Name: Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Découvrez la quantification de l'adhésion cellulaire en temps réel chez les cellules endothéliales par impédance cellule-substrat et imagerie de cellules vivantes. Cette méthode permet d'analyser les dynamiques d'adhésion induites par modification de la matrice.

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Ce travail a été financé par une subvention de projet du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (NHMRC) 568721 (SRT) et, en partie, par une subvention de recherche de la faculté de médecine de l’UNSW (MDR).

1. Généralités cellules endothéliales Culture <ol><li> Culture des cellules bovines endotheliales aortiques (passages 4-9) sur des flacons de culture tissulaire revêtues de gélatine (couche de surface de culture de tissu avec 0,1% p / v de gélatine dans du PBS à température ambiante pendant 15 min) dans EGM-2 médias (à l&#39;EGM-2 balle Kit contenant 5% de sérum bovin foetal, des facteurs de croissance et tous les suppléments fournies par le fabricant, à l&#39;exception de l&#39;hydrocortisone). </li><li> Lorsque les cellules sont confluentes à court (environ 3 jours après le semis, après une 1: split 4), la récolte des cellules par traitement avec 0,05% p / v de trypsine / 0,02% p / v d&#39;EDTA dans du PBS à 37 ° C. Après la majorité des cellules ont détaché, ajouter complets EGM-2 médias pour étancher la trypsine puis centrifugeuse (100 xg, 5 min). </li><li> Préparation des cellules pour des études sur l&#39;adhérence de novo de cellules endotheliales vers la fibronectine (Expérience 1: Section 2) et le de-adhérence ultérieure des cellules endothéliales avec une adhérence établie sur ce substrat (expérience 2: Section 3). <ol><li> Laver récoltésles cellules une fois avec du exempt de sérum de Milieu 199 contenant 1% p / v d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) et re-centrifugation (100 x g, 5 min). </li><li> Re-suspendre les cellules dans un milieu sans sérum 199 contenant 1% p / v de BSA à 2,5 x 10 5 cellules / ml (mesures d&#39;impédance cellule-substrat) ou 5 x 10 5 cellules / ml (analyses imagerie des cellules vivantes) et maintenir à 37 ° C avant utilisation. NOTE: Les réponses d&#39;adhérence de cellules sont très sensibles aux différences de température (par exemple, en raison des effets de convection) si tous les équipements et solutions utilisés pour manipuler et traiter les cellules pendant les protocoles suivants doivent être maintenus à une température constante de 37 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Expérience 1: Quantification De Novo Endothelial Cell Adhesion sur la fibronectine autochtones et MPO-oxydé (Cell-substrat Impédance) REMARQUE: Expérience 1 examine la mesure dans laquelle MPO médiation oxydation de fibronectine compromet sa capacité à soutenir de novo </em&gt; Adhésion des cellules endothéliales en suspension. <ol><li> Manteau fibronectine sur 96 puits or cellule-substrat tableaux impédance de microélectrodes. Ajouter 80 pl / puits de bovin purifié fibronectine à 5 ug / ml dans PBS, incuber pendant deux heures à 37 ° C et retirer la solution. </li><li> Incuber les surfaces revêtues de fibronectine avec MPO pour permettre la liaison de la MPO lié à la surface de la fibronectine. Ajouter 80 ul / puits de MPO purifié neutrophile humaine à 20 nm dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et incuber pendant 0,5 heures à 37 ° C. </li><li> Laver les surfaces deux fois avec HBSS pour éliminer toute MPO non lié. </li><li> Ajouter H 2 O 2 (0 à 10 uM de concentration finale) dans des puits de la plaque de matrice de microélectrodes contenant 80 pl / puits de HBSS pour initier catalysée par la MPO, l&#39;oxydation de la fibronectine HOCl-dépendante et incuber pendant 0,5 heures à 37 ° C. </li><li> Pour examiner l&#39;effet des inhibiteurs ou modulateurs de réactions catalysées MPO pertinents (par exemple, alternative enzyme MPOles substrats, les inhibiteurs de l&#39;enzyme ou des antioxydants; voir 9 pour plus de détails), les ajouter à la HBSS immédiatement avant H 2 O 2 plus. </li><li> Après 0,5 h, traiter les surfaces avec de la méthionine pour étancher espèces oxydantes de surface liée résiduels, ce est-chloramines liés aux protéines réactives, qui peuvent exercer des activités cellulaires de confusion. Ajouter 10 mM méthionine dans 80 ul HBSS par puits et incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Bloquer surfaces avec de la BSA. Ajouter 80 pl / puits de BSA à 0,2% p / v dans PBS, incuber pendant deux heures à 37 ° C et retirer la solution. REMARQUE: des régions de surface non revêtues résiduels appuieront l&#39;adhésion cellulaire et en bloquant ceux-ci avec une protéine non-adhésif (par exemple, BSA) veille à ce que les réponses d&#39;adhérence cellulaire dépendent étroitement de la matrice de cellules-adhésif purifié utilisé, dans ce cas, la fibronectine. </li><li> Laver les surfaces deux fois avec HBSS. REMARQUE: Aucun des traitements de surface précédentes affecte sensiblement cellule-substrat readings. </li><li> cellules endothéliales suspension de semences (ajouter 200 pl / puits à environ 2,5 x 10 5 cellules / ml, préparés dans un milieu sans sérum contenant 199 BSA 1%, voir 1.3) sur les surfaces revêtues de fibronectine indigènes ou MPO-oxydés. </li><li> Immédiatement après l&#39;ensemencement des cellules (à savoir, avant tout attachement des cellules et la diffusion), monter la plaque de réseau de microélectrodes sur l&#39;orifice d&#39;incubateur (logée dans un incubateur à 37 ° C en présence de 5% CO 2). <ol><li> Utilisation du logiciel de l&#39;instrument immédiatement prendre un «blanc» pour normaliser la lecture ultérieure impédance cellule-substrat («indice de la cellule») des valeurs aux valeurs de fond initiales obtenues en l&#39;absence d&#39;adhésion cellulaire. </li><li> Initier acquisition de données d&#39;index cellulaire continue (minimum d&#39;une cellule indice lecture / min). </li></ol></li><li> Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 2 heures, période de temps pendant laquelle l&#39;attachement des cellules et la diffusion maximale est obtenue; ce qui se traduit parun plafonnement des valeurs d&#39;index de cellule (voir la figure 3A). NOTE: L&#39;expérience précédente (Expérience 1) examine la façon initiale MPO oxydation médiée par la fibronectine limite la capacité des cellules endotheliales à établir l&#39;adhérence des cellules sur ce substrat. L&#39;expérience (Experiment 2) suivante examine comment l&#39;oxydation de la fibronectine MPO médiation favorise diminutions dans la cellule-matrice adhérence (ce est à dire, de-adhérence) dans les cellules endothéliales avec adhérence établie sur ce substrat. Les traitements de ces deux expériences sont essentiellement identiques, sauf pour le temps d&#39;oxydation à médiation par MPO fibronectine (à savoir, avant l&#39;adhésion cellulaire - Expérience 1, après l&#39;adhésion cellulaire - Expérience 2). </li></ol> 3. Expérience 2: Quantification des cellules endothéliales De-adhérence de fibronectine en réponse à MPO médiation fibronectine oxydation (Impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes) <ol><li> Manteau fibronectine sur 96 puits microélectrodes d&#39;or unerrays pour des mesures d&#39;impédance cellule-substrat (ajouter 80 ul / puits de la fibronectine à 5 ug / ml dans du PBS et on incube pendant 2 heures à 37 ° C) ou des plaques de culture cellulaire à fond de verre de 35 mm pour les analyses d&#39;imagerie des cellules (ajouter 2 ml / boîte de fibronectine à 5 ug / ml dans du PBS et on incube pendant 2 heures à 37 ° C). </li><li> Bloquer surfaces avec de la BSA. Ajouter BSA à 0,2% p / v dans du PBS à des volumes indiqués dans 3,1 et incuber pendant 2 heures à 37 ° C. </li><li> Incuber surfaces avec MPO pour permettre la liaison du MPO à la fibronectine. Ajouter 20 nM MPO humaine purifiée dans du HBSS les volumes indiqués dans 3,1 et incuber pendant 0,5 heures à 37 ° C. </li><li> Laver les surfaces deux fois avec HBSS pour éliminer toute MPO non lié. </li><li> cellules endothéliales de semences en suspension (préparés Milieu 199 contenant 1% p / v de BSA sans sérum; voir 1.3) sur les surfaces revêtues de fibronectine indigènes ou MPO-portant. <ol><li> Ajouter 200 ul / puits à 2,5 x 10 5 cellules / ml à 96 puits cellule-substrat tableaux impédance de microélectrodes. </li> &lt;li&gt; Ajouter 2 ml / boîte à 5 x 10 5 cellules / ml à 35 mm à fond de verre plats de culture cellulaire. </li></ol></li><li> Immédiatement après l&#39;ensemencement des cellules (ce est à dire, avant toute fixation des cellules et la diffusion): <ol><li> Mont 96 des plaques de matrice de microélectrodes sur le Port impédance incubateur cellulaire substrat (logé dans un incubateur à 37 ° en présence de 5% de CO 2) et prendre des lectures «en blanc» pour lancer l&#39;acquisition continue de données d&#39;index cellulaire (cf. Section 2.10 ). </li><li> Transfert à fond de verre 35 mm boîtes de culture cellulaire à un incubateur à 37 ° C en présence de 5% CO 2. </li></ol></li><li> Incuber les cellules à 37 ° C pendant 2 heures pour permettre la fixation des cellules et maximale d&#39;écartement (voir section 2.11). </li><li> Retirez brièvement les (lectures d&#39;index de la cellule de pause à ce stade) de 96 puits de plaque de matrice de microélectrodes ou 35 mm à fond de verre cellulaire boîte de culture de la 37 ° C incubateur, retirez surnageant cellulaire et ajouter réchauffé (37 ° C) HBSS (volumes que per étape 3.1). REMARQUE: HBSS est employée lorsque l&#39;on étudie MPO-réactions d&#39;oxydation catalysée place de milieux de culture complète que celle-ci contient des espèces oxydables qui interfèrent avec les réactions d&#39;oxydation. </li><li> Pour examiner l&#39;effet des inhibiteurs / modulateurs des réactions catalysées par la MPO (substitution des substrats enzymatiques, des inhibiteurs enzymatiques ou des antioxydants ou des inhibiteurs) de signalisation cellulaire (par exemple, 40 uM blebbistatin pour inhiber la contractilité actomyosine), ajouter ces maintenant. </li><li> Placer immédiatement la plaque de matrice de microélectrodes de nouveau dans les (lectures d&#39;index cellulaire re-commence à ce point) 37 ° port incubateur C ou le verre de 35 mm à fond plat de culture cellulaire de retour dans le 37 ° C incubateur, et permettent aux cellules de se équilibrer dans le HBSS pendant 0,5 heure. NOTE: Après 0,5 h équilibrage dans HBSS, les valeurs de l&#39;indice de la cellule se stabilisent à des valeurs légèrement inférieures; lorsque les cellules pré-incubation avec des substrats d&#39;enzyme, l&#39;enzyme et les inhibiteurs de la signalisation des cellules ou des antioxydants, assurer d&#39;abord que tHese ne affecte pas significativement les valeurs obtenues après équilibrage. </li><li> Initier MPO-catalysée, l&#39;oxydation de la fibronectine HOCl-dépendante et dé-adhérence. <ol><li> Pour les études d&#39;impédance de cellules en utilisant 96 des plaques de matrice de microélectrodes: <ol><li> Retirer la plaque de matrice de microélectrodes de l&#39;incubateur et de pause des mesures d&#39;indice de la cellule. </li><li> Ajouter H 2 O 2 (concentration finale de 0 à 10 uM) à la HBSS et mélanger doucement par pipetage répété. </li><li> Immédiatement, re-fixer le réseau de microélectrodes de retour sur l&#39;orifice d&#39;incubateur à 37 ° C et à nouveau commencer l&#39;acquisition de valeurs d&#39;index de cellule. </li></ol></li><li> Pour les études d&#39;imagerie des cellules vivantes en utilisant 35 mm boîte de culture de cellules de verre à fond: <ol><li> Retirer la boîte de culture de l&#39;incubateur et monter sur une scène 37 ° C chauffée d&#39;un microscope confocal inversé équipé d&#39;un objectif 63X d&#39;eau avec optique DIC appropriés pour l&#39;enregistrement de films de cellules vivantes. </li><li> Focus sur les cellules etoptimiser l&#39;optique DIC (éclairage de Köhler, biais retard et décalage caméra / de gain; pour plus de détails, voir 13). </li><li> Initier film DIC et enregistrer des lectures de base de cellules non traitées pendant 1 min. </li><li> Ajouter H 2 O 2 (concentration finale de 0-10 uM) et mélanger délicatement par pipetage répété. Re-concentrer le microscope (si nécessaire) et continuer l&#39;enregistrement de films DIC des cellules traitées pour la période de temps requise. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Analyse et présentation des données <ol><li> Données d&#39;impédance cellule-substrat <ol><li> Exporter des données brutes (indice de la cellule en fonction du temps) dans un tableur. </li><li> Pour les études cellule de-adhérence (Expérience 2: Section 3), normaliser les données en définissant des valeurs enregistrées immédiatement avant le début de l&#39;oxydation de la fibronectine MPO-médiation à une valeur de 1 (ce est à dire, immédiatement avant l&#39;ajout de H 2 O 2 en 3.11 .1.1). NOTE: Cela garantit que, par rapportchangements dans les valeurs de l&#39;indice de cellules induites par l&#39;oxydation de la fibronectine MPO médiation ne sont pas masqués par de petites différences initiales dans les valeurs de l&#39;indice de cellule absolue entre les puits. <ol><li> Les données actuelles que des parcelles de l&#39;indice normalisé de cellules (axe des y) en fonction du temps (axe des x). </li></ol></li></ol></li><li> Données d&#39;imagerie de cellules vivantes (études cellule de-adhésion dans l&#39;expérience 2: article 3) <ol><li> Ouvrez DIC vivent les films d&#39;imagerie cellulaire enregistrées immédiatement avant et après l&#39;ouverture de l&#39;oxydation de la fibronectine MPO médiation dans un programme d&#39;analyse d&#39;image standard (par exemple, logiciel ImageJ). </li><li> Dans au moins deux films distincts DIC sélectionner au hasard plusieurs cellules et mesurer leur surface projetée en images séquentielles (par exemple, à des intervalles de 1 min) en traçant manuellement leur bord de la membrane et de quantifier le nombre de pixels fermés. </li><li> Exportation des données brutes (surface cellulaire projetée en fonction du temps) à une feuille de calcul Excel et normaliser les données de la zone cellulaire en fixant des valeurs enregistrées immédiatement avantl&#39;initiation de l&#39;oxydation de la fibronectine à médiation MPO à une valeur de 1 (ce est à dire, immédiatement avant l&#39;addition de H 2 O 2 dans 3.11.2.3). </li><li> Les données actuelles comme une parcelle de la zone normalisée cellulaire (axe des y) en fonction du temps (axe des x). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs ne ont aucune divulgation à faire.

L&#39;adhérence cellule-matrice et processus de-adhérence peuvent être quantifiés avec précision en temps réel avec une haute résolution temporelle utilisant une impédance cellulaire substrat et imagerie des cellules vivantes analyses. Ces approches en temps réel fournissent un avantage majeur sur les analyses point final de l&#39;adhésion cellulaire, qui fournissent une mauvaise résolution temporelle. En quantifiant avec précision rapides réponses de-adhésion avec haute résolution temporelle, ces analyses peuvent fourn...

Adhésives contacts stables entre les cellules et leur matrice extracellulaire environnante sont nécessaires pour le maintien de l&#39;homéostasie tissulaire. Par exemple, l&#39;adhésion des cellules endothéliales à la matrice sous-endothéliale dans les vaisseaux sanguins joue un rôle critique dans le maintien de l&#39;intégrité de la couche endothéliale et sa fonction de régulation homéostatique comme une barrière semi-perméable vasculaire 1. Le cytosquelette d&#39;actine est mécaniquement couplé à l&#39;adhésif molécules de la matrice sur les sites d&#39;adhérence cellule-matrice et des contacts d&#39;adhésif à l&#39;interface cellule-matrice jouent un rôle important dans la détermination de la position de la membrane cellulaire en résistant à des forces de traction actomyosine centralement dirigées. Stimuli extracellulaires qui modifient cellule-matrice adhérence modifierait nécessairement l&#39;équilibre des forces à l&#39;interface cellule-matrice, un événement qui est rapidement &quot;senti&quot; par des protéines de signalisation mécano-sensibles, résultant dans la transduction du &quot;outside-in de signalisation&quot;. Ce pari diaphonieWeen cellules et leur matrice extracellulaire environnante joue un rôle clé dans le contrôle de la forme des cellules, la motilité, la fonction, la prolifération et la survie 2. Les processus physiopathologiques variés (le développement embryonnaire, l&#39;inflammation, la cicatrisation des plaies et les métastases du cancer) sont caractérisées par le remodelage dynamique de substrats de la matrice d&#39;adhésif par des oxydants et / ou des enzymes dégradant la matrice 3,4. Par exemple, l&#39;adhésif protéines de la matrice sous-endothéliale des vaisseaux sanguins (par exemple, la fibronectine) sont impliqués que les principaux objectifs de la modification ou de la dégradation dans les maladies inflammatoires humaines en raison de la production localisée d&#39;oxydants réactifs (par exemple, l&#39;acide hypochloreux, HOCl) par l&#39;enzyme de leucocytes dérivés myéloperoxydase (MPO), qui se accumule dans le sous-endothelium vasculaire au cours de la maladie inflammatoire (figure 1) 9/5. Changements dans la cellule-matrice adhérence induites par MPO-oxydants dérivés et autres stimuli de matrice modifier sont likely à jouer un rôle important dans la modification de l&#39;homéostasie vasculaire au cours de divers processus pathologiques, par exemple, par modification de la signalisation des cellules endotheliales, la morphologie et la viabilité, ce qui perturbe la fonction endothéliale et l&#39;intégrité de la barrière. Toutefois, les réponses de signalisation morphologiques et cellulaires de cellules adhérentes à des modifications de la matrice extracellulaire commencent seulement à être compris. Pour comprendre comment les modifications de la matrice dictent l&#39;évolution de la dynamique d&#39;adhésion cellulaire et voies de signalisation cellulaire d&#39;adhésion dépendant, les techniques sont tenus que de quantifier avec précision les changements dans la cellule-matrice adhérence en temps réel, avec une haute résolution temporelle. Ici, nous décrivons complémentaire impédance cellule-substrat et des techniques d&#39;imagerie des cellules vivantes qui répondent à ces critères et qui fournissent une plate-forme pour quantifier l&#39;adhésion cellulaire et des processus de-adhérence d&#39;une manière non-invasive. Nous montrons comment ces cellules impédance-substrat et imagerie des cellules vivantes Approdouleurs peuvent être facilement utilisés pour (i) suivre la dynamique de l&#39;attachement des cellules et la diffusion (ce est à dire, de novo adhésion cellulaire) sur des substrats de matrice natifs et modifiés, et (ii) pour mesurer la dynamique de détachement cellulaire matrice (c.-de-adhérence ) par des cellules adhérentes exposés à des stimuli de matrice modificateurs. Le système xCELLigence cellule-substrat impédance biocapteur fournit une mesure en continu de la zone de contact cellule-matrice par la quantification de l&#39;impédance électrique à la surface de 96 puits réseaux de microélectrodes de l&#39;or et exprime ces mesures d&#39;impédance électrique comme &quot;indice de cellule&quot;, une valeur sans dimension qui est en grande partie proportionnelle à la surface de contact de substrat de cellule 10 (figure 2), tout en étant également sensibles aux variations de la distance moyenne entre le (isolante) membrane cellulaire et la surface d&#39;électrode 11. Une augmentation supplémentaire de valeurs de l&#39;indice de la cellule est également atteint lors de la formation du serrée contacts cellule-cellule that restreindre courant paracellulaires, 11 des conditions qui ne existent pas dans les expériences décrites dans cette étude. Mesure de la surface projetée des cellules individuelles au fil du temps par analyse d&#39;image de time-lapse contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) des films fournit une mesure complémentaire de changements dans le domaine de contact cellule-substrat et fournit des informations supplémentaires concernant la nature exacte et la dynamique de la changements morphologiques quantifiés par la méthode de l&#39;impédance cellule-substrat. Plus précisément, nous décrivons l&#39;application de ces approches pour contrôler la manière dont l&#39;oxydation des adhésifs protéines de la matrice sous-endothéliale (par exemple, la fibronectine) (i) MPO-médiée réduit l&#39;adhérence de novo de cellules endothéliales en suspension sur de la fibronectine purifiée et (ii) déclenche cellule-matrice de -adhesion dans les cellules endothéliales avec adhérence établie sur la fibronectine. En effectuant la signalisation cellulaire parallèle des analyses au fil du temps en utilisant Biochem pertinentesdosages iCal (par exemple, Western blot), les relations temporelles et causales entre les processus adhérence / de-adhésion et les changements associés à la signalisation cellulaires événements d&#39;adhésion dépendant peuvent être déterminées. Ces approches ont été récemment utilisés pour démontrer que l&#39;oxydation de la matrice extracellulaire catalysée par les dépôts sous-endothéliaux de MPO déclenche une perte rapide de la cellule-matrice adhésion des cellules endothéliales qui est entraîné par des forces contractiles actomyosine préexistants 9. Fait important, en permettant à la relation temporelle entre les changements à la fois dans l&#39;adhérence cellulaire et de signalisation à déterminer l&#39;adhésion cellulaire dépendante, ces approches ont identifié que la modification de la matrice MPO induite et cellulaire de-adhérence déclenche changements de signalisation cellulaires voies importantes d&#39;adhérence dépendant notamment Src kinase dépendante de la phosphorylation paxilline et chaîne légère de myosine II phosphorylation (Figure 1) 9. Ce mode de signalisation redox dépendantes, invÉSOLUTION l&#39;activation des événements de signalisation intracellulaire par des réactions d&#39;oxydation extracellulaires qui perturbent l&#39;adhérence cellule-matrice, représente un nouveau mode de signalisation cellulaire appelée &quot;outside-in signalisation redox&quot; (figure 1) 9. En général, ceux-ci complémentaire biocapteur de l&#39;impédance cellule-substrat et des approches d&#39;imagerie des cellules devraient être utiles pour révéler comment différents stimuli ou des agents matriciels modificateurs de route changements dans la dynamique de l&#39;adhérence cellulaire, la morphologie et de signalisation au sein de différents types de cellules adhérentes soumises à une grande variété de paramètres expérimentaux. Le protocole suivant décrit comment quantifier l&#39;impact de l&#39;oxydation de la matrice MPO médiation de novo sur l&#39;adhérence des cellules endothéliales (Experiment 1) et la cellule de-adhésion endothéliale (Experiment 2) des processus. MPO se lie avec avidité à la fibronectine et d&#39;autres protéines de la matrice extracellulaire sous-endothéliaux et nous adhésiveses peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2) pour convertir les ions chlorure (Cl -) à la très réactif chloration oxydante de l&#39;acide hypochloreux (HOCl), qui réagit à proximité de ces protéines de la matrice et perturbe les propriétés adhésives de la cellule (Figure 1) 8,9, 12.

<table><tbody><tr><td>Réseau de microélectrodes d’impédance cellule-substrat en or à 96 puits</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td>E-Plate 96</td><td>plaque à usage unique utilisée pour la réalisation d’essais cellulaires sur le système xCELLigence</td></tr><tr><td>blebbistatine</td><td>Sigma</td><td>B0560</td><td>inhibiteur sélectif de la myosine non musculaire-II</td></tr><tr><td>Cellules endothéliales aortiques bovines, cryoconservées&nbsp ;</td><td>Lonza</td><td>BW-6001</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Kit de milieu de croissance cellulaire endothéliale</td></tr><tr><td>Fibronectine, poudre lyophilisée</td><td>Sigma</td><td>F-4759</td><td>à partir de plasma bovin</td></tr><tr><td>Fluorodish 35 mm Boîte de culture cellulaire à fond de verre</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Boîte de cuture cellulaire avec fond en verre de qualité optique pour l’imagerie</td></tr><tr><td>Gélatine de peau de bovin</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>substrat de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Hank’s Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Merck</td><td>107298</td><td></td></tr><tr><td>Medium-199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>Milieu cellulaire sans sérum</td></tr><tr><td>Méthionine</td><td>Sigma</td><td>M9500</td><td>éteint les oxydants chlorants générés par la myéloperoxydase</td></tr><tr><td>, la myéloperoxydase, les leucocytes polynucléaires humains</td><td>Millipore</td><td>475911</td><td></td></tr><tr><td>RTCA MP Instrument / xCELLigence système d’impédance de substrat cellulaire</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td></td><td>Se compose d’un analyseur RTCA, d’une station MP RTCA (plaques multiples) et d’une unité de contrôle RTCA</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,5 %)</td><td>Gibco</td><td>15400-054&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisant une impédance cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et de-adhérence induites par matrix modification

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

L&#39;adhérence cellule-matrice jouent un rôle clé dans le contrôle de la morphologie cellulaire et de signalisation. Les stimuli qui perturbent l&#39;adhérence cellule-matrice (par exemple, la myéloperoxydase et d&#39;autres oxydants de matrice modificateur / enzymes libérées au cours de l&#39;inflammation) sont impliqués dans le déclenchement des changements pathologiques dans la fonction cellulaire, le phénotype et la viabilité dans un certain nombre de maladies. Ici, nous décrivons comment impédance cellule-substrat et les approches d&#39;imagerie des cellules peuvent être facilement utilisés pour quantifier avec précision les changements en temps réel dans l&#39;adhésion cellulaire et de-adhérence induite par modification de la matrice (en utilisant des cellules endothéliales et myéloperoxydase comme un stimulus de matrice modifier physiopathologique) avec une résolution temporelle élevée et d&#39;une manière non-invasive. Le système de l&#39;impédance cellule-substrat xCELLigence quantifie en continu la zone d&#39;adhérence cellule-matrice, en mesurant l&#39;impédance électrique à l&#39;interface cellule-substrat dans les cellules cultivées sur des réseaux de microélectrodes or. L&#39;analyse des images du time-lapse différenLes films tiel de contraste d&#39;interférence de quantifier l&#39;évolution de la surface projetée de cellules individuelles dans le temps, représentant les changements dans la zone de contact cellule-matrice. Les deux techniques de quantifier avec précision les changements rapides aux processus d&#39;adhésion cellulaire et de-adhérence. Impédance Cell-substrat sur les tableaux de microélectrodes biocapteurs fournit une plate-forme pour des mesures robustes, à haut débit. Analyse imagerie des cellules vivantes fournir des détails supplémentaires concernant la nature et la dynamique des changements morphologiques quantifiés par des mesures d&#39;impédance cellule-substrat. Ces approches complémentaires fournissent de précieuses informations sur la façon dont la modification oxydative myéloperoxydase catalysée subcellulaires composants de la matrice extracellulaire déclenche des changements rapides dans l&#39;adhésion cellulaire, la morphologie et de signalisation dans les cellules endothéliales. Ces approches sont également applicables pour l&#39;étude de la dynamique d&#39;adhésion cellulaire en réponse à des stimuli autres modificateurs de matrice et des cellules adhérentes connexes (par exemple, des cellules épithéliales).

Quantification en temps réel des cellules endotheliales de-adhérence de fibronectine, en réponse à l&#39;oxydation de la fibronectine MPO médiée (Expérience 2). L&#39;ensemencement des suspensions de cellules endotheliales sur native (MPO libre) fibronectine ou MPO portant les résultats de la fibronectine dans l&#39;attachement cellulaire maximale et d&#39;étalement moins de 2 heures, tel que jugé par un plafonnement des valeurs d&#39;index de cellule de la mesure de l&#39;impédance du substrat cellulai...

Ici, nous présentons un protocole de quantifier en permanence les processus d&#39;adhésion cellulaire et de-adhésion avec haute résolution temporelle d&#39;une manière non-invasive par l&#39;impédance cellulaire substrat et imagerie des cellules vivantes analyses. Ces approches révèlent la dynamique des processus adhésion cellulaire / de-adhérence déclenchées par modification de la matrice et de leur relation temporelle à des événements de signalisation adhérence dépendant.

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de quantifier en temps réel les changements rapides de l'adhésion cellulaire à la matrice chez des cellules endothéliales exposées à des agents modificateurs de la matrice, en utilisant l'impédance cellule-substrat et l'imagerie de cellules vivantes. Dans cette expérience, l'enzyme hémique myéloperoxydase est utilisée comme agent modificateur de la matrice ayant une pertinence pathophysiologique. Ceci est réalisé en recouvrant d'abord des surfaces avec de la fibronectine afin de fournir un substrat matriciel adhésif.On laisse ensuite la myoperoxydase ou MPO se lier à la fibronectine. Puis, les cellules endothéliales en suspension sont déposées sur les surfaces et incubées afin d'obtenir une adhérence maximale des cellules et leur expansion sur la fibronectine. Ensuite, les cellules sont exposées au peroxyde d'hydrogène afin d'initier l'oxydation de la fibronectine médiée par la MPO.Les changements rapides subséquents dans l’adhérence cellulaire à la matrice sont ensuite quantifiés en temps réel à l’aide de l’impédance cellule-substrat et de l’analyse d’imagerie en temps réel des cellules vivantes. Les résultats montrent que les pertes rapides d’adhérence matricielle des cellules endothéliales induites par l’oxydation de la fibronectine médiée par les NPO peuvent être quantifiées en temps réel avec une haute résolution temporelle et sans marquage, par impédance cellule-substrat et imagerie de cellules vivantes. L’avantage de ces techniques réside dans leur capacité à quantifier de manière continue les variations d’adhérence cellulaire à la matrice avec une haute résolution temporelle, ce qui permet d’obtenir de nouvelles informations essentielles sur la manière dont les modifications de la matrice induisent des changements en aval dans la morphologie cellulaire et les voies de signalisation dépendantes de l’adhérence.Les protocoles revêtent une importance plus large dans la mesure où ils peuvent être facilement adaptés en remplaçant la MPO par d'autres agents modificateurs de la matrice, tels que des protéases ou des matrices de commutation, ou en utilisant des types cellulaires adhérents autres que les cellules endothéliales, comme les cellules épithéliales. Pour commencer, ajoutez 80 microlitres par puits de fibronectine pour recouvrir des matrices de microélectrodes dorées de 96 puits destinées à des mesures d'impédance cellulaire sur substrat, ou ajoutez deux millilitres de fibronectine dans des boîtes de culture cellulaire à fond en verre pour une analyse d'imagerie de cellules vivantes. Incubez les matrices et/ou les boîtes de culture à 37 degrés Celsius pendant deux heures.Ensuite, pour bloquer les surfaces, ajouter 0,2 % de BSA et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures supplémentaires. Puis, ajouter la myéloperoxydase humaine purifiée dans du HBSS et incuber pendant 30 minutes. Ensuite, utiliser du HBSS pour laver les surfaces deux fois afin d'éliminer toute MPO non liée.Ensuite, observez 250 000 cellules par millilitre de cellules endothéliales en suspension préparées selon le protocole décrit dans le texte, déposées sur des réseaux microélectrodes à impédance pour cellules en plaques de 96 puits, présentant des surfaces revêtues de fibronectine native ou portant la MPO. Pour les boîtes de culture cellulaire de 35 millimètres à fond en verre, ajoutez deux millilitres de suspension contenant 500 000 cellules par millilitre. Immédiatement après l’ensemencement des cellules, placez les plaques équipées de réseaux microélectrodes sur le port de l’incubateur à impédance cellulaire, à 37 degrés Celsius et sous 5 % de dioxyde de carbone.Et effectuez des mesures à vide pour initier l'acquisition continue des données d'indice cellulaire. Transférez les boîtes de culture cellulaire de 35 millimètres avec fond en verre dans un incubateur à 35 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Incubez pendant deux heures afin de permettre une fixation et une étendue cellulaires maximales.Après l'incubation, interrompez temporairement les lectures de l'indice cellulaire et retirez brièvement la plaque à microélectrodes ou la boîte à fond en verre de l'incubateur, aspirez le surnageant et ajoutez du HBSS réchauffé afin d'examiner les effets des inhibiteurs, des modulateurs de la MPO, des réactions catalysées ou des inhibiteurs de la signalisation cellulaire. Ajoutez-les aux cultures. Replacez immédiatement la plaque à microélectrodes dans le port de l'incubateur ou la boîte à fond en verre dans l'incubateur, puis laissez les cellules s'équilibrer pendant 30 minutes.Pour initier l'oxydation de la fibronectine dépendante de l'acide hypochloreux catalysée par la NPO et la désadhérence cellulaire pour des études d'impédance, retirez la plaque à microélectrodes de l'incubateur et mettez en pause les mesures d'indice cellulaire. Ajoutez du peroxyde d'hydrogène au HBSS et mélangez délicatement par pipetage répété, puis remettez immédiatement la matrice de microélectrodes dans le port de l'incubateur et redémarrez les lectures d'indice cellulaire pour des études d'imagerie en temps réel utilisant des boîtes en verre de 35 millimètres à fond en verre. Après avoir retiré la boîte de l'incubateur, montez-la sur une platine chauffée à 37 degrés Celsius d'un microscope confocal inversé, équipé d'un objectif à immersion dans l'eau de 63 x.Et optique DIC Pour enregistrer des films de cellules vivantes, focalisez-vous sur les cellules et optimisez l'optique DIC conformément aux directives référencées ici. Lancez l'enregistrement du film DIC et enregistrez les valeurs de référence des cellules non traitées pendant une minute, puis ajoutez du peroxyde d'hydrogène et mélangez délicatement par pipetage répété, recentrez le microscope et poursuivez l'enregistrement de films DIC des cellules traitées pendant la durée requise. Pour analyser les données d'impédance cellule-substrat, commencez par exporter les données dans un tableur pour l'adhésion cellulaire.Les études normalisent les données en fixant à un les valeurs enregistrées immédiatement avant le début de l'oxydation de la fibronectine médiée par MPO, puis présentent les données sous forme de courbes d'indice cellulaire normalisé en fonction du temps afin d'analyser les données d'imagerie de cellules vivantes. Ouvrez dans un logiciel d'analyse d'images tel qu'ImageJ au moins deux films distincts d'imagerie de cellules vivantes en contraste interférentiel différentiel (DIC) enregistrés immédiatement avant et après le début de l'oxydation de la fibronectine médiée par MPO, sélectionnez aléatoirement plusieurs cellules et mesurez leur surface projetée sur des images consécutives en traçant manuellement le contour de leur membrane et en quantifiant le nombre de pixels inclus. Enfin, présentez les données sous forme de courbe de la surface cellulaire normalisée en fonction du temps. L'adhésion de suspensions de cellules endothéliales sur de la fibronectine ou de la fibronectine portant de la MPO conduit à une fixation maximale des cellules et à une extension maximale en deux heures, comme en témoigne le plateau des valeurs d'indice cellulaire dans l'interaction cellule-substrat.Les mesures d'impédance, une fois l'adhérence cellulaire maximale établie sur la fibronectine native ou portant des NPO, montrent qu'une oxydation ciblée de la fibronectine, médiée par l'acide hypochloreux catalysé par les NPO et initiée par l'ajout du substrat cosubstrat des NPO, le peroxyde d'hydrogène, provoque une diminution rapide de la surface de contact matrice-cellule, mesurée par l'impédance cellule-substrat et par imagerie de cellules vivantes. Comme illustré ici, la désadhérence cellulaire rapide observée dans les cellules endothéliales liées à la fibronectine portant des NPO en réponse au traitement par le peroxyde d'hydrogène est absente dans les cellules traitées au peroxyde d'hydrogène seul. L'inhibition de la fonction du moteur myosine II par la statine BLE inhibe la vitesse de désadhérence des cellules endothéliales, mesurée par l'impédance cellule-substrat et par imagerie de cellules vivantes, ce qui indique que la désadhérence cellulaire et la contraction en réponse à l'oxydation matricielle sous-cellulaire catalysée par la MPO sont entraînées par des forces tensiles acto-myosine. Étant donné que ces méthodes permettent de mesurer précisément des changements très rapides dans l'adhérence cellulaire, elles peuvent fournir des informations essentielles sur les relations causales entre les modifications de l'adhérence et les changements ultérieurs dans les processus de signalisation dépendants de l'adhérence, tels que la phosphorylation de SARK ou la signalisation des adhérences focales, qui peuvent être facilement mesurés dans des expériences parallèles au cours du temps par immunobuvardage Western.

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