"><li> Dump solution PBS / RHFF culture de tissu non traitée plaques à 24 puits. </li><li> Ajouter 1 ml / puits de sérum albumine bovine à 2% (BSA) dans du PBS et incuber à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Retirer BSA par bouleversant fermement plaque. Lavez en ajoutant 2 ml de PBS. </li><li> Recueillir surnageant viral par le transfert de médias de chaque plaque PDL HEK293T dans un tube de 250 ml de centrifugeuse et tourner 10 min à 500 x g. </li><li> Soigneusement transférer su viralepernatant dans un 250 ml nouveau tube de centrifugation, en étant sûr de ne pas perturber le culot cellulaire qui se est formée. </li><li> Ajouter TCM frais au surnageant viral de telle sorte que le volume final est de 3 ml de plus que la quantité nécessaire pour les puits revêtus de RHFF. Par exemple, pour 192 puits revêtues RHFF, porter le volume de surnageant viral pour 192 ml + 3 = 195 ml. </li><li> Retirer splénocytes en culture de l&#39;incubateur et remettre en suspension en pipetant doucement monter et descendre 2-3 fois dans chaque puits. Transférer dans un 250 ml conique. Si vous utilisez une pipette multicanaux, en utilisant un réservoir stérile avant de transférer va aider à accélérer cette étape. Compter comme décrit précédemment et de spin à 300 g pendant 10 min. </li><li> Ajouter rhIL-2 à surnageant viral à une concentration de 50 UI / ml. Par exemple, ajouter 50 x 195 = 9750 UI rhIL-2 à 195 ml de surnageant viral. </li><li> Reprendre splénocytes en surnageant viral à 1 x 10 6 cellules / ml </li><li> Ajouter 1 ml / puits de la suspension de splénocytes RHFF revêtues de plaques à 24 puits. </li><li>Spin pendant 90 min selon les paramètres suivants: 770 x g, l&#39;accélération = 4, freinage / décélération = 0, 32 ° C. </li><li> Préparer une solution de TCM avec 50 UI / ml de rhIL-2. Par exemple, préparer une solution en ajoutant 200 MTC 10000 UI rhIL-2. Ajouter 1 ml de rhIL-2 / TCM de chaque puits après centrifugation. </li><li> Culture pendant une nuit à 37 ° C dans 5% de CO2. </li></ol> 6. RCA cellules T Culture et récolte Jours 3 et 4: <ol><li> Si les cellules T atteindre&gt; 80% de confluence, les cellules peuvent être divisés (cela se produit généralement après 3 jours ou 4 jours). Pour diviser les cellules, pipeter doucement monter et descendre dans chaque puits 2-3 fois, et passer de 1 ml de chaque puits dans de nouveaux puits d&#39;une 24 puits de culture tissulaire nouvelle plaque traitée. Ensuite, ajoutez 1 ml de TCM frais avec 50 UI / ml d&#39;IL-2 à chaque puits de telle sorte que le volume final est de 2 ml dans tous les puits. </li><li> Si les cellules ne parviennent pas à&gt; 80% de confluence, effectuez un changement moitié de médias par pipetage lentement 1 ml de milieu du haut de chaque puits. Évitez disturbing cellules installées sur le fond tout en enlevant les médias. Ajouter 1 ml de TCM frais contenant 50 UI / ml rhIL-2. </li></ol> Jour 5: <ol start="3"><li> Resuspendre les cellules T CAR par pipetage doucement monter et descendre trois fois dans chaque puits et transférer dans un tube de centrifugeuse de 250 ml. Spin cellules à 300 g pendant 10 min. </li><li> Aspirer le surnageant sans déranger culot. Laver une fois avec du PBS, compter les cellules comme décrit précédemment, et laver avec du PBS une seconde fois. Un rendement typique CAR de cellules T est d&#39;environ 1 x 10 6 cellules par puits (8 plaques de cellules x 24 puits = 192 x 10 6 CAR T). </li><li> Resuspendre les cellules dans du PBS à une concentration de 5 x 10 7 / ml pour une injection de 1 x 10 7 dans un volume de 200 pg (par exemple, de 192 x 10 6 cellules CAR T, remettre en suspension lavé le culot dans 3,84 ml de PBS). </li></ol> 7. CAR T administration de cellules à des souris porteuses de tumeurs Jour 5: <ol><li> Transport cellules sur la glace à l&#39;animalerie pour l&#39;injection intraveineuse. Charge 500-1000 ul dans l&#39;insuline seringue avec 27-31 aiguille G, assurant que toutes les bulles sont expulsés. </li><li> Prenez une souris à la base de la queue et placer dans un limiteur de tube. </li><li> Tirez la queue tendue avec la veine vers le haut, et glisser l&#39;aiguille d&#39;environ 1-2 mm sous la peau dans la veine en l&#39;insérant parallèle à la veine de la queue. Lentement expulser 200 pi dans la veine. Si l&#39;aiguille est correctement inséré dans la veine, le volume facilement circuler dans; sinon il y aura résistance et l&#39;aiguille devra être retiré de la queue et ré-inséré correctement. </li></ol>

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<li>Hughes, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+a+TCR+gene+derived+from+a+patient+with+a+marked+antitumor+response+conveys+highly+active+T-cell+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions.</a> Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).</li>
<li>Morgan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+glioma+stem+cells+by+genetically+modified+T+cells+targeting+EGFRvIII+and+development+of+adoptive+cell+therapy+for+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma.</a> Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Le calendrier de traitement décrit ici a été conçu pour modéliser norme clinique de soins et de tirer parti de ses effets pour la RCA thérapie adoptive. T doses CAR cellulaires, schémas TMZ, et l&#39;administration de la radiothérapie peuvent être modifiés pour améliorer l&#39;activité in vivo des cellules T, lymphodepletion, et le meurtre de la tumeur. TMZ schémas peuvent être augmentés pour obtenir myéloablation hôte et une expansion accrue des cellules adoptive transférés 30. En outre, les effets ...

Le glioblastome (GBM) est la tumeur la plus fréquente primaire maligne au cerveau et est toujours mortelle. La résection chirurgicale couplé à la norme non-spécifique de chimiothérapie et la radiothérapie soins ne parvient pas à éliminer complètement les cellules malignes, résultant en un mauvais pronostic de moins de 15 mois chez les patients atteints de cette maladie une. En revanche, l&#39;immunothérapie offre une approche précise pour cibler spécifiquement les cellules tumorales, et a donc le potentiel pour servir de plate-forme de traitement très efficace avec un risque réduit de garantie toxicité 2-4. Des lymphocytes T modifiés ex vivo pour exprimer des récepteurs d&#39;antigènes chimériques (RAC) offrent une stratégie polyvalente pour l&#39;immunothérapie des tumeurs. RAC sont produites par fusion de la région variable d&#39;un anticorps extracellulaire avec une ou plusieurs cellules T molécule intracellulaire (s) de signalisation, au lieu d&#39;une pleine longueur complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH) -restricted récepteur de cellule T 5. Ce mode d&#39;anticorps-antigène comme reconpermet à des cellules T spécifiques de l&#39;antigène de réactifs reconnaissent et répondent aux antigènes de tumeur en l&#39;absence de CMH et peuvent être adaptés pour un répertoire pratiquement infini d&#39;antigène. CAR cellules T modifiées contre une variété d&#39;antigènes tumoraux ont montré l&#39;efficacité préclinique et la promesse exceptionnelle dans la clinique 6-9. Plus précisément, dans le cadre de GBM, une variante CAR T plate-forme de ciblage cellulaire de croissance épidermique du récepteur du facteur III (EGFRvIII), une mutation spécifique de la tumeur exprimé sur la surface de la cellule 10, a été représenté à prolonger la survie chez les souris de gliome portant 11. Malgré leur polyvalence, cependant, le bénéfice clinique de la RCA thérapie adoptive n&#39;a pas été pleinement réalisé, en partie grâce à une immunosuppression associé à une tumeur et l&#39;évasion immunitaire 12-16 ainsi que les défis dans l&#39;établissement et le maintien des cellules T spécifiques de l&#39;antigène in vivo. Se appuyant sur la norme de diligence (SOC) avec une immunothérapie peut potentiellement surmonter plusieurs de ces limitations, résultant en une efficacité accrue à la fois dans la mise en préclinique et clinique. SOC pour la post-résection GBM se compose de témozolomide à haute dose (TMZ), un agent alkylant d&#39;ADN 17, et l&#39;irradiation du cerveau entier (WBI) 1. Ces traitements sont présumés en synergie avec les vaccins tumorales via la régulation positive de la tumeur expression du CMH 18-20 et l&#39;effusion d&#39;antigènes par les cellules tumorales mortes 17,19,21,22. En effet, l&#39;addition de TMZ 20,23 ou 18,24 WBI conduit à une amélioration efficacité antitumorale de traitements immunitaires dans la mise en préclinique. En outre, comme de nombreux agents chimiothérapeutiques cytotoxiques non-spécifiques, TMZ est connu pour causer de 25,26 lymphopénie systémique, qui peut être mis à profit comme un moyen de l&#39;hôte conditionné pour les plateformes de thérapie adoptifs 27-29. Lymphodepletion TMZ médiée a été montré pour améliorer la fréquence et la fonction des cellules T spécifiques de l&#39;antigène, ce qui augmente l&#39;efficacité d&#39;un &#39;adoptiontive plate-forme de traitement contre les tumeurs intracrâniennes 30. Dans le cadre de la thérapie de voitures, lymphodepletion sert de moyen de conditionnement d&#39;hôte à la fois par la réduction du nombre de lymphocytes T suppresseurs endogène 31 et induire la prolifération homéostatique réduite 32 par compétition pour des cytokines 33, améliorant ainsi l&#39;activité antitumorale 11,34. Étant donné la relation synergique entre GBM SOC et d&#39;immunothérapie plates-formes, l&#39;évaluation de nouvelles thérapies adoptifs et les plates-formes de vaccins dans le cadre du SOC est essentiel pour tirer des conclusions significatives concernant l&#39;efficacité. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour la production et l&#39;administration intraveineuse de cellules T spécifiques CAR-EGFRvIII murins aux côtés de TMZ et le WBI chez les souris portant des tumeurs intracrâniennes EGFRvIII-positifs (voir la figure 1 pour le traitement timeline). Brièvement, les cellules T sont versées CAR ex vivo par transduction rétrovirale. Rein embryonnaire humain (HEK) 293T cellules sont transfectées en utilisant un complexe ADN / lipide (contenant le vecteur de la RCA et plasmides PCL-Eco) pour produire un virus, qui est ensuite utilisé pour la transduction de splénocytes murins activés qui sont récoltées et cultivées en parallèle. Au cours de la génération de la RCA, les hôtes murins portant des tumeurs intracrâniennes EGFRvIII-positifs sont administrés fractionné l&#39;ensemble du cerveau irradiation aux rayons X et le traitement systémique TMZ à des doses comparables à SOC clinique. cellules T CAR sont ensuite livrés par voie intraveineuse à des hôtes lymphodepleted. La procédure suivante est décrite dans sept phases distinctes: (1) L&#39;administration de témozolomide à la tumeur portant souris, (2) Le total irradiation de cerveau de souris porteuses de tumeurs, (3) la transfection, (4) La splénectomie et cellules T Préparation, (5 ) transduction, (6) Culture CAR des lymphocytes T et la récolte, et (7) l&#39;administration de cellules T CAR à des souris porteuses de tumeurs. Ces phases se composent de plusieurs étapes qui se étendent sur 6-7 jours et sont exécutés simultanément.

<table><tbody><tr><td>Vecteur d’emballage du rétrovirus pCL-Eco</td><td>Imgenex</td><td>10045P</td><td>Vecteur auxiliaire pour la génération du rétrovirus CAR</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2010</td><td>Mitogène non spécifique pour induire la prolifération des lymphocytes T et la transduction virale</td></tr><tr><td>Rétronectine</td><td>ClonTech/Takara</td><td>T100B</td><td>Facilite la transduction rétrovirale des lymphocytes T</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>DMEM, hyperglycémie, pyruvate</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td>Milieux de culture HEK293</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Milieux de culture de cellules T</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Life technologies</td><td>11058-021</td><td>Milieux de transfection</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td>Supplément de milieux de culture de cellules T</td></tr><tr><td>100 mM Pyruvate de sodium</td><td>Life technologies</td><td>11360-070</td><td>Supplément de milieux de culture de cellules T</td></tr><tr><td>100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Life technologies</td><td>11140-050</td><td>Supplément de milieux de culture de cellules T</td></tr><tr><td>55 mM 2-Mercaptoethanol</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td>Agent réducteur pour éliminer les radicaux libres</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td>Supplément de milieux de culture de cellules T</td></tr><tr><td>Gentamicine (50 mg/ml)</td><td>Life technologies</td><td>15750-060</td><td>Supplément de milieux de culture de cellules T</td></tr><tr><td>GemCell U.S. Origin Fetal Bovin Serum</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-500</td><td>Fournit des facteurs de croissance et des nutriments pour la croissance cellulaire in vitro</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA), Fraction V&ndash ; Produits</td><td>Gemini Bio</td> de qualité standard <td>700-100P</td><td>Bloque la liaison non spécifique du rétrovirus aux plaques recouvertes de rétronectine</td></tr><tr><td>Pharm Lyse (concentré 10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>Lyses les globules rouges pendant le traitement des splénocytes</td></tr><tr><td>70 &mu ; m Passoires à cellules stériles</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Filtre les grosses particules de tissus pendant le traitement des splénocytes Boîtes</td></tr><tr><td>de culture BioCoat 100 mm avec Poly-D-Lysine</td><td>Corning</td><td>356469</td><td>Favorise l’adhésion cellulaire HEK293 pour maximiser la prolifération après transfection</td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>Témozolomide</td><td>Best Pharmatech</td><td>N/A</td><td>Poudre lyophilisée préparée le jour de l’administration</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D2650</td><td>Nécessaire à la dissolution complète du témozolomide</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Hospira</td><td>IM 0132 (5/04)</td><td>Solvant pour témozolomide et kétamine/xylazine</td></tr><tr><td>Ketathesia HCl</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>11695-0701-1</td><td>Solution de kétamine</td></tr><tr><td>AnaSed</td><td>Lloyd Inc</td><td>N/A</td><td>Xylazine solution stérile 100 mg/ml</td></tr></tbody></table>

génération de la rca cellules t pour la thérapie adoptive dans le contexte de glioblastome norme de diligence

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

L’immunothérapie adoptive par lymphocytes T offre une stratégie prometteuse pour cibler et éliminer spécifiquement les gliomes malins. Les lymphocytes T peuvent être modifiés ex vivo pour exprimer des récepteurs antigéniques chimériques spécifiques des antigènes du gliome (cellules CAR-T). L’expansion et la fonction des cellules CAR-T transférées par l’adoption peuvent être potentialisées par les effets lymphodéplétifs et tumoricides de la chimiothérapie et de la radiothérapie standard. Nous décrivons une méthode de génération de cellules CAR-T ciblant EGFRvIII, un antigène spécifique du gliome, et évaluons leur efficacité lorsqu’elles sont combinées à un modèle murin de glioblastome standard de soins. Les lymphocytes T sont modifiés par transduction avec un vecteur rétroviral contenant le gène CAR anti-EGFRvIII. Les animaux porteurs de tumeurs sont soumis à un conditionnement de l’hôte par une série de témozolomide et d’irradiation du cerveau entier à des schémas posologiques conçus pour modéliser la norme clinique de soins. Les cellules CAR-T sont ensuite administrées par voie intraveineuse aux hôtes amorcés. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer l’efficacité antitumorale des cellules CAR-T dans le contexte des soins standard.

cellules T CAR sont générés par transduction avec le vecteur rétroviral EGFRvIII CAR 11. Ce vecteur, MSGV1, a été développé à partir du vecteur SFGtcLuc_ITE4 35, qui contient le virus de cellules souches murines (MSCV) longs Les répétitions terminales, la région de gag et enveloppe site d&#39;épissage prolongée (donneur d&#39;épissage, sd, et accepteur d&#39;épissage, SA), et virale signal d&#39;emballage (ψ). Le CAR EGFRvIII contenant la chaîne unique fragment humaine anti-EGFRvIII variable (scFv)...

Les effets lymphodéplétifs et immunomodulateurs de la chimiothérapie et de la radiothérapie standard peuvent être exploités pour améliorer l’efficacité antitumorale de l’immunothérapie par lymphocytes T. Nous décrivons une méthode pour générer des lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) spécifiques de l’EGFRvIII et les administrer dans le contexte de la norme de soins du glioblastome.

Génération de la RCA cellules T pour la thérapie adoptive dans le contexte de glioblastome norme de diligence

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des lymphocytes T murins modifiés génétiquement exprimant un récepteur d'antigène chimérique et d'évaluer leur efficacité dans le cadre du traitement de référence. Pour le gliome de haut grade, cela est réalisé en commençant d'abord par le traitement de référence, comprenant une irradiation cérébrale totale et l'administration de témozolomide chez la souris. Ensuite, un rétrovirus exprimant le vecteur car est produit, puis les lymphocytes T murins sont transduits avec le rétrovirus car.Enfin, les cellules T CAR sont administrées à des souris traitées selon les soins standards, aboutissant à une administration combinée de cellules T CAR avec une irradiation cérébrale totale et du témozolomide. Ce protocole est utilisé pour évaluer si la préparation de l'hôte par les soins standards améliore l'efficacité d'une plateforme de lymphocytes T adoptifs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunothérapie des tumeurs cérébrales, telles que l'efficacité anti-tumorale de nouvelles immunothérapies dans le contexte des soins standards pour les gliomes de haut grade.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'efficacité des cellules T et des mi modifiées au niveau génique contre les gliomes de haut grade, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme l'évaluation de la thérapie par cellules T contre les modèles de tumeurs métastatiques de mélanome, de poumon et d'autres tumeurs cérébrales. De manière générale, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car cette procédure exige que plusieurs étapes soient réalisées en parallèle.La planification et l'organisation des tâches sont donc essentielles. La procédure sera démontrée par Catherine Uni et Carter s Deva, deux étudiants diplômés talentueux de mon laboratoire. Après avoir préparé trois milligrammes par millilitre de témozolomide ou TMZ dans du DMSO, placez la solution dans un bécher d'eau sur une plaque chauffante à 65 degrés Celsius pendant 10 à 15 minutes.Une fois que le TMZ est complètement dissous, la solution doit devenir de couleur jaune pâle. Remplir entièrement 15 seringues d'un millilitre avec la solution de TMZ. Le TMZ doit être administré dans les 90 minutes suivant sa préparation afin de s'assurer qu'aucun précipité de TMZ ne se forme en dehors de la solution ; allumer l'appareil d'irradiation aux rayons X pour effectuer une irradiation cérébrale totale et le laisser chauffer, s'assurer que le filtre approprié est en place et régler correctement la tension et le courant.Une fois que les souris ont été sédatées, conformément au protocole décrit, placer les souris sédatées sur la grille avec la tête positionnée dans la zone recevant l'intensité maximale de rayons X. Utiliser un tube en plomb pour protéger le corps à partir du cou afin de bloquer l'irradiation systémique par les rayons X. Placer les souris à l'intérieur de l'appareil à rayons X une fois l'irradiation terminée.Retirer les animaux de l'irradiateur. Lorsque les animaux reprennent suffisamment conscience et maintiennent une position sterno-abdominale, les replacer dans leurs cages appropriées. Après avoir préparé le milieu D 10 et récolté les cellules HEC 2 93 T selon le protocole décrit dans le texte, ajouter un millilitre de suspension cellulaire à 7,5 × 10⁶ cellules par millilitre dans chacune des plaques de 10 centimètres revêtues de poly-L-lysine et contenant 10 millilitres de milieu D 10, puis incuber toute la nuit. Le jour suivant.Et après avoir préparé le plasmide de voiture et le réactif de transfection comme décrit dans le protocole écrit, ajouter goutte à goutte le complexe lipide-ADN aux cellules T HEC 293 et incuber pendant six à huit heures. Remplacer ensuite le milieu par 12 millilitres de milieu frais pour cellules T ou TCM. Ensuite, verser une rate sur un tamis à cellules de 70 micromètres et dissocier à l’aide de l’extrémité émoussée de l’intérieur d’une seringue de cinq millilitres afin d’obtenir une suspension monocellulaire.Après avoir préparé un nouveau pool de milieu de culture TCM, transférez la rate dissociée dans un tube conique de 50 millilitres contenant du milieu TCM et centrifugez pour obtenir un culot. Éliminez les globules rouges en utilisant cinq millilitres de tampon de lyse 1 x par rate afin de resuspendre les cellules, en mélangeant soigneusement par pipetage doux de haut en bas. Incubez la suspension cellulaire dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez la réaction de lyse du bain-marie, puis ajoutez du milieu TCM selon un rapport un pour un par rapport au tampon de lyse afin de neutraliser la réaction. Lavez les cellules par centrifugation à 300 Gs pendant 10 minutes.Après avoir aspiré le surnageant, utilisez deux millilitres par rate de TCM pour resuspendre le culot. Pour compter les cellules, ajoutez 10 microlitres de suspension cellulaire à 190 microlitres de bleu de trypan. Une fois le nombre total de cellules calculé, utilisez du TCM supplémenté avec deux microgrammes par millilitre de concanavaline A et 50 unités internationales par millilitre d'interleukine-2 humaine recombinante pour diluer les cellules à une concentration de deux fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. Ajoutez deux millilitres, soit quatre fois 10 à la puissance six cellules, dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire traitée de 24 puits et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone le jour suivant la splénectomie.Préparer du PBS contenant 25 microgrammes par millilitre de fragment de fibronectine humaine recombinante ou RHFF, et recouvrir des plaques de 24 puits non traitées pour culture cellulaire en ajoutant 0,5 millilitre de la solution dans chaque puits le jour suivant. Retirer la solution des puits et ajouter un millilitre par puits de BSA à 2 % dans du PBS ; incuber à température ambiante pendant 30 minutes.Ensuite, retirez l'albumine bovine en retournant fermement la plaque avant d'ajouter deux millilitres de PBS pour laver. Après avoir collecté le surnageant viral à partir des cellules HEC 2 93 T, ajoutez du milieu de culture TCM frais à un volume final en millilitres égal au nombre de puits recouverts de RHFF, plus trois millilitres supplémentaires. Retirez les splénocytes en culture de l'incubateur et resuspendez-les en pipetant doucement deux à trois fois vers le haut et vers le bas dans chaque puits.Transférez les suspensions cellulaires dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, resuspendez les cytes dans le surnageant viral à une concentration de 1 × 10⁶ cellules par millilitre. Puis ajoutez un millilitre par puits de la suspension cellulaire dans les puits des plaques revêtues de RHFF.Faites maintenant centrifuger les plaques pendant 90 minutes à 32 degrés Celsius et 770 GS avec une accélération de quatre et un freinage réglé à zéro pendant la centrifugation. Préparez 50 unités internationales par millilitre d'IL-2 humaine recombinante dans du TCM. Après la centrifugation, ajoutez un millilitre de milieu dans chaque puits des plaques et incubez toute la nuit.Si les cellules T atteignent une confluence supérieure à 80 %, divisez les cellules en pipetant doucement de haut en bas deux à trois fois dans chaque puits. Ensuite, transférez un millilitre de chaque puits dans de nouveaux puits d'une plaque fraîche de culture tissulaire de 24 puits. Ajoutez un millilitre de TCM frais contenant 50 unités internationales par millilitre d'IL-2 à chaque puits ; si les cellules n'atteignent pas une confluence supérieure à 80 %, changez la moitié du milieu en pipetant lentement un millilitre de milieu depuis le haut de chaque puits et en le remplaçant par un millilitre de TCM frais contenant 50 unités internationales par millilitre d'IL-2 humaine recombinante. Resuspendez les cellules T à récepteur chimérique de l'antigène (CAR T) en pipetant doucement de haut en bas trois fois dans chaque puits, puis transférez-les dans un tube de centrifugeuse de 250 millilitres.Faire centrifuger les cellules à 300 ×g pendant 10 minutes. Ensuite, aspirer complètement le surnageant sans perturber le culot. Utiliser du PBS pour laver les cellules, puis les compter avant de procéder à un deuxième lavage.Un rendement typique de cellules CAR T est d'environ une fois dix puissance six cellules par puits avec du PBS Resus. Suspendre les cellules à une concentration de cinq fois dix puissance sept par millilitre pour une injection d'une fois dix puissance sept dans un volume de 200 microlitres. Pour injecter chez des souris porteuses de tumeur, utiliser une aiguille de calibre 27 à 31 afin de charger 500 à 1000 microlitres dans une seringue à insuline, en veillant à expulser toutes les bulles d'air. Les cellules CAR T ont été générées par transduction avec le vecteur rétroviral CAR E GFR V trois, qui contient les répétitions terminales longues du virus de la leucémie murine ou du virus de la leucémie myéloïde de souris (MSCV).La région gag étendue, le site d'épissage de l'enveloppe et un signal d'encapsidation viral. Le construct EG FFR V trois car contenant le fragment variable monocaténaire humain anti-EEG FRV trois 1 39 a été cloné dans le vecteur rétroviral en tandem avec les régions intracellulaires du CD huit murin, du tm CD 28, du 4 1 BBB et de la zêta du CD trois. Après transduction, les cellules T CAR EG FFR V trois peuvent être quantifiées et phénotypées par cytométrie en flux à l’aide d’un panneau bichromatique composé d’un multimère dérivé d’EG FFR V trois, conjugué à la biorétine et biotinylé, et d’un anti-CD trois marqué FITC. En utilisant le protocole décrit dans cette vidéo, l’expression du CAR est habituellement observée chez 55 à 70 % des cellules T murines positives pour le CD trois.Les cellules T à CAR peuvent être davantage phénotypées par l'ajout d'autres anticorps marqués par un fluorochrome au panneau CAR en deux couleurs, comme illustré dans cet exemple. La coloration pour CD8 et CD4 montre que 70 % des cellules CAR transduites sont des lymphocytes T positifs pour CD8, tandis que 20 % sont des lymphocytes T positifs pour CD4. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 12 heures réparties sur une période d'une semaine, à condition d'être effectuée correctement selon cette procédure. D'autres méthodes, telles que le ELISA, le test ELISpot et/ou la coloration intracellulaire des cytokines, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires.Par exemple, vos cellules T transduites par un récepteur d'antigène chimérique répondent-elles fonctionnellement à la reconnaissance de l'antigène, et cette fonctionnalité est-elle spécifique à l'antigène ? N'oubliez pas que manipuler des rétrovirus, du témozolomide et des rayonnements X peut présenter des risques extrêmement élevés, et que des précautions telles que le travail en condition BSL. Deux, le port d'équipements de protection individuelle, la réalisation des expériences dans des zones désignées et la formation adéquate à la manipulation des animaux sont indispensables.Et l'utilisation d'équipements aux rayons X doit toujours être prise en compte lors de l'exécution de ces procédures.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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