Détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans Saccharomyces cerevisiae

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer rapidement les exigences génétiques pour la dégradation d’une protéine instable chez Croce Visier. Ceci est réalisé en fusionnant une enzyme rapporteure nécessaire à la croissance dans des conditions sélectives spécifiques avec une protéine instable d’intérêt. Ensuite, des cellules de type sauvage ou mutantes, toutes deux exprimant la protéine de fusion, sont cultivées sur des plaques de gélose moyenne sélective.

Le test de placage fournit un indicateur pratique de la stabilisation des protéines sur la base de la croissance des cellules de levure afin de confirmer biochimiquement les différences dans l’abondance des protéines tandis que le type dans les cellules mutantes hébergeant la protéine de fusion est lysé via une méthode d’extraction de protéines rapide et inefficace pour l’analyse par transfert Western. Les résultats montrent que l’abondance d’une protéine instable est augmentée dans les cellules présentant une mutation dans un gène nécessaire à la dégradation. L’inverse est vrai pour les souches de type sauvage compétentes en matière de dégradation.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les analyses de poursuite d’impulsion et de poursuite de Cycl heide est qu’elle nécessite moins de main-d’œuvre et de temps, ce qui permet de déterminer rapidement et à haut débit les exigences génétiques pour la dégradation des protéines. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les exigences de dégradation d’une gamme de protéines instables. Il peut également être utilisé pour identifier les régulateurs d’autres aspects de l’expression des gènes tels que la transcription et la traduction.

Sheldon Watts et Justin Crowder feront la démonstration des procédures. Avant le test, les étudiants de mon laboratoire transforment un plasmide codant pour une protéine de fusion composée d’une protéine instable et d’une enzyme rapporteure métabolique en une souche de levure mutante. Suspectés d’avoir des défauts génétiques liés à la régulation de la dégradation des protéines en tant que contrôle, transforment également le même plasmide en une souche de levure de type sauvage.

Inoculez les transformants dans cinq millilitres de milieu minimal qui sélectionne les cellules, hébergeant les molécules plasmidiques. Placez le tube à essai dans un rotateur incliné et incubez toute la nuit à 30 degrés Celsius le lendemain. Mesurez la densité optique des cultures de nuit, puis égalisez la concentration cellulaire de toutes les cellules en diluant chaque culture à une DO 600 de 0,2 avec des milieux frais et des tubes à centrifuger individuels stériles de 1,5 millilitre.

Pour commencer l’essai principal, mettre en place une matrice de série de dilution sextuple en transférant d’abord 200 microlitres de chaque souche pré-diluée, à partir d’une DO 600 de 0,2 dans les puits désignés dans la première colonne d’une plaque stérile à 96 puits en préparation des dilutions ultérieures, utiliser une pipette multicanaux pour ajouter 125 microlitres d’eau stérile dans les puits vides de la deuxième colonne, trois, et quatre. Ensuite, transférez 25 microlitres de levure de la colonne un dans la colonne deux, pipetez de haut en bas plusieurs fois pour mélanger les cellules uniformément et procédez au transfert de 25 microlitres de cellules de la colonne deux à la colonne trois. Répétez les étapes de dilution en série jusqu’à ce que les puits de la colonne quatre soient bien mélangés comme aide visuelle pour le repérage cellulaire.

Imprimez un modèle de grille et collez-le à l’intérieur d’un couvercle de boîte de Pétri, en commençant par la colonne la moins concentrée dans la matrice de dilution en série. Transférez quatre microlitres de cellules de chaque colonne. Sur la plaque à 96 puits sur une plaque de gélose moyenne minimale de contrôle qui sélectionne pour l’entretien du plasmide intracellulaire Repérez quatre autres microlitres de cellules de chaque colonne sur une plaque de gélose moyenne minimale distincte qui sélectionne les deux plasmides intracellulaires.

Maintenance et expression de la protéine de fusion instable. Laissez les deux assiettes sécher sur le banc pendant cinq à 10 minutes. Fermez les couvercles avec param pour éviter la déshydratation et incubez les cellules à 30 degrés Celsius pendant deux à six jours.

Lorsque les colonies de la culture à la croissance la plus rapide deviennent visibles pour la première fois à l’endroit le plus dilué d’une plaque donnée, retirez la plaque de l’incubateur et documentez l’étendue de la croissance. En prenant des photos, il peut être nécessaire de prendre des photos de différentes plaques à des jours différents ou d’une même plaque sur plusieurs jours. Dans le cas de différentes souches de levure qui présentent une large gamme de taux de croissance, ainsi confirmé biochimiquement qu’un gène identifié dans l’essai de croissance régule l’abondance des protéines, commencez par transformer les souches de levure de type sauvage et mutantes avec un plasmide codant pour la protéine de fusion susmentionnée, inoculez les transformants dans cinq millilitres de milieu minimal qui sélectionne pour l’entretien du plasmide intracellulaire et incubez les tubes pendant la nuit dans un rotateur incliné à 30 degrés Celsius.

Le lendemain, mesurez la densité optique à 600 de chaque culture nocturne. Une fois que toutes les souches ont atteint une OD 600 de 0,4 ou plus, diluez toutes les cultures à 0,2 avec un milieu frais de sorte que le volume final de chaque souche soit de 10 millilitres. Incuber les cellules sur une plate-forme à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que toutes les cultures atteignent une croissance en phase mi-logarithmique OD 600, entre 0,8 et 1,2.

Récoltez une cellule en transférant 2,5 unités de diamètre extérieur totales de cellules dans un tube conique frais de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à température ambiante pendant cinq minutes et retirez le surnageant S. Ajoutez ensuite un millilitre de vortex d’eau distillée ou une pipette de haut en bas pour remettre le palais en suspension et transférez la suspension cellulaire dans un tube frais de 1,5 millilitre.

Isolez les cellules avec la deuxième centrifugation pendant 30 secondes À température ambiante, retirez le piège et remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres d’eau distillée. Ajoutez 100 microlitres d’hydroxyde de sodium 0,2 molaire à la suspension cellulaire, pipetez de haut en bas à quelques reprises pour mélanger et incubez les échantillons pendant cinq minutes à température ambiante pour éviter une lyse cellulaire prématurée. Ne vortex pas les cellules.

Isolez à nouveau les cellules avec une troisième centrifugation pendant 30 secondes. À température ambiante, retirez les surnageants des cellules et lys les cellules en ressuscitant en suspendant la pastille dans 50 à 100 microlitres d’un tampon d’échantillon x lamby dénaturez toutes les protéines en incubant la suspension à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez le lysat cellulaire entier sur de la glace pendant cinq minutes. Pour mesurer l’abondance des protéines sujettes à l’agrégation, telles que les protéines à plusieurs segments transmembranaires, déterminez empiriquement l’incubation, la température et le temps de dénaturation optimaux en commençant à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes au lieu de 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Enfin, isolez la fraction soluble en centrifugeant le lysat pendant une minute à température ambiante, transférez le snat dans un tube frais et jetez la fraction insoluble des pastilles. La fraction soluble peut désormais être chargée directement sur une page FDS, sur un gel ou stockée à moins 20 degrés Celsius lors de la mise en place d’un test de dégradation des protéines basé sur la croissance de levure. Une protéine de triple fusion instable est fusionnée avec une enzyme métabolique supplémentaire qui complète le fond de la souche de levure dépourvue du même gène métabolique.

Lorsque la protéine de fusion est exprimée dans la levure, elle est sujette à des événements de translocation stérile au niveau de la membrane du réticulum endoplasmique. Cette translocation aberrante déclenche la dégradation de la protéine entière, y compris l’enzyme métabolique, par l’intermédiaire de l’ubiquitine, empêchant ainsi la prolifération cellulaire. Cependant, dans les souches de levure dépourvues d’ubiquitine ligase, la protéine de fusion est protégée de la dégradation, même en cas de translocation moyenne, permettant aux cellules de proliférer.

Par conséquent, en présence d’ubiquitine ligase, il existe une correspondance entre la dégradation des protéines qui se produit à l’intérieur des cellules et l’incapacité des cellules de levure à proliférer sur des plaques de gélose appauvries en métabolites. D’autre part, dans le contexte d’une ubiquitine ligase défectueuse ou absente, la prolifération cellulaire indique que la protéine de fusion a été protégée de la dégradation pour réduire la croissance de fond ou parasite et augmenter la rigueur de ce test. Des inhibiteurs compétitifs de l’enzyme métabolique peuvent être ajoutés au milieu de croissance pour confirmer les résultats observés dans l’essai de croissance sur levure.

Une preuve directe de dégradation des protéines de fusion peut également être vérifiée à l’aide d’un transfert Western. En présence ou en l’absence d’ubiquitine ligase, la protéine de fusion sera dégradée ou épargnée de la destruction respectivement. Il est important de se rappeler que ces procédures rendent compte le plus directement de l’abondance à l’état d’équilibre de la protéine d’intérêt.

Après la réalisation de ces procédures, des analyses d’impulsions ou de chasse au cycloheximide peuvent être effectuées afin d’analyser directement la cinétique de dégradation des protéines et la présence de mutations trouvées pour augmenter les niveaux de protéines à l’état d’étude.