Différenciation d'un Neural Stem Cell humaine ligne sur Trois Cultures dimensionnelles, les gènes Analyse des microARN et Putative cibles

L’objectif général de l’expérience suivante est d’évaluer la différenciation des micro-ARN, le profilage et la validation de la cible Mr.NA d’une lignée de cellules souches neurales humaines. Ceci est accompli en cultivant d’abord des cellules souches neurales humaines sur un système de culture tridimensionnel pour induire la différenciation cellulaire. La deuxième étape consiste à quantifier la différenciation en mesurant la croissance du processus axonal.

Ensuite, les changements dans l’expression des micro-ARN sont évalués par une puce micro R-N-A-P-C-R. L’analyse computationnelle de microARN exprimés différentiellement sélectionnés est ensuite effectuée pour identifier un ensemble d’ARNm cibles présumés. En fin de compte, les ARNm cibles sont validés par plasmide rapporteur, transfection et double test de luciférase.

Ainsi, la méthode qui est présentée ici peut aider à répondre à des problèmes clés dans le domaine des cellules souches neurales, telles que la caractérisation des microARN exprimés, et ils ciblent les ARN messagers dans les cellules souches neurales humaines lorsqu’elles sont en cours de différenciation. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la biologie des cellules souches neurales. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes de cellules souches tels que les cellules souches mésenchymateuses, les cellules souches pluripotentes induites ou d’autres systèmes nécessitant l’induction de la différenciation et de la caractérisation moléculaire.

La démonstration visuelle de cette méthode décompose les étapes critiques de la différenciation d’une lignée de cellules souches neurologiques humaines et l’étude du profilage des microARN et la validation de l’ARNm cible, démontrant qu’une partie de la procédure sera lavania, un scientifique de mon laboratoire. Toute cette procédure doit être effectuée dans une enceinte de sécurité biologique à l’aide de techniques aseptiques. Réhydratez les échafaudages en ajoutant à chaque puits de l’AL VX 12.

Plaque de puits deux millilitres d’éthanol à 70 % préparés avec de l’eau pour l’irrigation. Évitez de toucher les échafaudages en distribuant l’éthanol à 70 % le long de la paroi de chacun. Bien aspirez soigneusement l’éthanol à 70 % et lavez immédiatement les échafaudages avec deux millilitres par puits de D-M-E-M-F 12 pendant une minute.

Répétez deux fois la procédure de lavage, aspirez soigneusement le D-M-E-M-F 12 après le lavage final. Enduisez les échafaudages en ajoutant deux millilitres de laminine en D-M-E-M-F 12 à chacun. Bien incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins deux heures.

Ensuite, lavez la plaque avec des graines chaudes D-M-E-M-F 12 chaque échafaudage avec environ 500 000 cellules souches neurales humaines ou H nscs dans un volume de 150 microlitres de milieu RMM avec des facteurs de croissance. Incuber la plaque pendant trois heures pour permettre aux cellules de s’installer dans les échafaudages après trois heures. Ajouter 3,5 millilitres de RMM dans chaque puits en prenant soin de ne pas déloger les cellules des échafaudages.

Incuber l’assiette pendant sept ou 21 jours. Remplacez le milieu RMM après un jour, qui est la première alimentation, et remplacez à nouveau le milieu deux à trois jours après la première alimentation. Sept et 21 jours après la culture 3D des Hnscs.

Retirer le milieu RMM et fixer les cellules différenciées avec 4 % d’aldéhyde paraforme. Les cellules fixées sont ensuite colorées à l’aide d’un anticorps primaire bêta-tubuline à trois cristaux détecté par un fluorochrome conjugué. Les noyaux cellulaires secondaires des anticorps sont contre-colorés par des crochets.

Capturez des images représentatives des cellules colorées à la bêta-trois tubuline. À l’aide d’un microscope fluorescent, enregistrez les images au format TIFF ou JPEG. La mesure de la croissance du processus axonal est réalisée à l’aide de l’outil de mesure logiciel image PRO plus sept.

Pour commencer à ouvrir l’image, sélectionnez l’option de mesure dans la barre d’outils et sélectionnez la fonction de trace. Pour démarrer la trace, sélectionnez le point de départ sur l’excroissance de l’axone en cliquant sur le bouton de la souris tracer sur toute la longueur de l’excroissance de l’axone, cliquez avec le bouton droit de la souris pour terminer chaque trace. De cette manière, mesurez toutes les excroissances axonales dans le champ de vision exprimez les mesures en pixels ou en micromètres.

Exportez les mesures de longueur vers un tableur pour l’analyse comparative et statistique des échantillons afin d’évaluer les changements dans l’expression des micro-ARN des CSH cultivées en trois dimensions. Effectuez d’abord l’extraction des micro-ARN et la préparation des micro-ARN CD comme décrit dans le protocole d’accompagnement. Texte immédiatement après l’obtention du micro-ARN CD NA.

Préparez le mélange de composants de la PCR pour la PCR en temps réel dans un tube de 15 millilitres. Ajoutez 1375 microlitres d’un mélange maître vert deux X-S-Y-B-R. 100 microlitres de micro RNA CD NA 275 microlitres de l’amorce universelle et 1000 microlitres d’ARN transfert d’eau libre.

Les composants PCR se mélangent à un réservoir de chargement PCR. Retirez avec précaution la matrice PCR à plaque de 96 puits de son sac scellé. À l’aide d’un pipeteur multicanaux, ajoutez 25 microlitres de composants PCR.

Mélanger à chaque puits de la matrice PCR. Changez les pointes de pipette après chaque étape de pipetage pour éviter la contamination croisée entre les joints des puits. La plaque à 96 puits avec film adhésif optique et centrifuge pendant une minute à 1000 GS à température ambiante pour éliminer les bulles, inspecte visuellement la plaque pour s’assurer qu’aucune bulle n’est présente à la place des puits.

Le réseau de PCR à plaque de 96 puits dans le programme de cyclage en temps réel. Le cycleur en temps réel en conséquence. Par la suite, exportez les valeurs CT de tous les puits vers une feuille de calcul Excel vierge pour l’analyse des données de réseau PCR, un algorithme disponible en ligne. Le PIC ktar est utilisé pour l’identification des cibles de micro-ARN prédites.

Cliquez sur, cliquez ici pour la prédiction pic ktar sur les vertébrés pour ouvrir une nouvelle page dans l’interface web de PIC KTAR. Choisissez l’espèce dans le menu déroulant et insérez le microARN d’intérêt dans la case d’identification du microARN. Cliquez sur Rechercher les cibles d’un micro-ARN.

Une liste d’ARNm cibles classés par un score PIC KTAR sera présentée. Les classements obtenus sont ensuite utilisés pour établir un tableau comparatif des microARN. Un plasmide rapporteur double de luciférase est utilisé comme outil pour valider les ARNm cibles : les activités de la luciférase fulgole et rénale sont mesurées 24 heures après la transfection des cellules hela.

Préparez la première solution de travail en ajoutant 50 microlitres de substrat, un dans 10 millilitres de la première solution et en mélangeant soigneusement, retirez le milieu de croissance cellulaire de chaque puits de la plaque à 24 puits et ajoutez 300 microlitres de solution de travail à chacun. Transfert de puits 100 microlitres du contenu de chaque puits. De la plaque de 24 puits à trois puits d’une plaque de 96 puits, attendez 10 minutes, puis mesurez l’activité de la luciférase dans un luminomètre réglé pour l’acquisition de la luminescence.

Préparez la solution de travail deux en ajoutant 50 microlitres de substrat, deux à 10 millilitres de solution deux et en mélangeant soigneusement. Ajoutez 100 microlitres de solution de travail, deux dans chaque puits de la plaque de 96 puits contenant déjà 100 microlitres de solution de travail. Attendez 10 minutes, puis mesurez l’activité rénale de la luciférase.

Par la suite, le rapport de luminescence de la luciférase de la luciférase à la luciférase rénale est calculé. Des microphotographies représentatives de H NSCS sur des échafaudages 3D ont été acquises à la suite d’une coloration immunochimique de la tubuline bêta-trois montrée en vert et d’une contre-coloration des noyaux avec des crochets montrée en bleu, la mesure des processus axonaux a été réalisée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Une comparaison de la croissance du processus axonal entre les Hnsc cultivés avec des échafaudages 3D et avec des cultures traditionnelles à surface plane ou 2D montre qu’à une semaine ou trois semaines, les CSH différenciées en 3D présentaient une plus grande croissance du processus axonal.

L’analyse informatique pour la prédiction de la cible a abouti aux informations présentées ici : une liste de microARN, des gènes cibles prédits, un score de précision et des valeurs agrégées. SOX cinq et NR quatre A trois ont été identifiés comme des gènes cibles présumés. Un test à double rapporteur de luciférase a été utilisé pour valider les cibles des microARN, comme indiqué ici.

L’activité relative de la luciférase à partir des trois principaux rapporteurs UTR humains des gènes SOX cinq et NR quatre A trois a été significativement réduite en présence des microARN indiqués. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de le différencier dans les cellules souches neurales et d’étudier l’expression des micro-ARN et la validation de la cible Messenger.RNA.