Name: La En Ovo Chick chorioallantoïque membrane (CAM) Assay comme un modèle de xénogreffe efficace de carcinome hépatocellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Découvrez le modèle de xénogreffe CAM pour étudier le carcinome hépatocellulaire. Cette méthode permet de cultiver des tumeurs vascularisées tridimensionnelles avec des taux de survie embryonnaire atteignant 93%.

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A.S. a été partiellement soutenu par des subventions du National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) et du National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1). 
L’Institut médical Howard Hughes a financé M.L. par le biais du programme de bourses de recherche médicale HHMI.

1. incubation des oeufs <ol><li> Obtenir 8 jours anciens oeufs spécifiques exempts d&#39;agents pathogènes embryonnés. </li><li> Placez les oeufs dans la rotation plateau d&#39;oeufs, estampillés extrémités tournées vers le haut, et placez le plateau tournant à l&#39;intérieur d&#39;un incubateur d&#39;œufs. Incuber les oeufs pendant 48 heures à 36 ° C et 50% d&#39;humidité. </li></ol> 2. La chute du CAM et ouverture de l&#39;Eggs <ol><li> Ramassez des oeufs de l&#39;incubateur. Placez les oeufs dans casier à œufs, estampillés vers le haut, et porter à hotte à flux laminaire. </li><li> Éteignez les lumières chambre et de capot. </li><li> Maintenez la fin estampillée de œuf légèrement à l&#39;candler d&#39;oeuf pour exposer le système vasculaire de la CAM ainsi que le sac d&#39;air. NOTE: Le candler d&#39;œuf est une source de lumière utilisée pour visualiser l&#39;embryon et le sac d&#39;air associé et le système vasculaire. </li><li> Placez une marque de crayon entre deux principaux vaisseaux sanguins. </li><li> Allumez les lumières et utiliser une punaise stérile de faire un trou à la pointe de l&#39;oeuf au-dessus du sac d&#39;air (fin estampillée) et un trou au PENCIL marque. Ne poussez pas la tige de poussée tout au long; un trou d&#39;environ 3 mm de profondeur suffira habituellement. </li><li> Éteindre les lumières. Appuyez sur la poire de sécurité, en appuyant sur l&#39;extrémité ouverte fermement contre le trou au-dessus du sac d&#39;air. Appliquer aspiration pour aspirer l&#39;air dans le trou à la marque de crayon, provoquant la CAM pour tomber loin de la coque au niveau de la marque de crayon. </li><li> Vérifiez que le sac d&#39;air est passé de la fin estampillé de l&#39;œuf dans le trou de crayon marquée en utilisant la Candler. Si elle n&#39;a pas, utilisez la tige de poussée pour faire deux trous légèrement plus profonde et puis re-appliquer une aspiration à l&#39;aide de l&#39;ampoule de sécurité. </li><li> Allume la lumière. Tenir l&#39;œuf dans une main, activez l&#39;outil rotatif Dremel avec une roue de coupure 15/16 pouces joint et faire deux coupes transversales juste assez profonde pour couper à travers la coque, mais pas assez profonde pour couper tout le chemin jusqu&#39;à la dépression CAM. Faire des coupes autour de 2 cm de longueur et 1 cm de distance les uns des autres. Faire des coupes assez large pour que un anneau de silicone de 1 cm de diamètre peut passer à traversmais plus mince que la largeur du ruban adhésif standard. </li><li> Ensuite, faire une entaille longitudinale et entre les extrémités des deux coupes transversales en effleurant la roue de coupure à la coque. </li><li> Faites glisser des pinces stériles sous la pièce de coque et parallèle à la coque. Prenez la pièce de coque avec la pince et enlever toute la pièce proprement. </li><li> Placez du scotch sur la nouvelle fenêtre ouverte, en veillant à plier une extrémité sur elle-même pour faciliter l&#39;enlèvement. </li><li> Placez les oeufs dans l&#39;incubateur de retour dans le plateau d&#39;oeufs (pas dans les racks d&#39;œufs en rotation) jusqu&#39;à ce moment de l&#39;inoculation. </li></ol> 3. Ensemencement <ol><li> Gardez mélange de protéines de la membrane basale, comme matrigel, sur de la glace (pour éviter la polymérisation) et placer dans la hotte. </li><li> Utilisez 2 mM EDTA pour détacher les cellules (4 - 5 ml par flacon T75) et placez flacons dans le tissu incubateur de culture pendant 5 min. </li><li> Remettre les cellules individuelles dans les médias et à compter en utilisant un hémocytomètre et bleu trypan. Utilisez entre 500.000 to 2.000.000 cellules pour greffage sur la came, en fonction de la lignée cellulaire. Optimiser le nombre approprié dans des expériences préliminaires. </li><li> Mesurer le volume nécessaire pour le numéro de cellulaire appropriée, et centrifuger à 500 g pendant 5 min. </li><li> Rejeter le surnageant et remettre en suspension puis culot cellulaire dans 40 μ l de PBS ++ et 20 μ l de mélange de la membrane basale. NOTE: A ce stade, les cellules peut être traitée avec des médicaments ou d&#39;autres agents de test que nécessaire pour les expériences en remettant en suspension dans la cellule / sous-sol mélange membrane suspension. Alternativement, les agents peuvent être à la pipette sur la cellule / sous-sol mélange membrane suspension après la greffe. </li><li> Récupérer casier à œufs avec des oeufs de l&#39;incubateur et le placer dans la hotte à flux laminaire. </li><li> Décollez la bande de la fenêtre, de récupérer un anneau de silicone 1 mm du bouchon d&#39;un flacon cryogénique en utilisant des pinces stériles, et déposer l&#39;anneau à travers la fenêtre. </li><li> Pipet la solution de PBS l cellulaire de 60 μ ++ et membrane basale mixture directement dans le centre de l&#39;anneau de silicone en appui sur la came. </li><li> Re-bande de la fenêtre et déplacer casier à œufs retour à l&#39;incubateur. À ce stade, faites attention en déplaçant les oeufs que l&#39;anneau et la suspension cellulaire peut facilement devenir des personnes déplacées. </li><li> Autoriser les tumeurs de croître de 5 à 7 jours. </li></ol> 4. Récolte tumeurs <ol><li> Placer sous-pad dans le capot. Préparer 35 x 10 mm et plaques de conteneurs de paraformaldéhyde comme nécessaire pour l&#39;histologie. Mettre 1 ml de PBS ++ dans chaque plaque 35 mm x 10. </li><li> Placez sac pour matières contaminées dans le capot. Prenez des ciseaux de dissection stériles et insérer l&#39;extrémité pointue dans l&#39;œuf au trou près de la fin estampillé. </li><li> Couper autour de l&#39;œuf entier longitudinalement. NOTE: le CAM et la tumeur avec la bague doivent tenir à la moitié supérieure de la coque avec la fenêtre. </li><li> Avec des ciseaux de dissection et forceps, disséquer la tumeur loin de la CAM et le placer dans la tumeur mm plaque 35 x 10. Mesurer et peser tumeurs. Tumeurs fixes dans paraformaldehypuis de les intégrer paraffine pour une utilisation dans des expériences d&#39;histologie et immunohistochimie. </li></ol> 5. (Facultatif): cellules tumorales dissociation <ol><li> Utilisez des ciseaux de dissection pour hacher la tumeur dans la plaque 35 mm x 10. Verser la tumeur hachés dans un tube de 15 ml centrifugeuse et enlever autant PBS ++ que possible par pipetage. </li><li> Ajouter 2 ml de collagénase (1 mg / ml dans du PBS ++), tourner le tube à plusieurs reprises, et incuber le tube à 37 ° C pendant au moins 30 min (jusqu&#39;à plusieurs heures). </li><li> Ajouter 5 ml de milieu à chaque tube et remettre soigneusement par aspiration et en baisse de 20 - 40x. Pipetage approfondie est essentiel pour la dissociation complète des cellules. </li><li> Laisser sédiments de se déposer et transférer le surnageant dans un nouveau tube. Centrifuger à 500 g pendant 5 min. Retirer le surnageant, laissant derrière culot cellulaire dissociée. NOTE: A ce stade, les culots cellulaires peuvent être utilisés pour diverses expériences (cytométrie de flux, la lyse pour une utilisation dans un Western blot, l&#39;isolement de l&#39;ARN, etc). Le nombre total de cellules tumorales peuvent également être obtenus en utilisant un hémocytomètre et coloration au bleu de trypan. Notez que des cellules plus petites, de forme ovale sont des cellules de poulet de la CAM et ne doivent pas être considérés comme des cellules tumorales. Il devrait y avoir un nombre minimal de contamination des cellules non tumorales (CAM) si la tumeur est disséqué loin de la CAM avec soin. </li></ol>

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</ol>

A.S. reçoit un financement de la société pharmaceutique Advaxis pour soutenir un essai clinique initié par un chercheur.

Plusieurs étapes clés de ce protocole représentent la plus probable pour l&#39;amélioration de la survie des embryons ainsi que la fiabilité accrue de la croissance tumorale. La chute du CAM loin de la coquille en appliquant une aspiration dans le sac d&#39;air est moins invasive que les autres méthodes existantes (à l&#39;aide d&#39;une aiguille pour enlever l&#39;albumine de l&#39;œuf, dissection, etc.). En utilisant une punaise stérile pour créer les deux petits trous nécessaires à cette méthode est la partie la plus...

Carcinome hépatocellulaire (CHC) est la 3 ème cause de mortalité par cancer dans le monde 1. Actuellement, seulement 30% des patients HCC sont admissibles à des traitements chirurgicaux potentiellement curatives 2, et la chimiothérapie systémique est pas efficace 3. Par conséquent, il ya un besoin urgent non satisfait clinique de nouvelles thérapies de HCC, et le développement de systèmes de modèles appropriés pour tester l&#39;efficacité de nouveaux agents. Le dosage chorioallantoïque poussin membrane (CAM) offre une méthode à débit moyen rentable, rapide et reproductible de tester des médicaments potentiels anti-tumorales in vivo. Le dosage de la CAM a été largement utilisée pour étudier l&#39;angiogenèse 4. Il a également été développé avec succès dans un modèle de xénogreffe de tumeur de cancers, y compris un glioblastome 5, 6 cancer du pancréas, le mélanome 09/07, 11/10 et l&#39;ostéosarcome. Les deux 12 in ovo et ex ovo13 techniques ont été utilisées dans la littérature, avec des détails variant de protocole pour le protocole. Un défi majeur pour le modèle de xénogreffe CAM est l&#39;incidence relativement élevée de la mort de l&#39;embryon après la manipulation de l&#39;œuf, avec des taux de mortalité de l&#39;embryon de poussin publiés allant de 25 à 50 pour cent 11-14. Dans cet article, nous décrivons le développement d&#39;un in ovo modèle de xénogreffe de CHC qui produit de manière fiable la croissance des trois dimensions, tumeurs vascularisées qui ressemblent histologiquement HCC indifférencié. Nous avons adapté un premier protocole décrit par Ossowski et al., 14 et avons réalisé chiches embryonnaire taux de jusqu&#39;à 93% de survie à la greffe extrêmement élevé de la tumeur.

<table><tbody><tr><td>Oeufs incubés premium</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx</td></tr><tr><td>Couveuses à oeufs</td><td>GQF</td><td>Hova-Bator 2362N</td><td></td></tr><tr><td>Plateaux à oeufs rotatifs</td><td>GQF</td><td>1611 Retourneur</td><td></td></tr><tr><td>d’oeufs Candler à oeufs</td><td>Lyon</td><td>Hi-Power 950-070</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 100 Outil rotatif avec meule à tronçonner 15/16</td><td>Dremel</td><td>100-N/7</td><td></td></tr><tr><td>Pince stérile, punaise, ciseaux de dissection, ruban adhésif</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>flacons cryogéniques, filetage extérieur avec rondelle en silicone</td><td>Corning</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td></td></tr></tbody></table>

la<em&gt; en ovo</em&gt; chick chorioallantoïque membrane (cam) assay comme un modèle de xénogreffe efficace de carcinome hépatocellulaire

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

La membrane chorioallantoïque poussin (CAM) commence à se développer au jour 7 après la fécondation et mûrit par jour 12. Le CAM est naturellement immunodéficientes et très vascularisée, ce qui en fait un système idéal pour l&#39;implantation de la tumeur. En outre, la CAM contient des protéines de la matrice extracellulaire comme la fibronectine, la laminine, le collagène, l&#39;intégrine alpha (v) beta3, et la MMP-2, ce qui en fait un modèle attractif pour étudier l&#39;invasion tumorale et les métastases. Les scientifiques ont longtemps profité de la physiologie de la CAM en utilisant comme modèle de l&#39;angiogenèse. Plus récemment, le dosage de la CAM a été modifié pour fonctionner comme un système in vivo de modèle de xénogreffe de différents cancers qui comble le fossé entre le travail de base in vitro et des modèles de cancer chez les animaux plus complexes. Le dosage CAM permet l&#39;étude de la croissance tumorale, les thérapies anti-tumorales, et les voies moléculaires pro-tumorale dans un système biologiquement pertinent qui est à la fois en temps et en coût efficace. Ici, nous décrivons le développement de CAM Xenograft modèle de carcinome hépatocellulaire (HCC) avec le taux de survie embryonnaire de jusqu&#39;à 93% et fiable take tumeur conduisant à la croissance de tumeurs vascularisées, en trois dimensions.

Photos représentatives des étapes clés dans le protocole sont présentés ici. Figure 1A illustre l&#39;utilisation de l&#39;candler de visualiser le développement de l&#39;embryon, le sac d&#39;air, et le système vasculaire de la CAM. Figure 1B-1C montrent le processus de décrochage de la CAM en faisant les deux trous, puis en appliquant une pression négative en utilisant l&#39;ampoule de la sécurité, et la figure 1D montre un chuté succès CAM avec une g...

La membrane chorioallantoïdienne (CAM) du poulet est immunodéficiente et hautement vascularisée, ce qui en fait un modèle naturel in vivo de croissance tumorale et d’angiogenèse. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode fiable de croissance de tumeurs tridimensionnelles du carcinome hépatocellulaire (CHC) vascularisé à l’aide du test CAM.

La<em&gt; En Ovo</em&gt; Chick chorioallantoïque membrane (CAM) Assay comme un modèle de xénogreffe efficace de carcinome hépatocellulaire

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

L'objectif général de cette expérience est de développer un modèle de xénogreffe sur membrane chorioallantoïque (cam) de carcinome hépatocellulaire. Cela est réalisé en premier lieu en incubant les œufs afin de les préparer à l'inoculation. Dans un deuxième temps, la membrane chorioallantoïque, ou cam, de l'œuf est abaissée et une fenêtre est découpée dans la coquille.Ensuite, l'œuf est inoculé avec des cellules de carcinome hépatocellulaire humain par la fenêtre pratiquée dans la coquille afin d'induire une croissance tumorale. Les résultats montrent que des tumeurs vascularisées tridimensionnelles ont été cultivées avec succès à l'aide de lignées cellulaires de carcinome hépatocellulaire humain. À l'aide de ce protocole, des taux de survie embryonnaires allant jusqu'à 93 % ont été obtenus.Les principaux avantages du test CAM par rapport à d'autres techniques in vivo, telles que les modèles de tumeurs chez la souris, sont la courte durée de l'essai expérimental, le faible coût global de l'expérience et la facilité de mise en œuvre. Les tests CAM peuvent être utilisés pour étudier l'angiogenèse, les tumeurs, l'invasion cellulaire et la métastase. Ils peuvent également servir à déterminer l'effet de petites molécules et de médicaments sur la croissance et le développement des tumeurs.La démonstration visuelle de cette procédure est importante car les différentes étapes de la préparation de l'œuf, notamment la transillumination, l'identification du réseau vasculaire, la réalisation de petites perforations près du sac aérien et au sommet de l'œuf sans le vider, peuvent s'avérer difficiles pour les nouveaux utilisateurs. Couper les fenêtres sans fissurer la coquille et s'assurer que la caméra reste intacte tout au long des procédures constituent des défis. Pour commencer, placez.Des œufs de poules indigènes spécifiques exempts de tout agent pathogène âgés de huit jours, placés dans un plateau à œufs rotatif avec la cicatrice poreuse orientée vers le haut. Installer le plateau rotatif à l'intérieur d'une incubatrice à œufs à 36 degrés Celsius avec une humidité de 50 % et incuber les œufs pendant 48 heures. Après incubation, placer les œufs dans un porte-œufs avec les extrémités marquées vers le haut, puis les placer dans une hotte à flux laminaire.Éteignez les lumières de la pièce et de la hotte, puis maintenez délicatement l'extrémité marquée de l'œuf contre le candélabre à œufs afin d'exposer la vascularisation de la membrane chorioallantoïdienne du poussin, appelée CAM, ainsi que la poche d'air. Faites une marque au crayon entre les deux principaux vaisseaux sanguins. Ensuite, percez un trou à l'extrémité de l'œuf, au-dessus de la poche d'air, à l'endroit marqué, et un second trou au niveau de la marque au crayon.À l’aide d’une épingle stérile, faites un trou d’environ trois millimètres de profondeur. Expulsez l’air d’un embout en caoutchouc de sécurité et appuyez fermement son extrémité ouverte contre le trou situé au-dessus de la poche d’air. Relâchez lentement l’embout pour créer une aspiration qui attire l’air dans le trou au niveau du trait de crayon, provoquant ainsi la chute du loquet loin de la coquille.Confirmez que le sac d'air s'est déplacé de l'extrémité estampillée de l'œuf vers le trou marqué au crayon à l'aide du candélabre. S'il n'en est pas ainsi, approfondissez légèrement les deux trous et réappliquez l'aspiration avec l'ampoule de sécurité. Ensuite, tenez l'œuf dans une main en utilisant un outil rotatif équipé d'un embout de découpe de 1516 pouces.Effectuez deux coupes transversales à travers la coquille sans toucher le came. Les coupes doivent mesurer deux centimètres de longueur et être espacées d'un centimètre. Ensuite, pratiquez des coupes longitudinales aux extrémités des deux coupes transversales en effleurant légèrement la meule de découpe contre la coquille.Pour retirer la coquille, insérez une pince stérile sous le fragment de coquille et parallèlement à celui-ci. Saisissez le fragment avec la pince et retirez-le proprement. Tenez une extrémité d'un morceau de ruban adhésif replié sur lui-même, puis appliquez le ruban sur l'ouverture de l'œuf.Placer l’œuf dans un plateau à œufs et installer le plateau dans l’incubateur sans rotation pendant pas plus de deux à trois heures avant l’inoculation. Pour préparer l’inoculation, placer un mélange de protéines de la membrane basale, tel que le matrigel, sur de la glace afin d’éviter la polymérisation. Ensuite, utiliser quatre à cinq millilitres d’une solution de deux millimolaire d’EDTA par flacon pour détacher les cellules tumorales et placer le flacon dans l’incubateur de culture tissulaire pendant cinq minutes.Réensemencez, suspendez les cellules détachées dans le milieu et comptez le nombre de cellules. Utilisez entre 500 000 et 2 millions de cellules pour la greffe sur l'albumen, selon la lignée cellulaire. Ensuite, transférez le volume nécessaire pour obtenir le nombre adéquat de cellules dans un nouveau tube et centrifugez pendant cinq minutes.À 500 fois la gravité, éliminer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans 40 microlitres de PBS contenant du calcium et du magnésium, appelé PBS plus plus, et 20 microlitres de mélange de membrane basale. À ce stade, des médicaments ou d'autres agents d'essai peuvent être ajoutés à la suspension cellulaire.Ensuite, placez le plateau d'œufs dans la hotte à flux laminaire. Retirez le ruban adhésif de l'œuf et faites tomber un anneau en silicone stérile d'un millimètre provenant d'un flacon cryogénique à travers l'ouverture et sur le conduit cam. Ajoutez la solution de 60 microlitres contenant les cellules, le PBS plus plus et le mélange de membrane basale au centre de l'anneau en silicone, refermez l'ouverture avec du ruban adhésif et replacez délicatement le plateau d'œufs dans l'incubateur.Laisser les tumeurs croître pendant cinq à sept jours. Pour la récolte des tumeurs, placer un tapis absorbant et un sac pour déchets infectieux dans la hotte.Préparez des plaques de 35 millimètres sur 10 millimètres contenant un millilitre de PBS plus plus et des récipients de paraformaldéhyde selon les besoins pour l'histologie. Insérez l'extrémité pointue de ciseaux stériles de dissection dans l'œuf par le trou situé près de l'extrémité estampillée, puis découpez tout autour de la longueur complète de l'œuf. Le cam et la tumeur avec l'anneau doivent adhérer à la moitié supérieure de la coquille présentant l'ouverture.Extraire la tumeur de la caméra à l’aide d’une dissection, de ciseaux et de forceps, puis placer la tumeur dans une plaque de 35 millimètres sur 10 millimètres. Mesurer et peser la tumeur. Fixer la tumeur dans du paraformaldéhyde, puis l’insérer dans de la paraffine pour une utilisation ultérieure dans des expériences d’histologie et d’immunohistochimie.Après avoir prélevé la tumeur, hacher la tumeur dans la plaque à l’aide de ciseaux de dissection. Ensuite, verser la tumeur hachée dans un tube de centrifugation de 15 millilitres et éliminer le PBS plus plus par pipetage. Ajouter deux millilitres d’une solution de collagénase à un milligramme par millilitre dans du PBS plus plus et mélanger en retournant le tube plusieurs fois.Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes et jusqu'à plusieurs heures. Ensuite, ajouter cinq millilitres de milieu dans le tube et mélanger soigneusement en pipetant de 20 à 40 fois. Cette étape est cruciale pour dissocier complètement les cellules.Une fois que le sédiment s'est déposé, transférez le surnageant dans un nouveau tube, centrifugez le tube à 500 × g pendant cinq minutes, puis jetez le surnageant en laissant le culot de cellules dissociées. Lorsque la caméra était en place avec les cellules tumorales HUH-7, une tumeur vascularisée était visible à l'intérieur de l'anneau. Après cinq jours de croissance, l'histologie de la tumeur HUH-7 provenant de l'essai sur la CAM a montré que les cellules tumorales ressemblent à des cellules de carcinome hépatocellulaire indifférencié.Lors de l'utilisation de cette méthode, il est important de garder à l'esprit que certaines optimisations peuvent être nécessaires selon les cellules ou les médicaments utilisés. Par exemple, certaines lignées cellulaires peuvent nécessiter des densités plus élevées ou plus faibles pour former des tumeurs tridimensionnelles.

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