Name: Détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans Saccharomyces cerevisiae (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Découvrez un test de croissance chez Saccharomyces cerevisiae pour identifier les gènes requis pour la dégradation des protéines instables. Cette méthode combine un criblage phénotypique rapide et une confirmation par Western blot.

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Nous remercions les membres actuels et anciens du laboratoire Rubenstein pour fournir un environnement de recherche et enthousiaste. Nous remercions Ryan T. Gibson pour l&#39;assistance dans l&#39;optimisation de protocole. Nous remercions Mark Hochstrasser (Université de Yale) et Dieter Wolf (Universität Stuttgart) pour les souches de levures et plasmides. Nous remercions nos lecteurs anonymes pour leur aide dans l&#39;amélioration de la clarté et l&#39;utilité de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse de recherche de la section de l&#39;Université Ball State de Sigma Xi à SGW, un National Institutes of Health subvention (R15 GM111713) au DME, une bourse de recherche de Ball State University aspirent à DME, et les fonds de l&#39;Université Ball State Bureau du prévôt et Département de biologie.

1. levure croissance essai pour identifier des mutants candidats défectueux dans la dégradation des protéines <ol><li> Transform de type sauvage et des cellules de levure mutantes avec un plasmide codant pour une protéine fusionnée instable, en cadre, à une enzyme reporter métabolique. </li><li> Ensemencer transformants dans 5 ml de synthèse défini (SD) de milieu minimal qui est sélectif pour les cellules portant des molécules plasmidiques. Incuber pendant une nuit à 30 ° C, en rotation. </li><li> Mesurer la densité optique à 600 nm (DO600) de chaque culture d&#39;une nuit. REMARQUE: Après incubation pendant une nuit, les cellules en culture peut être soit en phase de croissance logarithmique ou stationnaire, mais devrait avoir atteint une DO 600 de 0,2 minimal. Souches de levure à croissance très lente peuvent nécessiter des temps d&#39;incubation plus d&#39;une nuit, ou l&#39;inoculation d&#39;un plus grand nombre de cellules, tel que déterminé de manière empirique. </li><li> Préparer six dilutions en série de cellules de levure transformées dans une plaque à 96 puits stériles, à partir de cellules diluées à unen DO600 de 0,2. Placez chaque transformant de levure à doser dans un enregistrement différent de la plaque de 96 puits. <ol><li> Pour chaque transformant, on calcule le volume de culture d&#39;une nuit nécessaire pour diluer les cellules à une DO 600 de 0,2 dans un volume final de 200 ul. Ajouter ce volume de culture de la nuit à l&#39;puits correspondant dans la colonne 1. Ajouter la quantité appropriée de l&#39;eau stérile pour porter le volume à 200 pi. </li><li> Pour chaque ligne de la levure, ajouter 125 pi d&#39;eau stérile pour les puits dans les colonnes 2, 3 et 4. REMARQUE: des plaques à 96 puits stériles emballés individuellement peuvent être emballés avec des couvercles stériles. Les couvercles peuvent être utilisés comme réservoirs pour l&#39;eau stérile qui est répartie dans cette étape. Ceci permet un transfert simultané de l&#39;eau stérile à tous les puits dans une colonne donnée avec une pipette à canaux multiples. </li><li> Mélanger le contenu de la première colonne (levure diluée jusqu&#39;à une DO 600 de 0,2) par pipetage de haut en bas avec une pipette à canaux multiples. </li><li> Transfer 25 pi de levure de la colonne 1 à la colonne 2, en utilisant une pipette multicanaux. Mélanger en pipetant. Transfert 25 ul de la colonne 2 à la colonne 3, et 25 pi de la colonne 3 à la colonne 4 (en mélangeant bien à chaque étape). </li></ol></li><li> Mélanger chaque échantillon avec une pipette multicanaux. Partant de la plus diluée pour diluer moins colonnes de levure, une pipette 4 pi de chaque échantillon sur deux plaques contenant le milieu sélectif approprié. Utilisez une plaque avec un milieu qui maintient sélection de plasmide (cette plaque sert de taches de levure et le contrôle de la croissance). Utiliser une seconde plaque avec un milieu qui sélectionne pour le maintien du plasmide et l&#39;expression de la protéine instable fusionné à l&#39;enzyme rapporteur. Parce que la levure se installer rapidement, mélanger les cellules par pipetage de haut en bas à intervalles réguliers. NOTE: Séchoir plaques seront plus facilement absorber le liquide que les plaques fraîchement préparés et sont donc recommandés pour ces expériences. Plaques humides peuvent être séchés par incubation à température ambiante dans lol&#39;humidité w pour 1-2 jours ou incubations courtes dans une hotte à flux laminaire. Plaques peuvent sécher inégalement si le flux d&#39;air laminaire est parallèle à la magistrature. Utilisation d&#39;un gabarit, il est plus facile de repérer les cellules de levure à des distances régulières. Deux exemples de modèles sont fournis à la figure 1. Ceux-ci peuvent être imprimés, découpés et fixés à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Petri couvercle. </li><li> Permettre aux plaques à sécher sur la paillasse. </li><li> Incuber les plaques à 30 ° C pendant 2-6 jours. </li><li> Photographier chaque plaque après incubation. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> Figure 1. Modèles pour repérer des cellules de levure sur des plaques d&#39;agar de 100 mm. Ces modèles peuvent être utilisés pour faciliter repérer la levure à des distances régulières avec une pipette multicanaux. Les modèles peuvent être imprimés, découpés et fixés à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Petri couvercle. Placez boîte de Pétri avec la croissanceintérieur du couvercle moyenne avec modèle apposé. Les modèles sont marqués d&#39;une encoche pour suivre l&#39;orientation. Il est recommandé que les plaques utilisées dans des dosages de croissance être marqués de manière similaire avec une encoche pour suivre l&#39;orientation. Modèles pour repérer quatre (A) ou cinq (B) des dilutions en série de cellules de levure sont fournis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">Se il vous plaît cliquez ici pour afficher une version imprimable de ce chiffre avec 100 mm modèles.</a> 2. Confirmation biochimique de croissance de la levure Assay <ol><li> La croissance des cellules de levure et d&#39;extraction de protéines post-alcaline (modifiée du 31) <ol><li> Transform de type sauvage et des cellules de levure mutantes avec un plasmide codant pour la protéine instable. </li><li> Ensemencer les transformants dans 5 ml de milieu SD qui est sélectif pour les cellules hébergeant molécules de plasmide. Incuber pendant une nuit à 30 ° C, en rotation. </li><li> Mesurer la DO 600 de chaque cu nuitlture. REMARQUE: Après incubation pendant une nuit, les cellules peuvent être soit en phase de croissance logarithmique ou stationnaire, mais devrait avoir atteint une DO 600 qui permettra dilution jusqu&#39;à une DO 600 de 0,2 à 10 ml de milieu sélectif frais (étape 2.1.4). Souches de levure à croissance très lente peuvent nécessiter des temps d&#39;incubation plus d&#39;une nuit, ou l&#39;inoculation d&#39;un plus grand nombre de cellules, tel que déterminé de manière empirique. </li><li> Diluer les cellules de levure à une DO 600 de 0,2 à 10 ml de milieu sélectif frais. </li><li> Continuer à incuber les cellules à 30 ° C, la rotation ou l&#39;agitant, jusqu&#39;à cultures atteignent une DO 600 entre 0,8 et 1,2 (ce est à dire sont en croissance mi-logarithmique). NOTE: Si la protéine d&#39;intérêt est instable sous le contrôle d&#39;un promoteur régulable, le moment optimal pour l&#39;induction de l&#39;expression de la protéine et la récolte des cellules peut varier selon les études antérieures ou des observations empiriques. </li><li> Recueillir 2,5 OD 600 unités de la culture dans un 15 ml coniqueal tuyau par centrifugation à 5000 xg pendant 5 min à température ambiante. Retirer le surnageant par la pipette ou l&#39;aspiration. REMARQUE: Un DO600 unité est définie comme la quantité de levure présente dans 1 ml de culture à DO 600 de 1,0. Le volume de la culture (en ml) nécessaire pour récolter 2,5 OD 600 unités (V) peut être déterminée en utilisant l&#39;équation suivante: V = 2,5 unités DO 600 / DO mesurée 600 </li><li> Resuspendre les cellules dans 1 ml d&#39;eau distillée. Transfert cellules en suspension dans un tube à centrifuger. </li><li> Pellet les cellules par centrifugation à 6500 xg pendant 30 sec à température ambiante. Retirer le surnageant par la pipette ou l&#39;aspiration. </li><li> Resuspendre les cellules dans 100 pi d&#39;eau distillée à la pipette de haut en bas ou de vortex, et ajouter 100 ul NaOH 0,2 M. Mélanger en pipetant. Incuber les échantillons pendant 5 min à température ambiante. </li><li> cellules Pellet (dont la plupart ne ont pas encore libérés des protéines et sont encore viables) par centrifugation à 18 000 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant par la pipette ou l&#39;aspiration. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 50 - 100 pi de tampon d&#39;échantillon Laemmli 1x, qui lyser les cellules, par pipetage de haut en bas ou vortex. NOTE: L&#39;élimination du surnageant alcalin après la centrifugation et remise en suspension ultérieure des cellules dans du tampon d&#39;échantillon de Laemmli extrait de protéines à un pH compatible avec dodécylsulfate de sodium électrophorèse sur gel de sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) en utilisant un système tampon de roulement Tris-glycine et western blotting. </li><li> Pour dénaturer complètement protéines, incuber les lysats à 95 ° C pendant 5 min. NOTE: Agrégation protéines-protéines exposées (par exemple avec plusieurs segments transmembranaires) peuvent devenir insolubles lorsqu&#39;ils sont incubés à 95 ° C. Par conséquent, les lysats doivent être incubées à des températures plus basses (par exemple 37 ° C - 70 ° C) pendant 10 à 30 min, comme déterminé empiriquement, pour l&#39;analyse de ces protéines. </li><li> Lysats frais en le plaçant sur la glace pendant 5 min. </li><li> Lysats centrifuger à 18 000 g pendant 1 min à température ambiante pour obtenir un culot insoluble. Séparer le surnageant (extrait de protéine solubilisée) par SDS-PAGE avant l&#39;analyse western blot ultérieure (section 2.2). Alternativement, lysats de conserver à -20 ° C. </li></ol></li><li> Représentant Protocole Western Blot <ol><li> Charger le volume déterminé de manière empirique des lysats dans un gel de SDS-PAGE. </li><li> Exécuter gel à 200 V jusqu&#39;à ce que le colorant avant a atteint le fond du gel. </li><li> Transfert de protéines à partir de gel de fluorure de polyvinylidène (PVDF) par transfert humide à 20 V pendant 60 à 90 min à 4 ° C. </li><li> Bloquer membrane par incubation dans 5% de lait écrémé dans du Tris-solution saline tamponnée (TBS), bascule, pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Décanter la solution de blocage. </li><li> Incuber la membrane avec l&#39;anticorps primaire spécifique pour la protéine d&#39;intérêt (ou épitope tag de celui-ci) dans 1% de lait écrémé dans du TBS avec 0,1% de Tween-20 (TBS / T) pendant 1 h à la salle température, bascule. </li><li> Décanter solution d&#39;anticorps, et laver membrane 3 x 5 min avec le SCT / T à la température ambiante, à bascule. </li><li> Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore approprié dans 1% de lait écrémé dans du TBS / T pendant 1 heure à la température ambiante, à bascule. NOTE: En raison fluorophores sont sensibles à la lumière, des dilutions d&#39;anticorps fluorophores conjugué doivent être préparés dans l&#39;obscurité. En outre, l&#39;incubation de membranes en présence d&#39;anticorps conjugué à un fluorophore doit se produire dans des récipients étanches à la lumière. Ceci peut être réalisé en enroulant plateaux d&#39;incubation dans de l&#39;aluminium. </li><li> Décanter solution d&#39;anticorps, et laver membrane 3 x 5 min avec le SCT / T à la température ambiante, à bascule. </li><li> Acquérir image de membrane en utilisant Li-Cor Odyssey CLx et logiciel Image Studio (ou de l&#39;équipement d&#39;imagerie comparables et logiciels), selon les recommandations du fabricant. </li><li> Après l&#39;imagerie membrane, incuber la membrane avec un anticorps primaire spécifique d&#39;une chargeing protéine de contrôle dans 1% de lait écrémé dans du TBS / T pendant 1 heure à température ambiante, à bascule. </li><li> Décanter solution d&#39;anticorps, et laver membrane 3 x 5 min avec le SCT / T à la température ambiante, à bascule. </li><li> Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore approprié dans 1% de lait écrémé dans du TBS / T pendant 1 heure à la température ambiante, à bascule. </li><li> Décanter solution d&#39;anticorps, et laver membrane 3 x 5 min avec le SCT / T à la température ambiante, à bascule. </li><li> Acquérir image de membrane en utilisant Li-Cor Odyssey CLx et logiciel Image Studio (ou de l&#39;équipement d&#39;imagerie comparables et logiciels), selon les recommandations du fabricant. </li></ol></li></ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

La méthodologie présentée ici permet la détermination rapide et confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans des cellules de levure. Ces expériences mettent en évidence l&#39;utilité et la puissance de la levure comme modèle organisme eucaryote (plusieurs excellentes critiques de levure biologie et compilations de protocoles pour la manipulation, le stockage et la manipulation de cellules de levure (par exemple 41-44) sont disponibles pour les enquêteurs de...

La dégradation sélective des protéines est essentielle à la vie eucaryote, et la dégradation de la protéine altérée contribue à un certain nombre de maladies, y compris plusieurs types de cancer, les maladies neurodégénératives, les maladies cardiovasculaires, et la fibrose kystique 1-5. Le système ubiquitine-protéasome (UPS), qui catalyse la dégradation sélective des protéines, est une cible thérapeutique émergeant de ces conditions 6-10. ubiquitine ligases attachent de manière covalente des polymères de l&#39;acide 76-ubiquitine aminés aux protéines 11. Les protéines qui ont été marqués avec des chaînes de polyubiquitine sont reconnus et protéolysée par les ~ 2,5 mégadaltons protéasome 26S 12. Études initiées dans l&#39;organisme eucaryote modèle Saccharomyces cerevisiae (levure en herbe) ont été fondamental dans l&#39;élucidation des mécanismes de dégradation des protéines dans les cellules eucaryotes. Le premier substrat physiologique démontré de l&#39;onduleur était la levure répresseur transcriptionnel MATα2 13, 14, et de nombreux composants hautement conservées de la première UPS ont été identifiés ou caractérisés dans la levure (par exemple 15-26). Les découvertes faites dans cet organisme modèle polyvalent et génétiquement traitable sont susceptibles de continuer à fournir des informations importantes sur les mécanismes conservés de la dégradation des ubiquitine. Reconnaissance et de la dégradation de la plupart des substrats UPS requièrent une action concertée de plusieurs protéines. Par conséquent, un objectif important dans la caractérisation de la dégradation régulée d&#39;une protéine donnée est instable pour déterminer les exigences génétiques pour la protéolyse. Les approches classiques (par exemple pulse-chase et expériences cycloheximide-chase 27) pour surveiller la dégradation des protéines dans des cellules de mammifère ou de levure sont laborieuses et prennent du temps. Bien que ces types de méthodologie fournissent des moyens très sensibles pour détecter la dégradation des protéines, ils ne conviennent pas pour l&#39;analyse rapide de la dégradation des protéines ou à grande échelle screening pour les mutations qui empêchent la dégradation des protéines. Ici, une analyse basée sur la croissance de la levure pour l&#39;identification rapide des exigences génétiques pour la dégradation des protéines instables est présentée. Dans la méthode de la croissance de la levure pour l&#39;analyse de la dégradation des protéines, une protéine instable d&#39;intérêt (ou un signal de dégradation) est fusionnée, en cadre, à une protéine qui est nécessaire pour la croissance de la levure dans des circonstances particulières. Le résultat est un substrat artificiel qui peut servir comme un outil puissant pour déterminer les exigences génétiques de la dégradation des protéines de la protéine d&#39;intérêt instable. Idéalement, les souches de levure de laboratoire les plus couramment utilisés abritent un panel de mutations dans les gènes codant pour des enzymes métaboliques impliquées dans la biosynthèse de certains acides aminés ou de bases azotées (par exemple, 20,28-30). Ces enzymes sont essentiels pour la prolifération cellulaire en l&#39;absence de métabolites dans exogène prévues dont la synthèse des enzymes participent. Telenzymes métaboliques peuvent ainsi fonctionner comme rapporteurs basées sur la croissance de la dégradation des protéines instables à laquelle ils sont fusionnés. Les exigences génétiques pour la dégradation des protéines peuvent être aisément élucidés, puisque des mutations qui empêchent la protéolyse permettront cellules hébergeant le reporter de dégradation de se développer dans des conditions sélectives. Un avantage de croissance est une indication indirecte qu&#39;une mutation particulier augmente l&#39;abondance de la protéine d&#39;intérêt. Cependant, l&#39;analyse biochimique directe est nécessaire pour confirmer qu&#39;une mutation permet la croissance à travers des niveaux accrus en protéines plutôt que par des causes indirectes ou artefacts. L&#39;effet d&#39;une mutation sur la protéine abondance peut être confirmée par analyse western blot des niveaux de protéines à l&#39;état stable dans les cellules qui font et ne abritent la mutation particulière. Procédé pour l&#39;extraction rapide et efficace de protéines de levure (incubation séquentielle de cellules de levure avec de l&#39;hydroxyde de sodium et un tampon échantillon) sous une forme adaptéepour analyse par western blot est également présenté 31. Ensemble, ces expériences faciliter l&#39;identification rapide des régulateurs de candidats de la dégradation des protéines.

<table><tbody><tr><td>Souches de levure, plasmides, milieux standard et composants</td><td></td><td></td> tampons <td>souhaités Les souches de levure présentant les mutations souhaitées peuvent être générées dans le laboratoire de l’investigateur. Des levures de type sauvage et une variété de mutants sont également disponibles dans le commerce ( par exemple auprès de GE Healthcare). Des plasmides codant pour des protéines de fusion peuvent être générés dans le laboratoire de l’investigateur.</td></tr><tr><td>3-amino-1H-1,2,4-triazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC264571000</td><td>Inhibiteur compétitif de l’enzyme His3. Peut être inclus dans un essai de croissance moyen à augmenter à l’aide des constructions de rapporteur His3.</td></tr><tr><td>L’endoglycosidase H (forme recombinante de Streptomyces plicatus)</td><td>Roche</td><td>11088726001</td><td>Peut être utilisée pour évaluer la N-glycosylation des protéines ; compatible avec les concentrations de SDS et de bêta-mercaptoéthanol trouvées dans 1x tampon d’échantillon Laemmli.</td></tr><tr><td>Tubes jetables en verre borosilicaté</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Disponible auprès d’une variété de fabricants</td></tr><tr><td>Incubateur à température régulée (p. ex. Incubateur Heratherm Modèle IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Disponible auprès d’une variété de fabricants</td></tr><tr><td>Nouveau-Brunswick Tambour interchangeable pour tubes de 18 mm (rouleau tubulaire)</td><td>Nouveau-Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Il est recommandé d’utiliser un rouleau tubulaire pour maintenir en suspension des cultures de levure pendant la nuit. Un agitateur à plate-forme ou un rouleau tubulaire peut être utilisé pour maintenir les grandes cultures en suspension.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>À utiliser avec le rouleau tubulaire</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre SmartSpec Plus</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Disponible auprès d’une variété de fabricants</td></tr><tr><td>Plaques microtests stériles à fond plat à 96 puits avec couvercle emballé individuellement</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td>Disponible chez une variété de fabricants</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 & mu; l</td><td>Gilson</td><td>F14401</td><td>Disponible auprès d’une variété de fabricants &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &mu ; l</td><td>Gilson</td><td>F14403</td><td>Des pipettes monocanaux et multicanaux sont utilisées à différentes étapes du protocole. Alors que les pipettes multicanaux réduisent la charge de pipetage à plusieurs étapes, les pipettes monocanaux peuvent être utilisées tout au long du protocole. Disponible auprès d’une variété de fabricants.</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216</td><td>Le rotor vendu avec contient des tubes de microcentrifugation de 1,5 et 2,0 ml. Le rotor peut être remplacé par un autre qui contient des tubes coniques de 15 ml et 50 ml.</td></tr><tr><td>Système d’imagerie de plaques (p. ex. Système Gel Doc XR+)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8195</td><td>Une variété de systèmes peuvent être utilisés pour imager les plaques, y compris des systèmes d’imagerie sophistiqués, des scanners informatiques et des téléphones avec appareil photo.</td></tr><tr><td>Rotor à angle fixe F-35-6-30 avec couvercle et adaptateurs pour centrifugeuse Modèle 5430/R, tubes coniques 15/50 ml, 6 places</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Tube à bouchon à vis sérigraphié 17 x 20 mm conique, polypropylène</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Disponible auprès de différents fabricants</td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 1,5 ml, PCR clean, naturels</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Disponible dans une variété de fabricants</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Heater</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Le bain d’eau bouillante avec plaque chauffante peut également être utilisé pour dénaturer</td></tr><tr><td>les protéines Appareils de fonctionnement et de transfert SDS-PAGE, alimentations et équipements d’imagerie ou chambres noires pour SDS-PAGE et transfert à membrane</td><td></td><td></td><td>Variera selon le laboratoire et l’application</td></tr><tr><td>Système d’imagerie par transfert Western ( par exemple scanner Li-Cor Odyssey CLx et logiciel Image Studio)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Variera selon le laboratoire et l’application Membranes</td></tr> de <tr><td>transfert EMD Millipore Immobilon PVDF</td> Fisher <td>Scientific</td> IPFL00010 <td>Variera selon le laboratoire et l’application</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaires ( par exemple Phosphoglycérate kinase (Pgk1) Anticorps monoclonal, souris (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Variera selon le laboratoire et l’application</td></tr><tr><td>Anticorps secondaires (par exemple Alexa-Fluor 680 IgG anti-souris de lapin (H+L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Variera selon le laboratoire et l’application</td></tr></tbody></table>

détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

La dégradation des protéines réglementé est crucial pour pratiquement toutes les fonctions cellulaires. Une grande partie de ce qui est connu sur les mécanismes moléculaires et génétiques exigences pour la dégradation des protéines eucaryotes a été initialement créé en Saccharomyces cerevisiae. Analyses classiques de la dégradation des protéines se sont appuyés sur pulse-chase et cycloheximide-chase méthodes biochimiques. Bien que ces techniques fournissent des moyens sensibles pour observer la dégradation des protéines, ils sont laborieux, de temps, et à faible débit. Ces approches ne sont pas aptes à la sélection rapide ou à grande échelle pour des mutations qui empêchent la dégradation des protéines. Ici, un test basé sur une croissance de la levure pour l&#39;identification facile des exigences génétiques pour la dégradation des protéines est décrite. Dans ce dosage, une enzyme rapporteur nécessaire à la croissance dans des conditions sélectives spécifiques est fusionnée à une protéine instable. Les cellules dépourvues de l&#39;enzyme rapporteur endogène mais qui expriment la protéine de fusion peut se développer sous sélective conditions que lorsque la protéine de fusion est stabilisé (lorsque la dégradation des protéines est compromise). Dans l&#39;essai de croissance décrit ici, des dilutions en série de type sauvage et des cellules de levure mutantes qui hébergent un plasmide codant pour une protéine de fusion sont déposés sur un milieu sélectif et non-sélectif. Croissance dans des conditions sélectives est compatible avec la dégradation dépréciation par une mutation donnée. L&#39;abondance de la protéine accrue devrait être confirmé biochimiquement. Procédé pour l&#39;extraction rapide de protéines de levure sous une forme appropriée pour l&#39;électrophorèse et transfert de Western est également démontrée. Une lecture basée sur la croissance pour la stabilité de la protéine, combinée avec un simple protocole d&#39;extraction de protéines pour l&#39;analyse biochimique, facilite l&#39;identification rapide des exigences génétiques pour la dégradation des protéines. Ces techniques peuvent être adaptées pour surveiller la dégradation d&#39;une variété de protéines de courte durée. Dans l&#39;exemple présenté, l&#39;enzyme His3, qui est nécessaire pour la biosynthèse de l&#39;histidine, a été fusionnéà DEG1 -Sec62. DEG1 -Sec62 est prévue pour dégradation après ce qu&#39;il se engage aberrante le réticulum endoplasmique translocon. Cellules hébergeant DEG1 -Sec62-His3 sont capables de croître dans des conditions sélectives lorsque la protéine a été stabilisé.

Pour illustrer cette méthode, l&#39;enzyme His3 a été fusionné à l&#39;extrémité carboxy-terminale du modèle réticulum endoplasmique (RE) associée au gène de dégradation (ERAD) substrat, DEG1 -Sec62 (figure 2A) pour créer DEG1 -Sec62-His3 (Figure 3) . DEG1 -Sec62 représente un membre fondateur d&#39;une nouvelle classe de substrats ERAD qui sont ciblées suivant, les association persistante aberrante avec le translocon, le canal principal responsable pour dépla...

Cet article décrit un test basé sur la croissance de levure pour la détermination des exigences génétiques pour la dégradation des protéines. Il fait également la démonstration d’une méthode d’extraction rapide des protéines de levure, adaptée au western blot pour confirmer biochimiquement les exigences de dégradation. Ces techniques peuvent être adaptées pour surveiller la dégradation d’une variété de protéines.

Détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

L’objectif général de l’expérience suivante est de déterminer rapidement les exigences génétiques pour la dégradation d’une protéine instable chez Croce Visier. Ceci est réalisé en fusionnant une enzyme rapporteure nécessaire à la croissance dans des conditions sélectives spécifiques avec une protéine instable d’intérêt. Ensuite, des cellules de type sauvage ou mutantes, toutes deux exprimant la protéine de fusion, sont cultivées sur des plaques de gélose moyenne sélective.Le test de placage fournit un indicateur pratique de la stabilisation des protéines sur la base de la croissance des cellules de levure afin de confirmer biochimiquement les différences dans l’abondance des protéines tandis que le type dans les cellules mutantes hébergeant la protéine de fusion est lysé via une méthode d’extraction de protéines rapide et inefficace pour l’analyse par transfert Western. Les résultats montrent que l’abondance d’une protéine instable est augmentée dans les cellules présentant une mutation dans un gène nécessaire à la dégradation. L’inverse est vrai pour les souches de type sauvage compétentes en matière de dégradation.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les analyses de poursuite d’impulsion et de poursuite de Cycl heide est qu’elle nécessite moins de main-d’œuvre et de temps, ce qui permet de déterminer rapidement et à haut débit les exigences génétiques pour la dégradation des protéines. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les exigences de dégradation d’une gamme de protéines instables. Il peut également être utilisé pour identifier les régulateurs d’autres aspects de l’expression des gènes tels que la transcription et la traduction.Sheldon Watts et Justin Crowder feront la démonstration des procédures. Avant le test, les étudiants de mon laboratoire transforment un plasmide codant pour une protéine de fusion composée d’une protéine instable et d’une enzyme rapporteure métabolique en une souche de levure mutante. Suspectés d’avoir des défauts génétiques liés à la régulation de la dégradation des protéines en tant que contrôle, transforment également le même plasmide en une souche de levure de type sauvage.Inoculez les transformants dans cinq millilitres de milieu minimal qui sélectionne les cellules, hébergeant les molécules plasmidiques. Placez le tube à essai dans un rotateur incliné et incubez toute la nuit à 30 degrés Celsius le lendemain. Mesurez la densité optique des cultures de nuit, puis égalisez la concentration cellulaire de toutes les cellules en diluant chaque culture à une DO 600 de 0,2 avec des milieux frais et des tubes à centrifuger individuels stériles de 1,5 millilitre.Pour commencer l’essai principal, mettre en place une matrice de série de dilution sextuple en transférant d’abord 200 microlitres de chaque souche pré-diluée, à partir d’une DO 600 de 0,2 dans les puits désignés dans la première colonne d’une plaque stérile à 96 puits en préparation des dilutions ultérieures, utiliser une pipette multicanaux pour ajouter 125 microlitres d’eau stérile dans les puits vides de la deuxième colonne, trois, et quatre. Ensuite, transférez 25 microlitres de levure de la colonne un dans la colonne deux, pipetez de haut en bas plusieurs fois pour mélanger les cellules uniformément et procédez au transfert de 25 microlitres de cellules de la colonne deux à la colonne trois. Répétez les étapes de dilution en série jusqu’à ce que les puits de la colonne quatre soient bien mélangés comme aide visuelle pour le repérage cellulaire.Imprimez un modèle de grille et collez-le à l’intérieur d’un couvercle de boîte de Pétri, en commençant par la colonne la moins concentrée dans la matrice de dilution en série. Transférez quatre microlitres de cellules de chaque colonne. Sur la plaque à 96 puits sur une plaque de gélose moyenne minimale de contrôle qui sélectionne pour l’entretien du plasmide intracellulaire Repérez quatre autres microlitres de cellules de chaque colonne sur une plaque de gélose moyenne minimale distincte qui sélectionne les deux plasmides intracellulaires.Maintenance et expression de la protéine de fusion instable. Laissez les deux assiettes sécher sur le banc pendant cinq à 10 minutes. Fermez les couvercles avec param pour éviter la déshydratation et incubez les cellules à 30 degrés Celsius pendant deux à six jours.Lorsque les colonies de la culture à la croissance la plus rapide deviennent visibles pour la première fois à l’endroit le plus dilué d’une plaque donnée, retirez la plaque de l’incubateur et documentez l’étendue de la croissance. En prenant des photos, il peut être nécessaire de prendre des photos de différentes plaques à des jours différents ou d’une même plaque sur plusieurs jours. Dans le cas de différentes souches de levure qui présentent une large gamme de taux de croissance, ainsi confirmé biochimiquement qu’un gène identifié dans l’essai de croissance régule l’abondance des protéines, commencez par transformer les souches de levure de type sauvage et mutantes avec un plasmide codant pour la protéine de fusion susmentionnée, inoculez les transformants dans cinq millilitres de milieu minimal qui sélectionne pour l’entretien du plasmide intracellulaire et incubez les tubes pendant la nuit dans un rotateur incliné à 30 degrés Celsius.Le lendemain, mesurez la densité optique à 600 de chaque culture nocturne. Une fois que toutes les souches ont atteint une OD 600 de 0,4 ou plus, diluez toutes les cultures à 0,2 avec un milieu frais de sorte que le volume final de chaque souche soit de 10 millilitres. Incuber les cellules sur une plate-forme à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que toutes les cultures atteignent une croissance en phase mi-logarithmique OD 600, entre 0,8 et 1,2.Récoltez une cellule en transférant 2,5 unités de diamètre extérieur totales de cellules dans un tube conique frais de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à température ambiante pendant cinq minutes et retirez le surnageant S. Ajoutez ensuite un millilitre de vortex d’eau distillée ou une pipette de haut en bas pour remettre le palais en suspension et transférez la suspension cellulaire dans un tube frais de 1,5 millilitre.Isolez les cellules avec la deuxième centrifugation pendant 30 secondes À température ambiante, retirez le piège et remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres d’eau distillée. Ajoutez 100 microlitres d’hydroxyde de sodium 0,2 molaire à la suspension cellulaire, pipetez de haut en bas à quelques reprises pour mélanger et incubez les échantillons pendant cinq minutes à température ambiante pour éviter une lyse cellulaire prématurée. Ne vortex pas les cellules.Isolez à nouveau les cellules avec une troisième centrifugation pendant 30 secondes. À température ambiante, retirez les surnageants des cellules et lys les cellules en ressuscitant en suspendant la pastille dans 50 à 100 microlitres d’un tampon d’échantillon x lamby dénaturez toutes les protéines en incubant la suspension à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez le lysat cellulaire entier sur de la glace pendant cinq minutes. Pour mesurer l’abondance des protéines sujettes à l’agrégation, telles que les protéines à plusieurs segments transmembranaires, déterminez empiriquement l’incubation, la température et le temps de dénaturation optimaux en commençant à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes au lieu de 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.Enfin, isolez la fraction soluble en centrifugeant le lysat pendant une minute à température ambiante, transférez le snat dans un tube frais et jetez la fraction insoluble des pastilles. La fraction soluble peut désormais être chargée directement sur une page FDS, sur un gel ou stockée à moins 20 degrés Celsius lors de la mise en place d’un test de dégradation des protéines basé sur la croissance de levure. Une protéine de triple fusion instable est fusionnée avec une enzyme métabolique supplémentaire qui complète le fond de la souche de levure dépourvue du même gène métabolique.Lorsque la protéine de fusion est exprimée dans la levure, elle est sujette à des événements de translocation stérile au niveau de la membrane du réticulum endoplasmique. Cette translocation aberrante déclenche la dégradation de la protéine entière, y compris l’enzyme métabolique, par l’intermédiaire de l’ubiquitine, empêchant ainsi la prolifération cellulaire. Cependant, dans les souches de levure dépourvues d’ubiquitine ligase, la protéine de fusion est protégée de la dégradation, même en cas de translocation moyenne, permettant aux cellules de proliférer.Par conséquent, en présence d’ubiquitine ligase, il existe une correspondance entre la dégradation des protéines qui se produit à l’intérieur des cellules et l’incapacité des cellules de levure à proliférer sur des plaques de gélose appauvries en métabolites. D’autre part, dans le contexte d’une ubiquitine ligase défectueuse ou absente, la prolifération cellulaire indique que la protéine de fusion a été protégée de la dégradation pour réduire la croissance de fond ou parasite et augmenter la rigueur de ce test. Des inhibiteurs compétitifs de l’enzyme métabolique peuvent être ajoutés au milieu de croissance pour confirmer les résultats observés dans l’essai de croissance sur levure.Une preuve directe de dégradation des protéines de fusion peut également être vérifiée à l’aide d’un transfert Western. En présence ou en l’absence d’ubiquitine ligase, la protéine de fusion sera dégradée ou épargnée de la destruction respectivement. Il est important de se rappeler que ces procédures rendent compte le plus directement de l’abondance à l’état d’équilibre de la protéine d’intérêt.Après la réalisation de ces procédures, des analyses d’impulsions ou de chasse au cycloheximide peuvent être effectuées afin d’analyser directement la cinétique de dégradation des protéines et la présence de mutations trouvées pour augmenter les niveaux de protéines à l’état d’étude.

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