Name: La culture de Heligmosomoides polygyrus: Un immunomodulateur nématode parasite et de ses produits sécrétés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Apprenez à cultiver Heligmosomoides polygyrus et à isoler ses molécules immunosuppressives pour étudier leurs effets sur les réponses immunitaires. Cette méthode permet d'explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

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Les auteurs sont financés par le Wellcome Trust par le biais de l’Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) et du Programme Grant (Y.H., et R.M.M.) et du Fellowship (J.R.G), du BBSRC (G.C.), de l’American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. et R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) et de la Rainin Foundation (D.J.S. et R.M.M.).

NOTE: Toutes les procédures dans ce protocole sont effectués conformément aux lignes directrices énoncées par le Royaume-Uni Home Office et de l&#39;Université des Services vétérinaires Edimbourg. 1. L&#39;infection de souris par gavage <ol><li> Magasin Heligmosomoides polygyrus L3 larves dans l&#39;eau distillée jusqu&#39;à six mois à 4 ° C. </li><li> Avant utilisation, lavez larves L3 trois fois dans l&#39;eau distillée: centrifuger à 300 g pendant 10 min (avec frein), mais enlever tous les 500 pi d&#39;eau (pour éviter les larves L3 granulés inquiétante) et remettre le culot à chaque fois. </li><li> Pour le troisième lavage, ajouter de l&#39;eau à un volume exact (typiquement 40 ml) et aspirer 20 pi avec une pointe coupe 200 pi d&#39;élargir son ouverture. Placer deux échantillons de 20 ul sur la surface d&#39;une boîte de culture de 60 mm et compter les larves L3 (généralement mobile, et mieux vu sous un grossissement de 50X avec un microscope à dissection). Remettre en suspension le culot final dans de l&#39;eau distillée à une Concentration de 2000 larves L3 par ml. </li><li> Pour la production du cycle de vie, d&#39;infecter (C57BL / 6xCBA) souris F1 huit semaines, âgé de 400 H. polygyrus larves L3 dans 200 ul d&#39;eau distillée par gavage par voie orale (souris retenir en position verticale par la peau du cou et passer doucement l&#39;aiguille de gavage émoussée par la bouche et de l&#39;œsophage dans l&#39;estomac). Bien agiter avant chaque infection (larves se installent rapidement dans l&#39;eau) et aspirer 200 pi dans une seringue de 1 ml; utiliser une aiguille de gavage dédiée à bout arrondi. Pour l&#39;infection expérimentale de souris plus jeunes (6-8 semaines anciens), ou d&#39;autres souches consanguines (par exemple C57BL / 6 ou BALBc), infecter des souris avec 200 larves L3. </li></ol> 2. Propagation et entretien de H. polygyrus <ol><li> Placez charbon dans le centre d&#39;une grande baignoire en plastique et laissez l&#39;eau froide du robinet afin de fonctionner au-dessus d&#39;un minimum de 30 min (non lavés charbon actif est toxique pour les larves L3). Videz l&#39;eau de la baignoire et placer le charbon de bois sur tDeux couches de papier absorbant, le laissant exposé à l&#39;air ambiant jusqu&#39;à séchage complet. </li><li> Si les œufs sont nécessaires, gratter les matières fécales premier sur le côlon avec des pinces et ciseaux (si nécessaire). Si un grand nombre de larves L3 est nécessaire, placer des souris sur une grille de fils et de recueillir des boulettes fécales sur plusieurs jours. </li><li> Mélanger les selles avec du charbon de bois granulé à un rapport d&#39;au moins 1: 1, pour obtenir une consistance juste humides assez pour adhérer à papier filtre. Appliquer une fine couche sur le centre de certains papier filtre humide dans une boîte de Pétri et placer dans une boîte humide (ajouter un peu de serviette de papier humide et un plat d&#39;eau) dans l&#39;obscurité pendant 12 à 14 jours. </li><li> Retirer larves L3 de 7 jours à compter, et les recueillir sur au moins deux reprises avant que le papier est jeté. Les larves former un anneau autour du bord du papier filtre; soulever le papier filtre sur la boîte de Pétri et rincer les larves qui sont à gauche de la plaque (en utilisant une pipette et 5 ml d&#39;eau stérile par plaque) dans un tube de 50 ml. </li><li> Ascenseurle papier filtre et récolter les larves restant à gauche sur la plaque avec de l&#39;eau distillée dans un tube de 50 ml. Centrifuger la solution d&#39;effluents à 300 g pendant 10 min. Laver les larves trois fois à l&#39;eau distillée, puis stocker à 4 ° C dans un maximum de 50 ml d&#39;eau distillée jusqu&#39;au moment requis. REMARQUE: Les larves restent viables et infectieux pendant au moins six mois. </li></ol> 3. Collection des adultes H. polygyrus Worms <ol><li> Préparer l&#39;appareil Baermann modifié à l&#39;avance comme représenté sur la Figure 1. </li><li> Souris Cull quatorze jours après l&#39;infection. </li><li> Laver l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol. Couper la peau sur l&#39;abdomen et tirez pour révéler la paroi abdominale antérieure. Faire une incision médiane pour entrer dans la cavité péritonéale. </li><li> Retirer l&#39;ensemble du petit et grand intestin (du duodénum proximal rectum distal). Placer dans une boîte de Pétri sec. </li><li> Redresser l&#39;intestin sur toute sa longueur; exciser le côlon fèces contenant; placer cela dans un plat à part pour les préparations d&#39;œufs plus tard. </li><li> Exciser les proximales 20 cm de l&#39;intestin grêle qui contient les vers adultes -identified par la paroi relativement épaisse du duodénum et souvent un aspect rouge dues à des vers intra-luminal. Placez dans un (100 mm de diamètre) boîte de Pétri avec 5 ml de la solution de Hanks, chauffée à 37 ° C (deux spécimens par boîte). </li><li> Ouvrez la partie de l&#39;intestin proximal ver rempli longitudinalement avec des ciseaux (ciseaux à bout rond sont les meilleurs pour cela), et racler l&#39;intérieur de paroi intestinale avec deux lames de verre pour enlever les vers. Puis jetez la paroi intestinale propre. </li><li> Vers pointe dans de petits sacs de mousseline, base fermée et sécurisée avec trombones autour du bord de l&#39;entonnoir de verre (Figure 1). </li><li> Remplissez entonnoir avec une solution de Hanks et ajouter environ 4 boîtes de Pétri de vers dans chaque entonnoir. </li><li> Placez l&#39;appareil sur 37 ° C incubateur pendant 1-2 heures, en agitant doucement à mi-parcours pour délogerles débris de la préparation de l&#39;intestin qui peuvent obstruer le filtre de mousseline. Prenez soin d&#39;éviter le déversement de débris à l&#39;extérieur du sac de mousseline - cela va causer une contamination de la préparation finale HES. Les vers adultes auraient lentement migré à travers le tissu de mousseline et se sont installés au fond du tube à essai en verre. Détacher délicatement le tube à essai dans le tuyau en caoutchouc reliant dessus de l&#39;évier (en prenant soin d&#39;éviter de perdre des vers à ce point). </li><li> En utilisant une pipette en plastique, transférer les vers dans un tube de 50 ml et laver six fois avec Hanks Solution (permettent de vers à régler avec gravité, supprimer les médias avec un Stripette, ajouter 40 ml de Hanks Solution et répéter cinq fois). REMARQUE: la culture du ver doit être maintenue stérile partir de ce point. <ol><li> Déplacer vers une hotte à flux laminaire et laver encore six fois dans une solution stérile de Hanks additionné de 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine, prêt pour la culture in vitro. </li></ol></li><li> Comptez levers adultes récupérés en prenant deux échantillons de 20 ul prises avec une pointe jaune coupe d&#39;élargir son ouverture; attendre environ 50% de la quantité de larves inoculées. </li></ol> 4. Configuration de cultures pour HES: Préparation Moyen, adultes Worms <ol><li> Tremper les vers de 3,11 à environ 10 ml de RPMI additionné de 10% de gentamycine pendant 20 min, en laissant reposer le tube à un angle pour assurer des vers sont entièrement couverts. </li><li> Effectuer cette dans une hotte à flux laminaire: laver à nouveau six fois avec une solution de Hanks (complété avec 5 U / ml de pénicilline et 5 ug / ml de streptomycine). </li><li> Préparer H. polygrus médias. </li><li> Le maintien de la stérilité dans une hotte à flux laminaire, à 500 ml de RPMI1640, ajouter 11,1 ml de 45% de glucose (concentration finale de 1,2% comme RPMI 1640 contenant 0,2% de glucose), 5 ml de 100x Peniclllin-streptomycine (concentration finale de 5 U / ml de pénicilline, 5 ug / ml de streptomycine), 5 ml de L-glutamine (2 mM de concentration finale), et5 ml de gentamycine (concentration finale 1%). Ne pas ajouter de FCS. </li><li> vers aliquotes dans des flacons T25 ventilés, env. 1000 vers dans 15 ml H. polygyrus médias par flacon, et le lieu debout dans 37 ° C incubateur (5% de CO 2) pour trois semaines. </li></ol> 5. Préparation de HES <ol><li> Récupérer HES-contenant des milieux de culture à partir de cultures à des intervalles de plus de deux fois par semaine, l&#39;annulation de la première collection après 24 h de la culture (en raison de niveaux élevés de contamination LPS et protéines de l&#39;hôte - peuvent être traitées séparément ou mis au rebut). Gardez chaque collecte séparée et clairement étiquetés avec le numéro de date et lot. Remplacer avec un volume égal de H. polygyrus médias à chaque fois. </li><li> Centrifugeuse HES-contenant les médias à 400 x g pendant 5 min. Puis filtrer stériliser par 0,2 um filtres à faible liaison aux protéines en tubes de 50 ml. Magasin dans le congélateur à -20 ° C clairement étiqueté avec la date de la récolte du ver et la date de HES collection. </li><li> Après 21 jours de collecte HES de la culture, jeter vers. </li><li> Piscine 500-1000 ml de surnageant HES (habituellement de stock congelé, et non y compris la collecte premières 24 h) et se concentrer sur un filtre de 3000 MWCO dans le dispositif d&#39;ultrafiltration sous pression d&#39;azote. NOTE: Soyez très prudent de ne pas laisser le filtre à sec. <ol><li> Pour mettre en place le dispositif de filtrage, d&#39;abord laver le côté brillant de la membrane 3 kDa dans un bécher de 1 litre avec de l&#39;eau distillée pendant 3 x 20 min tout en remuant. Monter le dispositif d&#39;ultrafiltration selon les instructions du fabricant avec membrane filtrante côté brillant vers le haut. Lieu dans l&#39;armoire à 4 ° C et passer 50 ml d&#39;eau distillée à travers avant de commencer à se concentrer HES en gestion commune. </li><li> Ajouter dans chaque tube de HES dans le dispositif de filtration selon les besoins (100 à 140 ml par jour), jusqu&#39;à ce que le volume est concentré jusqu&#39;à 2-5 ml. </li></ol></li><li> Afin d&#39;éliminer les contaminants de milieux de culture contenant HES, ajouter 50 ml de pyrfibrinogène exempt de PBS au dispositif de filtration et vers le bas et ensuite concentré à environ 2 ml. Répétez cette étape deux fois (150 ml de PBS au total). Transfert HES dans un tube de 15 ml, stériliser par filtration (avec un filtre de 0,2 um) dans une hotte à flux laminaire et mesurer la concentration de protéine en utilisant un spectrophotomètre (E = 10 280) ou par dosage de Bradford. </li><li> Aliquote, étiquette avec numéro de lot et la date, et le gel à -80 ° C. </li><li> Effectuez un test de LAL chromogène selon les protocoles du fabricant sur chaque lot de HES avant de l&#39;utiliser. Si les niveaux de LPS sont supérieures à 1 U LPS pour 1 pg de protéine, envisager de ne pas utiliser ce lot pour des expériences in vivo ou in vitro de cultures. </li><li> Traiter les HES recueillies à 24 h séparément de la même manière; elle contient le LPS et des protéines de l&#39;hôte et, tout en ne convient pas pour des expériences fonctionnelles, il est une source utile de molécules individuelles qui peuvent être isolés par monoclonal purification par affinité d&#39;anticorps. </li></ol&gt;

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Le cycle de vie de H. produit de polygyrus d&#39;une manière fiable cohérente. Après l&#39;ingestion naturelle ou gavage oral de L3 larves au jour 0, les kystes commencent à se former sous la séreuse duodénale par jour 5, progressant vers mues larvaires, puis en train de devenir des vers adultes dans la lumière intestinale du jour 10, les oeufs peuvent être vus dans les selles de 14 jours et les granulomes sont visibles sur la surface séreuse du duodénum au jour 21. Le protocole décrit ci-dessus (et résumés dans la figure 6) permet une production à haut débit de H. produits polygyrus de excréteurs-sécrétoire (HES), en plus de la récupération fiable des larves L3 viable pour les futures infections expérimentales du cycle et de la vie. L&#39;infection à H. polygyrus a été montré pour avoir un effet protecteur dans des modèles de l&#39;asthme dépendant de OVA ou Der p 1 (acariens allergène) 14. En outre, la suppression de l&#39;inflammation des voies aériennes peut être transférée avec CD4 + CD25 + </sup&gt; cellules T régulatrices CD19 + 14 ou CD23 des cellules B réglementaires hi 24 de non-sensibilisés, H. polygyrus infectés par souris. Dans les modèles d&#39;auto-immunité, H. polygyrus infection a été montré pour être suppressif dans le modèle encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) de la sclérose en plaques 9, et la suppression peut être transféré avec des cellules T CD4 + ou des cellules B CD19 + de souris infectées 24. Produits d&#39;excrétion-sécrétion de Heligmosomoides (HES) modulent la réponse immunitaire de l&#39;hôte et supprimer l&#39;inflammation médiée par Th2 par un certain nombre de mécanismes (décrites dans la figure 7), comprenant: a) Inhibition de la réponse des cellules dendritiques pour stimulation 25, b) induction de CD4 lymphocytes T régulateurs Foxp3 + + 18. et c) le blocage de l&#39;IL-33 la production 20. HES a montré un effet protecteur lorsqu&#39;il est administré unet sensibilisation ou un défi dans le modèle OVA-alun de l&#39;asthme 19 et également lorsque administré par voie intranasale avec l&#39;extrait de Alternaria allergène 20, par la suppression de la petite IL-33 de presse. Éviter la contamination LPS des HES est souvent cruciale pour le succès des futures expériences immunologiques. Dans le protocole décrit ici, les étapes critiques dans la réalisation de cet doivent se assurer que les débris contenus dans les sacs de mousseline de l&#39;appareil Baermann ne entre pas dans la préparation de HES final (voir 2.10) et de mettre de côté la solution ES à partir des 24 premières heures de la culture (voir 5.1). Au cours des dernières années, HES a été caractérisé à fond au niveau protéomique avec plus de 370 protéines distinctes identifiées 26,27. En outre, ES à partir du 4ème stade larvaire a été soumis à l&#39;analyse protéomique 28. Les travaux en cours comprend la caractérisation des composants majeurs glycanes de HES, connues pour être fortement immunogène 3, et sécrétée micro-RNComme qui sont encapsulés dans des vésicules de 50 à 100 nm ou exosomes (Buck et al., Soumis pour publication). Avec la mise en place de protocoles reproductibles pour la collecte des ES de ce parasite très immunomodulateur, et avec de nombreuses données protéomiques identifiant les composants moléculaires de HES, le décor est désormais planté pour l&#39;identification et l&#39;essai thérapeutique de molécules individuelles de H. polygyrus qui peut médier les effets principaux sur le système immunitaire de l&#39;hôte.

Heligmosomoides polygyrus est un helminthes gastro-intestinal murin naturel qui est étroitement liée à la très répandues nématodes parasites humains 1. Contrairement à d&#39;autres modèles, tels que nématodes Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus établit toujours une infection chronique chez la souris comme un résultat direct de plusieurs mécanismes de immunomodulateurs puissant qu&#39;il emploie pour supprimer l&#39;hôte de la réponse immunitaire 2. H. polygyrus a un cycle de vie direct: larves L3 infectieux sont ingérés par transmission féco-orale (ou administré par gavage oral dans le cadre d&#39;un laboratoire), après quoi ils migrent vers la couche de sous-séreux du duodénum et enkystent avant de revenir à la lumière intestinale comme vers adultes environ huit jours après l&#39;infection initiale. L&#39;accouplement et la production d&#39;oeufs se produit par jour 10 et il est possible de récolter les vers adultes pour la culture et la collecte de produits d&#39;excrétion-sécrétion de da14 y compter trois. H. polygyrus interagit également avec la microflore commensale, à une augmentation de lactobacilles présente chez les souris sensibles infectés 4-6, et l&#39;augmentation des niveaux de H. polygyrus infection après exposition des souris à 6 lactobacilles. Infection active à H. polygyrus a été démontré que la protection contre l&#39;immunopathologie dans de nombreux modèles animaux de l&#39;auto-immunité 7-10, la colite 11,12 et 13 à 16 allergie. Il a donc été un grand intérêt dans le potentiel de molécules excréteur-sécrétoires de ce parasite (&quot;HES&quot;) en bas-modulent pathologie in vivo 17,18. En effet, des effets protecteurs sont vus après le traitement des souris avec des produits HES 19 par des voies qui sont maintenant identifiés 18,20. Ici, nous décrivons un protocole pour la production fiable de Heligmosomoides polygyrus et la récupération de ses produits sécrétésqui peut être en outre utilisés pour une gamme d&#39;études biochimiques et immunologiques fonctionnels.

<table><tbody><tr><td>Concentrateur Amicon</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Modèle 8050 50 ml http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée de Hanks</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Pénicilline streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Charbon actif</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml solution à 45 % http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Flacons</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&nbsp ;</td><td>Flacon ventilé de 25 cm http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Dosage chromogène LAL</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 essai http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml ; sans L-glutamine http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

la culture de<em&gt; heligmosomoides polygyrus:</em&gt; un immunomodulateur nématode parasite et de ses produits sécrétés

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (anciennement connu sous le nom Nematospiroides dubius, et également appelé par certains comme H. bakeri) est un helminthes gastro-intestinal qui emploie plusieurs mécanismes immunomodulateurs d&#39;établir une infection chronique chez la souris et étroitement ressemble infections prévalentes d&#39;helminthes humaines. H. polygyrus a été largement étudié dans le domaine de la régulation immunitaire helminthes dérivé et a été trouvé pour supprimer puissamment modèles expérimentaux de l&#39;allergie et de l&#39;auto-immunité (à la fois d&#39;une infection active et produits sécrétés isolés). Le protocole décrit dans le présent document décrit la gestion du H. polygyrus cycle de vie pour la production de larves L3 cohérente, la récupération des parasites adultes, et la collecte de leurs produits d&#39;excrétion-sécrétion (HES).

Susceptibilité à l&#39;infection par H. polygyrus est contrôlée dans une large mesure par l&#39;arrière-plan génétique de la souche de la souris (tableau 1); Souris C57BL / 6 et de l&#39;ABC sont très sensibles 21,22. Pour l&#39;entretien du cycle de vie du parasite, l&#39;hybride F1 entre ces deux souches a été choisi pour sa capacité à résister beaucoup plus élevés charge parasitaire sans morbidité (dommages épithéliales intestinales excessive) soit par rapport à la souche parentale. Gavage oral de 400 larves L3 est utilisé pour maintenir le cycle de vie chez les souris F1 (résultant en charge parasitaire adultes présentés dans la figure 2), tandis que la dose de 200 larves L3 est généralement utilisé pour des expériences de souches consanguines homozygotes (par exemple, C57BL / 6 ou BALBc). Toutefois, cette dose peut être nécessaire de réduire en fonction de co-facteurs environnementaux qui peuvent différer entre les établissements d&#39;origine animale, tels que les variations de la flore intestinale. Lots de HES ont prouvé effi reproductiblecacité dans des dosages fonctionnels et de la composition de protéine; De plus, quand les surnageants de chaque semaine successive de culture ont été analysés, jusqu&#39;à un total de 4 semaines, les profils de protéines se sont avérées très similaire (figure 3). Lorsque la concentration HES est mesurée par dosage de Bradford (voir 5.5), le total protéine est généralement d&#39;environ 1 mg / ml (Figure 4). Un autre procédé de concentration HES est un concentrateur centrifuge (par exemple des membranes de coupure Vivaspin 3 kDa), dans lequel les échantillons sont centrifugés à jusqu&#39;à 4000 g dans un rotor centrifuge pivotant vers l&#39;extérieur, l&#39;élimination des sels tampons et des composants de faible poids moléculaire. Concentration centrifuge est plus adapté aux petits volumes de traitement (1-10 ml) et sont limitées à un facteur de concentration maximum d&#39;environ 30x. Lors de la collecte HES, éviter la contamination est critique. Pour éviter la contamination avec des molécules d&#39;accueil, nous écartons HES-suiteaining milieux de culture à partir de la 24 première heure après la récolte du ver adulte de l&#39;intestin de la souris. Nous quantifions également le niveau de contamination LPS dans chaque lot de HES avec un dosage chromogénique LAL (voir 5.7). 1 U de LPS équivaut à ~ 100 pg LPS et des niveaux inférieurs à ce 23 sont considérées comme négligeables. Dans nos mains, la plupart des lots de HES sont nettement en dessous de cette limite, la concentration moyenne de LPS dans HES étant 0,23 U / pg (Figure 5). Les effets de LPS dans des modèles in vivo de pathologie (par exemple, la suppression des réponses asthmatiques) nécessite au moins 10 ng de LPS 23. Ainsi, dans l&#39;administration in vivo de 5 ug HES partir d&#39;un lot de 100 pg LPS / pg HES comprendra 500 pg de LPS, bien en dessous de la concentration efficace lorsque LPS devient un problème. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Figure 1: Appareil Baermann BaerAppareillage mann pour la collecte des adultes de H. polygyrus (tel que décrit dans la section 2). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Figure 2: moyenne Worm Burden 14 jours après l&#39;infection avec 400 larves L3 ver moyenne pèse 14 jours après l&#39;infection avec 400 larves L3. Les points de données sont présentés à partir de 19 tours de l&#39;infection de souris C57BL / 6xCBA distincts. Moyenne ± SEM montrée. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Figure 3: profils protéiques de HES partir semaines consécutives dans la culture profil SDS-PAGE de protéines HES recueillies au cours des semaines successives de la culture. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Figure 4: </strong&gt; Quantité final de HES de 500 ml contenant ES médias rendement de protéines HES de 11 lots différents provenant d&#39;environ 500 ml de surnageant de culture. Moyenne ± SEM montrée. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Figure 5: LPS contamination de niveaux de contamination HES LPS en 41 lots d&#39;HES mesurées par le test de Limulus ameobocyte. Concentration médiane LPS = 86 U par mg de HES. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Figure 6: Schéma d&#39;animation de H. Résumé du cycle de vie polygyrus des étapes clés du cycle de vie du gavage des larves L3, grâce à la récupération des larves et les vers adultes à l&#39;isolement des HES. Figure 7: Schéma d&#39;animation des HES et ses fonctions d&#39;effets immunomodulateurs clés de médiateurs solubles et exosomes contenues dans HES. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Génotype (et la souche de fond) </td><td> Phénotype de l&#39;infection primaire </td><td> Référence </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Souches consanguines </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, ABC, C3H </td><td> Très sensible </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 et des souris C57BL / 10 </td><td> Sensible </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Intermédiaire </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Faible sensibilité </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgénique pour des cytokines ou des récepteurs de cytokines </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Plus sensibles </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Moins sensible (a); aucune modification de la sensibilité, mais une augmentation des granulomes (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rß transgénique (C57BL / 6) </td><td> Résistant </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> La fécondité supérieur </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (souris C57BL / 6 ou BALB / c) </td><td> Très sensible </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (souris BALB / c ou C57BL / 6) </td><td> Très résistant </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 transgéniques(FVB) </td><td> Résistant </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Insuffisantes Th2, diminué granulome gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Plus sensibles </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> Aucune modification de la sensibilité </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Haute Th1, sensibilité accrue </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgénique pour les marqueurs de cellules T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> La fécondité légèrement supérieur </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> La fécondité supérieur </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> La fécondité supérieur &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgéniques pour loci immunitaire innée </td><td></td></tr><tr><td> Type 1 récepteur de l&#39;interféron (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> La fécondité supérieur, plus de granulomes </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Plus résistantes, plus de granulomes </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Plus sensibles </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tableau 1: infections primaires avec H. polygyrus dans des souches génétiquement différentes et gènes ciblée souris.

Heligmosomoides polygyrus est un nématode murin avec de puissantes capacités immunomodulateurs qui ressemblent étroitement à celles de l&#39;infection hautement répandue helminthes humaine. Ici, nous décrivons un protocole pour le maintien à long terme de la H. polygyrus cycle de vie.

La culture de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Un immunomodulateur nématode parasite et de ses produits sécrétés

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

L'objectif général de cette procédure est de recueillir et d'analyser les molécules sécrétées par les parasites helmuth à longue durée de vie qui régulent à la baisse les réponses immunitaires de l'hôte, permettant ainsi la survie des parasites. Cela est réalisé en premier lieu en cultivant les parasites dans leur environnement naturel, le tube intestinal de souris. La deuxième étape consiste à isoler les parasites adultes des souris après euthanasie.Ensuite, les parasites helmuth sont cultivés en culture tissulaire, dans un milieu qui perdure jusqu'à trois semaines, durant lesquelles ils libèrent de grandes quantités de molécules excrétoires, sécrétoires ou ES. L'étape finale consiste à récupérer et concentrer les molécules libérées à partir des surnageants de culture, afin d'obtenir des lots de molécules ES destinés à des analyses biologiques et biochimiques. En fin de compte, les surnageants concentrés peuvent être testés directement sur des types cellulaires spécifiques in vitro afin d'étudier les modifications de la fonction des cellules immunitaires, ou administrés à des souris pour évaluer leur capacité à supprimer les allergies et d'autres troubles.L'idée de cette méthode est née lorsque nous avons observé que la suppression immunitaire était associée à une infection par des parasites vivants, indiquant une libération active et continue de molécules immunosuppressives par ces parasites vivants. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les infections parasitaires, les molécules que nous découvrons et qui suppriment l'immunité devraient être très efficaces pour traiter certaines maladies majeures du monde occidental, telles que les allergies, les maladies auto-immunes et la maladie inflammatoire de l'intestin. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de récupération et de traitement des helminthes parasites sont très spécialisées et nécessitent une attention particulière à la technique de culture aseptique.Des souris F1 âgées de huit semaines seront infectées par voie orale avec des larves de H polyus par gavage afin de produire le cycle biologique de H polyus. Préparez les larves L3 de H polyus à une concentration de 2000 par millilitre d'eau distillée, comme décrit dans le protocole associé. Prélevez 400 L3 par souris dans 200 microlitres avant chaque infection.Agitez doucement la suspension de larves en l’ayant retournée cinq fois, puis aspirez 200 microlitres de la suspension à l’aide d’une seringue d’un millilitre munie d’un embout d’alimentation spécial à extrémité arrondie. Pour effectuer l’alimentation par gavage oral, maintenez la souris en position verticale en saisissant la peau du cou, puis introduisez délicatement l’embout contondant dans la bouche, l’œsophage et jusqu’à l’estomac. Des vers adultes et des œufs de parasites seront récupérés à partir de la souris.14 jours après l'infection, 14 jours après l'infection. Les vers adultes de H. polygyrus sont collectés chez les souris à l'aide d'un appareil de Baermann modifié, préparé comme illustré ici. Pour commencer cette procédure, laver l'abdomen de l'animal euthanasié avec de l'éthanol à 70 %.Couper la peau au niveau de l'abdomen et la rabattre pour mettre à nu la paroi abdominale antérieure. Pratiquer une incision médiane afin d'accéder à la cavité péritonéale. Retirer l'intégralité de l'intestin grêle et du côlon, du duodénum proximal jusqu'au rectum distal.Placez-le dans une boîte de Pétri sèche. Ajustez l'intestin sur toute sa longueur, excisez le côlon contenant les matières fécales, puis placez-le dans un récipient séparé afin de récupérer ultérieurement les œufs. Ensuite, identifiez les 20 centimètres proximaux de l'intestin grêle contenant les vers adultes.Il se caractérise par la paroi relativement épaisse du duodénum et présente souvent un aspect rouge dû aux vers intraluminaux. Exciser cette portion de l'intestin grêle et la placer dans une boîte de Pétri contenant cinq millilitres de solution de Hank. Réchauffer à 37 degrés Celsius à l'aide de ciseaux à bouts ronds.Ouvrir longitudinalement la portion proximale du tube digestif contenant les vers et racler l'intérieur de la paroi intestinale à l'aide de deux lames de verre. Pour éliminer les vers, jeter la paroi intestinale propre. Préparer le cône avec la solution de Hank.Fermez hermétiquement un petit sachet en mousseline à l’aide d’une agrafe, puis versez-y les vers provenant de deux boîtes de Pétri. Placez deux sachets en mousseline sur chaque entonnoir en verre et fixez-les avec des trombones tout autour du bord de l’entonnoir. Placez l’appareil dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures.À mi-chemin de l'incubation, agiter doucement l'appareil afin de déloger les débris de la préparation intestinale qui pourraient obstruer le filtre en mousseline. Prendre soin d'éviter que des débris ne s'échappent à l'extérieur du sachet en mousseline, car cela provoquerait une contamination de la préparation finale de HES. À la fin de l'incubation, détacher soigneusement le tube de collecte du tuyau en caoutchouc relié, au-dessus d'un évier à l'aide d'une pipette en plastique, transférer les vers dans un tube de 50 millilitres et laisser les vers se déposer par gravité.Retirer le milieu à l’aide d’une pipette Pasteur. Ajouter 40 millilitres de solution de Hank et laisser les vers se déposer. Répéter cinq fois, pour un total de six lavages. Il est essentiel d’éviter toute contamination de la culture trouble pour la réussite de ce protocole.La culture de vers doit être maintenue stérile à partir de ce moment. Passer sous une hotte à flux laminaire et laver la culture de vers six fois supplémentaires dans une solution stérile de Hank, enrichie avec des antibiotiques, à l’aide d’une pipette, puis prélever deux échantillons de 20 microlitres afin de dénombrer les vers adultes récupérés. Environ 50 % de la quantité de larves inoculées devrait produire des œufs au jour 14 de l’infection, permettant de prélever les fèces hors du côlon préalablement excisé à l’aide de forceps.Ensuite, mélangez les selles avec du charbon actif granulé dans un rapport d'au moins un pour un. Pour obtenir une consistance suffisante pour adhérer et remplir une feuille de papier. Étalez une fine couche au centre d'un morceau de papier filtre humide dans une boîte de Pétri et placez celle-ci dans une boîte étanche à la lumière et humide afin de maintenir l'obscurité pendant 12 à 14 jours.À partir du septième jour, commencez à collecter les larves de troisième stade. Formez un anneau le long du bord du papier filtre. Soulevez le papier filtre hors de la boîte de Pétri et utilisez une pipette pour rincer les larves restantes sur la boîte avec cinq millilitres d'eau stérile par boîte.Transférez les larves dans un tube de 50 millilitres. Replacez le papier filtre dans la boîte et répétez la collecte des larves dans l’obscurité sur une base hebdomadaire pendant un mois maximum. Les larves collectées sont ensuite lavées comme décrit dans le texte du protocole et conservées à quatre degrés Celsius dans de l’eau distillée.Pour commencer cette procédure, faire tremper les vers dans environ 10 millilitres de solution de Hank, supplémentée avec 10 % de gentamicine, pendant 20 minutes, en laissant le tube en position inclinée afin de garantir que les vers soient entièrement recouverts au bout de 20 minutes. Laver les vers six fois avec la solution de Hank, supplémentée avec des antibiotiques, et transférer les vers dans des flacons T 25 ventilés. Placer les flacons verticalement dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant trois semaines, en vue de préparer les produits de sécrétion et d'excrétion, ou HES, provenant des vers.Culture contenant du HES. Le milieu est collecté à partir des cultures à des intervalles d'au plus deux fois par semaine, et remplacé à chaque fois par un volume équivalent de milieu h polyus. Conserver chaque prélèvement séparément et l'étiqueter clairement avec la date et le numéro de lot, en raison du risque accru de contamination par des LPS et des protéines d'hôte.La première récolte après 24 heures de culture doit être mise de côté et soit traitée séparément, soit éliminée : centrifuger le surnageant d'embryons humains (HES) contenant le milieu à 400 × g pendant cinq minutes. Ensuite, aspirer le milieu à l’aide d’une seringue de 50 millilitres et le faire passer à travers un filtre de 0,2 micron à faible liaison aux protéines dans des tubes de 50 millilitres. Par la suite, le surnageant HES mis en commun est concentré à l’aide d’un dispositif d’ultrafiltration muni d’un filtre à seuil de poids moléculaire de 3000 daltons, sous pression d’azote. Pour préparer le dispositif de filtration, rincer d’abord la membrane de trois kilodaltons, côté brillant vers le bas, dans un bécher d’un litre contenant de l’eau distillée, sous agitation.Assemblez le dispositif d'ultrafiltration conformément aux instructions du fabricant, avec la membrane filtrante côté brillant vers le haut, placez-le dans une armoire à quatre degrés Celsius et faites passer 50 millilitres d'eau distillée avant de commencer à concentrer le HES versé. Veillez soigneusement à ne pas laisser sécher le filtre. Ajoutez chaque tube de HES dans le dispositif de filtration selon les besoins, jusqu'à ce que le volume soit concentré à deux à cinq millilitres, afin d'éliminer les acides aminés et d'autres composants du milieu de culture tissulaire.À partir de la préparation de HES, ajouter 50 millilitres de PBS sans pyrogène au dispositif de filtration, puis concentrer jusqu'à environ deux millilitres. Répéter cette étape deux fois. En utilisant un total de 150 millilitres de PBS, transférer un ES dans une seringue et filtrer en stérilisant avec un filtre de 0,2 micron.Après avoir mesuré la concentration en protéines, étiqueter l'aliquote avec le numéro de lot et la date, puis congeler à moins 80 degrés Celsius. Une gavage oral de 400 L à trois larves est utilisé pour maintenir le cycle de vie de H poly gyus chez les souris F1. Les charges parasitaires adultes résultantes sont indiquées ici.Des lots de HES ont démontré une efficacité reproductible dans les tests fonctionnels et en ce qui concerne la composition protéique. En outre, lorsque les surnageants provenant de chaque semaine consécutive de culture ont été analysés, les profils protéiques se sont révélés très similaires jusqu'à un total de quatre semaines. Lorsqu'une concentration de TS est mesurée par le dosage de Bradford, la protéine totale est généralement d'environ un milligramme par millilitre.Le rendement en protéine HES provenant de 11 lots différents, dérivés d'environ 500 millilitres de surnageant de culture, est indiqué. L'éviction de la contamination est essentielle lors de la collecte de HES, car les niveaux de contamination par les LPS dans 41 lots de HES ont été mesurés à l'aide du test limbus AAMI CYTE. La plupart des lots de HES se sont révélés nettement inférieurs au seuil de contamination recommandé.Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir une technique stérile rigoureuse lors de la mise en place des cultures. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois à quatre heures si elle est effectuée correctement en suivant cette procédure. D'autres méthodes telles que la protéomique, la fractionnement protéique et l'analyse des glycanes, des lipides et des microARN peuvent être réalisées afin de comprendre pleinement le spectre des produits moléculaires libérés par ces parasites.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment propager Poly limus. Cultivez Polyus et recueillez les produits DS à partir des vers adultes cultivés afin de tester leurs effets sur le système immunitaire. Bien que ce parasite ne soit pas pathogène pour l'homme, il est important de respecter les précautions de sécurité et de suivre scrupuleusement le protocole spécifié afin d'assurer la reproductibilité entre les lots de Hess.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Trichuris muris infection est un modèle de l'immunité intestinale Th2 où les souris résistantes générer une réponse immunitaire protectrice Th2 et souris susceptibles de générer une réponse Th1 pathologique.

Trichuris muris Infection: Un modèle de type 2 Immunité et inflammation de l&#39;intestin

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In vivo et in vitro Élevage de Nématodes entomopathogènes (Steinernematidae et Heterorhabditidae)

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Nettoyage sélectif des nématodes sauvages de Caenorhabditis pour enrichir les bactéries du microbiome intestinal

L’infection de Caenorhabditis elegans par le parasite microsporidien Nematocida parisii permet aux vers de produire une progéniture très résistante au même agent pathogène. C’est un exemple d’immunité héréditaire, un phénomène épigénétique mal compris. Le présent protocole décrit l’étude de l’immunité héréditaire dans un modèle de ver génétiquement traitable.

Étude de l’immunité héréditaire dans un modèle d’infection à Microsporidia à Caenorhabditis elegans

Les nématodes entomopathogènes vivent en symbiose avec les bactéries et, ensemble, ils infectent avec succès les insectes en sapant leur système immunitaire inné. Pour promouvoir la recherche sur la base génétique de l’infection par les nématodes, des méthodes de maintien et de manipulation génétique des nématodes entomopathogènes sont décrites.

Cultiver et manipuler génétiquement des nématodes entomopathogènes

Les cellules T et ILC2 exprimant l’IL-9 sont induites au cours de l’infection à N. brasiliensis , mais leur caractérisation a été largement négligée dans l’intestin infecté en raison de leur faible fréquence et de leur cinétique différentielle. Ce protocole décrit l’isolement de ces cellules à partir de différents organes cibles et la confirmation de leur identité par cytométrie en flux à différents stades de l’infection.

Stratégie pour l’étude des cellules lymphoïdes productrices d’IL-9 dans le modèle d’infection à Nippostrongylus brasiliensis

Caenorhabditis elegans est l’une des principales espèces modèles en biologie, mais presque toutes les recherches sont effectuées en l’absence de ses microbes naturellement associés. Les méthodes décrites ici aideront à améliorer notre compréhension de la diversité des microbes associés comme base pour les futures recherches fonctionnelles sur C. elegans.

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Strongyloides ratti est un nématode parasite qui provoque des infections transitoires chez les souris de laboratoire, présentant des stades de migration tissulaire et de vie intestinale. Ici, nous présentons un protocole pour le maintien du cycle parasitaire chez le rat et l’infection expérimentale de souris, y compris la quantification du parasite dans la tête, les poumons et l’intestin.

Infection expérimentale de souris par le nématode parasite Strongyloides ratti

Ici, nous décrivons les conditions de culture in vitro , l’isolement et la génération accrue de vésicules extracellulaires (VE) à partir d’Echinococcus granulosus. Les petits VE ont été caractérisés par une diffusion dynamique de la lumière et une microscopie électronique à transmission. L’absorption par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse et leur modulation phénotypique ont été étudiées à l’aide de la microscopie confocale et de la cytométrie en flux.

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Nous présentons deux méthodes permettant aux agriculteurs de propager massivement des nématodes entomopathogènes sous forme de bioinsecticides. La première méthode utilise le gel de polyacrylamide comme substrat de culture du nématode, tandis que la seconde utilise du coton recouvert de polymère comme substrat de culture. Les deux méthodes reposent sur la propagation in vivo des nématodes à l’intérieur des cadavres d’insectes.

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