Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

L'objectif général de l'expérience suivante est de quantifier en temps réel les changements rapides de l'adhésion cellulaire à la matrice chez des cellules endothéliales exposées à des agents modificateurs de la matrice, en utilisant l'impédance cellule-substrat et l'imagerie de cellules vivantes. Dans cette expérience, l'enzyme hémique myéloperoxydase est utilisée comme agent modificateur de la matrice ayant une pertinence pathophysiologique. Ceci est réalisé en recouvrant d'abord des surfaces avec de la fibronectine afin de fournir un substrat matriciel adhésif.

On laisse ensuite la myoperoxydase ou MPO se lier à la fibronectine. Puis, les cellules endothéliales en suspension sont déposées sur les surfaces et incubées afin d'obtenir une adhérence maximale des cellules et leur expansion sur la fibronectine. Ensuite, les cellules sont exposées au peroxyde d'hydrogène afin d'initier l'oxydation de la fibronectine médiée par la MPO.

Les changements rapides subséquents dans l’adhérence cellulaire à la matrice sont ensuite quantifiés en temps réel à l’aide de l’impédance cellule-substrat et de l’analyse d’imagerie en temps réel des cellules vivantes. Les résultats montrent que les pertes rapides d’adhérence matricielle des cellules endothéliales induites par l’oxydation de la fibronectine médiée par les NPO peuvent être quantifiées en temps réel avec une haute résolution temporelle et sans marquage, par impédance cellule-substrat et imagerie de cellules vivantes. L’avantage de ces techniques réside dans leur capacité à quantifier de manière continue les variations d’adhérence cellulaire à la matrice avec une haute résolution temporelle, ce qui permet d’obtenir de nouvelles informations essentielles sur la manière dont les modifications de la matrice induisent des changements en aval dans la morphologie cellulaire et les voies de signalisation dépendantes de l’adhérence.

Les protocoles revêtent une importance plus large dans la mesure où ils peuvent être facilement adaptés en remplaçant la MPO par d'autres agents modificateurs de la matrice, tels que des protéases ou des matrices de commutation, ou en utilisant des types cellulaires adhérents autres que les cellules endothéliales, comme les cellules épithéliales. Pour commencer, ajoutez 80 microlitres par puits de fibronectine pour recouvrir des matrices de microélectrodes dorées de 96 puits destinées à des mesures d'impédance cellulaire sur substrat, ou ajoutez deux millilitres de fibronectine dans des boîtes de culture cellulaire à fond en verre pour une analyse d'imagerie de cellules vivantes. Incubez les matrices et/ou les boîtes de culture à 37 degrés Celsius pendant deux heures.

Ensuite, pour bloquer les surfaces, ajouter 0,2 % de BSA et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures supplémentaires. Puis, ajouter la myéloperoxydase humaine purifiée dans du HBSS et incuber pendant 30 minutes. Ensuite, utiliser du HBSS pour laver les surfaces deux fois afin d'éliminer toute MPO non liée.

Ensuite, observez 250 000 cellules par millilitre de cellules endothéliales en suspension préparées selon le protocole décrit dans le texte, déposées sur des réseaux microélectrodes à impédance pour cellules en plaques de 96 puits, présentant des surfaces revêtues de fibronectine native ou portant la MPO. Pour les boîtes de culture cellulaire de 35 millimètres à fond en verre, ajoutez deux millilitres de suspension contenant 500 000 cellules par millilitre. Immédiatement après l’ensemencement des cellules, placez les plaques équipées de réseaux microélectrodes sur le port de l’incubateur à impédance cellulaire, à 37 degrés Celsius et sous 5 % de dioxyde de carbone.

Et effectuez des mesures à vide pour initier l'acquisition continue des données d'indice cellulaire. Transférez les boîtes de culture cellulaire de 35 millimètres avec fond en verre dans un incubateur à 35 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Incubez pendant deux heures afin de permettre une fixation et une étendue cellulaires maximales.

Après l'incubation, interrompez temporairement les lectures de l'indice cellulaire et retirez brièvement la plaque à microélectrodes ou la boîte à fond en verre de l'incubateur, aspirez le surnageant et ajoutez du HBSS réchauffé afin d'examiner les effets des inhibiteurs, des modulateurs de la MPO, des réactions catalysées ou des inhibiteurs de la signalisation cellulaire. Ajoutez-les aux cultures. Replacez immédiatement la plaque à microélectrodes dans le port de l'incubateur ou la boîte à fond en verre dans l'incubateur, puis laissez les cellules s'équilibrer pendant 30 minutes.

Pour initier l'oxydation de la fibronectine dépendante de l'acide hypochloreux catalysée par la NPO et la désadhérence cellulaire pour des études d'impédance, retirez la plaque à microélectrodes de l'incubateur et mettez en pause les mesures d'indice cellulaire. Ajoutez du peroxyde d'hydrogène au HBSS et mélangez délicatement par pipetage répété, puis remettez immédiatement la matrice de microélectrodes dans le port de l'incubateur et redémarrez les lectures d'indice cellulaire pour des études d'imagerie en temps réel utilisant des boîtes en verre de 35 millimètres à fond en verre. Après avoir retiré la boîte de l'incubateur, montez-la sur une platine chauffée à 37 degrés Celsius d'un microscope confocal inversé, équipé d'un objectif à immersion dans l'eau de 63 x.

Et optique DIC Pour enregistrer des films de cellules vivantes, focalisez-vous sur les cellules et optimisez l'optique DIC conformément aux directives référencées ici. Lancez l'enregistrement du film DIC et enregistrez les valeurs de référence des cellules non traitées pendant une minute, puis ajoutez du peroxyde d'hydrogène et mélangez délicatement par pipetage répété, recentrez le microscope et poursuivez l'enregistrement de films DIC des cellules traitées pendant la durée requise. Pour analyser les données d'impédance cellule-substrat, commencez par exporter les données dans un tableur pour l'adhésion cellulaire.

Les études normalisent les données en fixant à un les valeurs enregistrées immédiatement avant le début de l'oxydation de la fibronectine médiée par MPO, puis présentent les données sous forme de courbes d'indice cellulaire normalisé en fonction du temps afin d'analyser les données d'imagerie de cellules vivantes. Ouvrez dans un logiciel d'analyse d'images tel qu'ImageJ au moins deux films distincts d'imagerie de cellules vivantes en contraste interférentiel différentiel (DIC) enregistrés immédiatement avant et après le début de l'oxydation de la fibronectine médiée par MPO, sélectionnez aléatoirement plusieurs cellules et mesurez leur surface projetée sur des images consécutives en traçant manuellement le contour de leur membrane et en quantifiant le nombre de pixels inclus. Enfin, présentez les données sous forme de courbe de la surface cellulaire normalisée en fonction du temps. L'adhésion de suspensions de cellules endothéliales sur de la fibronectine ou de la fibronectine portant de la MPO conduit à une fixation maximale des cellules et à une extension maximale en deux heures, comme en témoigne le plateau des valeurs d'indice cellulaire dans l'interaction cellule-substrat.

Les mesures d'impédance, une fois l'adhérence cellulaire maximale établie sur la fibronectine native ou portant des NPO, montrent qu'une oxydation ciblée de la fibronectine, médiée par l'acide hypochloreux catalysé par les NPO et initiée par l'ajout du substrat cosubstrat des NPO, le peroxyde d'hydrogène, provoque une diminution rapide de la surface de contact matrice-cellule, mesurée par l'impédance cellule-substrat et par imagerie de cellules vivantes. Comme illustré ici, la désadhérence cellulaire rapide observée dans les cellules endothéliales liées à la fibronectine portant des NPO en réponse au traitement par le peroxyde d'hydrogène est absente dans les cellules traitées au peroxyde d'hydrogène seul. L'inhibition de la fonction du moteur myosine II par la statine BLE inhibe la vitesse de désadhérence des cellules endothéliales, mesurée par l'impédance cellule-substrat et par imagerie de cellules vivantes, ce qui indique que la désadhérence cellulaire et la contraction en réponse à l'oxydation matricielle sous-cellulaire catalysée par la MPO sont entraînées par des forces tensiles acto-myosine. Étant donné que ces méthodes permettent de mesurer précisément des changements très rapides dans l'adhérence cellulaire, elles peuvent fournir des informations essentielles sur les relations causales entre les modifications de l'adhérence et les changements ultérieurs dans les processus de signalisation dépendants de l'adhérence, tels que la phosphorylation de SARK ou la signalisation des adhérences focales, qui peuvent être facilement mesurés dans des expériences parallèles au cours du temps par immunobuvardage Western.