Name: Cholestérol des macrophages épuisement et ses effets sur la phagocytose des Cryptococcus neoformans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Découvrez comment épuiser le cholestérol des macrophages pour étudier la phagocytose de Cryptococcus neoformans. Cette méthode utilise le méthyl-bêta-cyclodextrine et permet d'analyser le rôle des stérols dans les infections fongiques.

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Ce travail a été financé par des subventions du NIH AI56168, AI71142, AI87541 et AI100631 au MDP. Maurizio Del Poeta est Burroughs Wellcome chercheur en maladies infectieuses.

1. cholestérol déplétion des cellules J774A.1 avec MβCD <ol><li> Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, semences des cellules de type macrophage 10 5 J774A.1 par puits sur une plaque à 96 puits de culture de cellules dans 200 ul de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% pénicilline / streptomycine (P / S). Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 O / N. </li><li> Retirez le support de la monocouche cellulaire et laver les cellules deux fois avec du phosphate de 1x solution saline tamponnée (PBS) qui a été passé à l&#39;autoclave ou par filtration. </li><li> Ajouter 200 ul de solution MβCD à la concentration désirée (10 mM ou 30 mM dans du PBS) ou 1x PBS comme témoin et incuber pendant 30 min à 37 ° C avec agitation par secousses. Retirer le surnageant et réserve à la température ambiante pour l&#39;analyse quantitative avec un kit disponible dans le commerce immédiatement après la procédure. </li><li> Laver les cellules de deux à trois fois avec PBS 1x ou DMEM dépourvu de sérum et continuer avec une infection ou une lyse des cellules par pipetting deux à trois fois avec H 2 O déminéralisée pour l&#39;analyse par Chromatographie sur couche mince ou d&#39;un kit. REMARQUE: Suite à une déplétion en cholestérol cholestérol kit de quantification disponible dans le commerce peut être utilisé. Voir la section des matériaux pour plus de détails. Suivez les instructions du fabricant à la lettre. </li></ol> 2. Observation du cholestérol contenu par chromatographie sur couche mince (CCM) <ol><li> Laver un réservoir TLC deux fois avec de l&#39;acétone et une fois avec une solution d&#39;éther de pétrole: éther diéthylique: acide acétique (65: 30: 1 en volume). Saturer la cuve avec de l&#39;éther de pétrole: éther diéthylique: acide acétique (65: 30: 1 en volume) et de laisser la solution O / N. NOTE: solvants organiques devraient toujours être utilisés sous une hotte pour éviter l&#39;inhalation de vapeur. Gants et une blouse de laboratoire doivent être portés à tout moment. L&#39;acide acétique est un acide fort et doit être utilisé avec prudence. </li><li> Dans une enceinte de biosécurité, des semences stériles 10 6 J774A.1 cellules de type macrophage par puits sur un CE 6 puitsll plaque de culture dans un volume de 5 ml de DMEM chaud additionné de 10% de FBS et 1% P / S. Incuber à 37 ° C, 5% CO 2 H / N. </li><li> Appauvrissent macrophages de cholestérol en suivant les étapes 1.2 à 1.4, en remplaçant 1 ml pour 200 pi le cas échéant pour tenir compte de la taille de bien plus grande. </li><li> Ajouter 500 ul de trypsine-EDTA à chaque puits, incuber pendant 3 minutes à 37 ° C, et gratter doucement les cellules avec un grattoir à cellules. </li><li> Transférer dans un tube de micro et ajouter un 500 pi supplémentaires de DMEM chaud complété avec 10% de FBS et 1% P / S. </li><li> Faites tourner les cellules pendant 5 min à 300 g et retirer le surnageant. </li><li> Ajouter un 500 ul supplémentaires de DMEM chaud additionné de 10% de FBS et 1% P / S au culot cellulaire et remettre en suspension avec précaution par aspiration et refoulement. </li><li> Retirer 10 pi de cellules et de compter les cellules sur un hémocytomètre. Normaliser les concentrations de cellules de chaque échantillon et ajouter un nombre égal de cellules dans des tubes de verre. NOTE: A ce stade, on peutchoisir de combiner des cellules des mêmes groupes de traitement pour obtenir un extrait plus concentré lipidique final. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante et enlever médias. </li><li> Ajouter 2 ml de methanol et vortex. Ensuite, ajoutez 1 ml de chloroforme et vortex. Vérifiez l&#39;état de phase pour se assurer que la solution monophasique. REMARQUE: Tubes peut être conservé à 4 ° CO / N. </li><li> Centrifuger à 1700 g pendant 10 min à température ambiante et transférer le surnageant dans un nouveau tube </li><li> Ajouter un 1 ml supplémentaires de chloroforme suivie par 1 ml de dH 2 O. Vortex deux fois pendant 30 s. Centrifuger à 1700 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Peser un tube de verre sur une balance sensible et en utilisant une pipette Pasteur en verre pour transférer la phase inférieure dans le tube de verre de poids connu. </li><li> Séchez les lipides dans un évaporateur centrifuge à sec (environ 2 h). Peser tube avec lipides séchés et calculer le poids lipidique sec. REMARQUE: lipides sec peut être stocké dans -20 ° C jusqu&#39;au moment d&#39;effectuer TLC. </li><li> Diluer lipides séchés suffisamment chloroforme pour normaliser la concentration de lipides (généralement de 20 à 50 pi) et la charge 20 pi du lipide dilué sur une plaque de CCM de silice. Charge 20 pg de cholestérol dilué dans 20 ul de chloroforme en tant que standard. </li><li> Ajouter plaque de CCM séché pour le réservoir TLC saturés et permettre au solvant de migrer jusqu&#39;à 1 cm avant bord de la plaque. Retirer la plaque TLC du réservoir et laisser sécher environ 5 min. </li><li> Visualisez lipides en plaçant dans un réservoir de la vapeur d&#39;iode pour vérifier la migration. Retirer et laisser des taches à se estomper pendant environ 10 à 15 min sous le capot. NOTE: L&#39;iode est un danger d&#39;inhalation. Toujours utiliser sous une hotte. </li><li> Préparer une solution neutre pour la coloration des lipides en combinant 60 ml de methanol avec 60 ml d&#39;H 2 O déminéralisée, 4 ml d&#39;acide sulfurique et 630 mg de chlorure de manganèse. </li><li> Soigneusement et lentement plonger la plaque CCM dans la solution lipide neutre de coloration dans un plateau et à retirer sans desquamation de la silice layer. REMARQUE: La solution de coloration lipide neutre peut être réutilisé plusieurs fois et ainsi il peut être récupéré à partir du plateau et replacé dans une bouteille pour une utilisation ultérieure. </li><li> Laisser sécher la plaque sous le capot à la température ambiante jusqu&#39;à ce que toutes les bulles ont disparu. Chauffer la plaque de CCM sur un ensemble de blocs de chaleur à 160 ° C et de l&#39;omble à la couleur désirée. REMARQUE: Un programme de densitométrie tels que Vision d&#39;entreprise LS peut être utilisée pour quantifier les bandes carbonisés pour comparer des échantillons de lipides. </li></ol> 3. infection des macrophages avec C. neoformans (H99) <ol><li> Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, les graines 10 5 cellules comme les macrophages par puits sur une plaque à 96 puits de culture de cellules dans 200 ul de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% P / S. Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2, 5% de CO 2 O / N. NOTE: L&#39;infection peut également se faire en fond de verre plats pour l&#39;imagerie confocale plus facile; tous les montants restent les mêmes. </li><li> Développer une culture de C. neoformans (H99)en inoculant 10 ml de YNB avec une colonie provenant d&#39;une plaque de frappe et l&#39;incubant O / N à 30 ° C avec agitation par secousses. </li><li> Laver et compter C. neoformans (H99) cellules. <ol><li> Centrifugeuse C. neoformans O / N culture à 1700 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Retirez le support et le jeter. Laver les cellules avec 5 ml de PBS 1x. Centrifuger à 1700 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Retirer PBS et laver avec 5 ml de PBS 1x filtrée. Centrifuger à 1700 xg pendant 10 min à 4 ° C. Répétez cette étape deux fois plus. </li><li> Retirer du PBS et remettre en suspension dans 5 ml de 1 x PBS. </li><li> Ajouter une dilution en série dans du PBS pour obtenir une dilution 1: 500 de la culture lavé. <ol><li> Ajouter 100 ul de l&#39;échantillon initial de 900 ul de 1 x PBS pour obtenir une dilution de 1:10. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;échantillon dilué à 1:10 900 ul de 1 x PBS pour obtenir une dilution à 1: 100. </li><li> Ajouter 200 ul de 1: 100 à échantillon dilué 800 ul de 1 x PBS pour obtenir un rapport 1: 500 dilutisur </li></ol></li><li> Prenez 10 pi de 1: 500 dilution et compter sur hémocytomètre pour calculer le nombre de cellules. </li></ol></li><li> Préparer la solution de travail pour l&#39;activation des macrophages et opsonisants C. neoformans. <ol><li> Diluer LPS et IFN 100x de solutions d&#39;achat d&#39;actions en ajoutant 10 pi à 990 pi. REMARQUE: LPS et IFN sont utilisés pour améliorer l&#39;absorption phagocytaire, mais ne sont pas nécessaires pour la phagocytose. Se il ya un intérêt dans une activité fongicide des macrophages, effectuez activation O / N à 37 ° C avec agitation avant l&#39;infection. </li><li> Par exemple combiner 7,5 ul de LPS dilué, 1,25 ul de dilution IFNy, 1,25 pi d&#39;anticorps GXM et le volume du C. neoformans culture qui donne 1,25 x 10 5 cellules. Amener le volume à 250 pi multiplié par le nombre d&#39;échantillons avec du DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% P / S. </li><li> Vortexer et incuber la solution pendant 20 min à 37 ° C avec agitation par secousses. REMARQUE:Cholestérol épuisement (étapes 1.2 à 1.4) peut se faire en même temps que l&#39;étape d&#39;opsonisation. Assurez-vous de traiter les macrophages avant de combiner la solution de travail, que les cellules opsonisées devraient être utilisés de manière optimale pas plus de 20 minutes après l&#39;étape d&#39;incubation 3.4.3. </li></ol></li><li> Infecter les macrophages <ol><li> Macrophages laver deux fois avec DMEM dépourvu de sérum et ajouter 200 pi de opsonisé C. neoformans solution de travail à chaque puits. </li><li> Incuber pendant 2 heures à 37 ° C. </li></ol></li><li> Fixer et colorer les cellules <ol><li> Retirez le support et laver les cellules deux fois avec DMEM. </li><li> Air sécher la monocouche cellulaire pendant 10 minutes et ajouter 200 ul de glace methanol froid pour fixer les cellules. </li><li> Incuber pendant 15 min à température ambiante et retirez tout le méthanol restant. </li><li> Ajouter 200 pl de 10x Giemsa et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Laver 2-3 fois à l&#39;eau déminéralisée et O sec / N avec capuchon. NOTE: L&#39;imagerie peut être fait le lendemain ou jusqu&#39;à un followi de semainecoloration ng. </li></ol></li><li> Visualisez et le comte <ol><li> En utilisant un microscope, compter 300 cellules par point de données (se il ya deux du même traitement compter 150 par puits) et noter le nombre de macrophages infectés et le nombre de cellules Cryptococcus englouti. REMARQUE: Pour assurer même échantillonnage pour les données par l&#39;utilisation du point 2 plaques par condition, choisir trois zones non-chevauchement par plaque et compte 50 cellules par zone. </li><li> Calculer l&#39;indice phagocytaire en multipliant le pourcentage de macrophages infectés par le nombre moyen de C. neoformans par macrophage. Normaliser indice phagocytaire en exprimant les valeurs en pourcentage de la PBS 1x traitée contrôle. Après plusieurs essais calculer la valeur moyenne et l&#39;écart type de la moyenne pour déterminer les tendances de l&#39;indice phagocytaire. Utilisez test t de Student pour déterminer la signification. </li><li> Prenez micrographies de cellules à 1,000X ou grossissement de 400X. </li></ol></li></ol> 4. Composition bleu Trypan <ol><li> Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, les graines 10 6 cellules de type macrophage par puits sur une 6 puits plaque de culture de cellules dans un volume de 5 ml de milieu essentiel minimal de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline / streptomycine . Incuber à 37 ° C, 5% CO 2 H / N. </li><li> Appauvrissent macrophages de cholestérol en suivant les étapes 1.2 à 1.4 en remplaçant 2 ml pour 200 pi le cas échéant pour tenir compte de la taille de bien plus grande. REMARQUE: Assurez-vous d&#39;inclure un témoin traité avec 1x PBS ainsi que un contrôle qui est grattée avant tout traitement. </li><li> Ajouter 500 ul de 1 x PBS à chaque puits et gratter doucement les cellules avec un grattoir à cellules. Transférer dans un tube de micro et de suspendre les cellules par pipetage doucement monter et descendre. </li><li> Retirer 10 pi de cellules et tache avec 1 pl de 4% bleu Trypan. </li><li> Compter les cellules sur un hémocytomètre et calculer la viabilité utilisant l&#39;équation suivante:% viabilité = [1 - (cellules bleues / cellules totales)]x 100. Les valeurs Normaliser sur le contrôle qui n&#39;a pas été traitée. Après plusieurs essais calculer la valeur moyenne et l&#39;écart type pour déterminer les tendances de la viabilité. Utilisez test t de Student pour déterminer la signification. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En travaillant avec ce protocole, il est important d&#39;obtenir le nombre de cellules précises lors du placage des cellules de mammifères et opsonisants C. cellules neoformans. Ceci minimise la variation entre essais et assure une précision de 1: une cible de rapport d&#39;effecteur tout au long de l&#39;étude. Il est également essentiel pour coordonner la synchronisation de l&#39;épuisement du cholestérol et de prévenir l&#39;infection des cellules de levure ou des cellules opsonisées de macrophages traités d...

La phagocytose est un processus par lequel les entités extracellulaires sont internalisées par des cellules hôtes. Ce est une arme essentielle dans l&#39;arsenal du système immunitaire à se défendre contre les agents pathogènes, mais le processus peut souvent être subverti par des agents pathogènes pour permettre l&#39;internalisation et la diffusion dans tout le corps 1. La phagocytose est médiée par plusieurs événements de signalisation qui se traduisent par l&#39;attachement et l&#39;engloutissement par des réarrangements de cytosquelette de la cellule hôte. Phagocytes «professionnel» sont capables de reconnaître et de se lier à opsonines sur la surface de l&#39;agent pathogène envahisseur signaler pour la fixation et la formation de lamellipodes, qui engloutissent l&#39;agent pathogène et former un phagosome 2. Parmi les phagocytes dits «professionnels» sont des macrophages. Les macrophages sont des cellules hautement spécialisées qui exercent des fonctions de protection qui incluent la recherche et l&#39;élimination des agents pathogènes causant, réparation des tissus endommagés, et médiation de l&#39;inflammation, la plupart desceux-ci par le processus de phagocytose 1,2. Cryptococcus neoformans est une espèce de levure pathogène qui provoque une maladie grave appelée cryptococcose. spores de Cryptococcus sont inhalées par l&#39;hôte et entraîner une infection pulmonaire qui est généralement asymptomatique. On pense que l&#39;exposition est extrêmement répandue; un échantillon de 61 enfants des maladies infectieuses pédiatriques Clinique du Centre Hospitalier Bronx-Liban a constaté que toutes les personnes interrogées avaient des anticorps à la glucuronoxylomannan de polysaccharide cryptococcose et d&#39;autres études ont montré la prévalence dans les deux virus de l&#39;immunodéficience humaine (VIH) non infecté et les adultes infectés 3, 4. Les macrophages alvéolaires sont la première ligne de la réponse à l&#39;infection pulmonaire et dans la plupart des cas avec succès clairement l&#39;agent pathogène. Cependant, chez les sujets immunodéprimés (patients, par exemple, le VIH et le sida) la levure est capable de survivre dans les macrophages. Dans ceux-cicas, les macrophages peuvent servir un créneau pour la réplication de l&#39;agent pathogène et peuvent faciliter la diffusion du système nerveux central (SNC) où la maladie devient mortelle 5-8. On pense que les macrophages peuvent même livrer la levure directement dans les méninges, aider la levure de traverser la barrière hémato-encéphalique via le modèle de «cheval de Troie» 3,9 - 11. Ainsi, il est important de comprendre le processus de phagocytose et les facteurs qui l&#39;affectent, en particulier dans cryptococcoses. Les travaux antérieurs dans d&#39;autres systèmes de pathogènes pointer vers cholestérol et de lipides radeaux formés par le cholestérol comme ayant un rôle important à jouer dans la phagocytose 12-15. Le cholestérol est espèces de lipides les plus abondants dans les cellules de mammifère et comprend de 25 à 50% de la membrane 16 cellulaire de mammifère. Il a été trouvé à jouer un rôle dans la modulation de la BIOPPHYSIQUE propriétés des membranes en changeant leur rigidité 17. Le cholestérol et sphingolipides forment ensemble microdomaines lipidiques dans la membrane connu comme radeaux lipidiques. Les radeaux lipidiques ont été trouvés à être impliqué dans la formation des cavéoles, ainsi que de fournir un domaine isolé pour certains types de signalisation 16-18. En raison de leur petite taille, il est difficile d&#39;étudier les radeaux lipidiques in vivo. Une façon utile d&#39;étudier le rôle des radeaux lipidiques est de modifier leurs électeurs. Méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) est un composé qui a été trouvé pour réduire le cholestérol des membranes de mammifère et est couramment utilisé pour étudier le rôle des radeaux lipidiques 18. Dans ce protocole, on présente un procédé pour réduire le cholestérol des membranes de cellules hôtes et de quantifier l&#39;effet de l&#39;épuisement de la capacité des cellules hôtes à phagocyter C. neoformans in vitro. Cette procédure fait appel à des cultures de cellules techniqUES sur un macrophage immortalisé comme la ligne cellulaire (J774A.1) comme un modèle pour l&#39;infection. Cholestérol épuisement a été accomplie par exposition à MβCD, qui a un coeur hydrophobe spécifique à la taille de stérols et est capable d&#39;agir comme un puits pour le cholestérol de tirer hors de la membrane 19. Le cholestérol a été mesurée quantitativement épuisement en utilisant un kit disponible dans le commerce et qualitativement en utilisant une extraction lipidique Bligh-Dyer modifié suivie par chromatographie sur couche mince (CCM) 20. . La phagocytose a été mesurée en infectant la lignée cellulaire avec une culture de levure opsonisé mélangé avec un cocktail d&#39;interféron-γ et le lipopolysaccharide d&#39;activation des macrophages a été Cryptococcus opsonisé en utilisant un anticorps glucuronoxylomannan (GXM) 21-23. La coloration et des expériences de microscopie permis pour la visualisation des cellules et le calcul de l&#39;indice phagocytaire pour évaluer le degré de phagocytose. Pris dans leur ensemble, ce protocole dEscribes une méthode de base qui intègre la modification de la composition lipidique avec un processus physiologique.

<table><tbody><tr><td>Classe II type A2 Enceinte de biosécurité</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 Lignée cellulaire</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Arrive congelée. Voir les instructions de l’ATCC pour la culture.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle</td><td>Medium Gibco</td><td>11995-065</td><td>Stocker à 4 &deg ; C et chaud à 37 &deg ; C avant l’utilisation</td></tr><tr><td>HI Fetal Bovin Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Conserver congelé à -20 &deg ; C et décongeler avant d’ajouter au DMEM</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Utilisé pour compléter le DMEM</td></tr><tr><td>Isotemp Incubateur de culture cellulaire</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3530</td></tr><tr><td>Boîte de culture à 96 puits</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x Saline tamponnée au phosphate</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Diluer à 1x et filtrer ou autoclaver avant utilisation.</td></tr><tr><td>Méthyl-&bêta ;-cyclodextrine</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>Dissoudre dans 1x PBS pour obtenir des solutions de concentrations de 10 mM et 30 mM</td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td> Kit de dosage du cholestérol <td>rouge Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex</td><td>Life Technologies Sondes moléculaires</td><td>A12216</td><td>Tous les réactifs pour le dosage du cholestérol sont contenus dans le kit. Suivez les instructions du fabricant.</td></tr><tr><td>Plaque de dosage noire 96 puits</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>FilterMax Dispositifs</td><td></td><td>moléculaires Modèle F5</td></tr><tr><td>Chambre TLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Papier</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Réduit à la taille nécessaire pour le réservoir TLC</td></tr><tr><td>Hotte</td><td></td><td></td><td>Toute hotte conforme aux normes AIHA/ANSI</td></tr><tr><td>Plaque à 6 puits</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Racleur de cellules</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Modèle Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Mélangeur Votex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Modèle # MS104S Meaures jusqu’à 0,1 mg</td></tr><tr><td>Pipette en verre Pasteur</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Modèle # SPD2010</td></tr><tr><td>Éther de pétrole</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Éther diéthylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 avec zone de concentration</td><td>Chromatograhy analytique Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Copeaux d’iode</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Acide sulfurique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de manganèse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging System</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Utilisez le logiciel Vision Works LS pour l’analyse de la densitométrie</td></tr><tr><td>Boîte confocale à fond de verre</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Obtenu du Duke University Medical Center</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>Voir le fabricant pour les instructions de préparation. Utilisez une concentration de glucose de 20 g/L.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Dissoudre dans 1x PBS pour obtenir un stock de 1 mg/ml. Conserver à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Interféron gamma</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>Dissoudre dans 1x PBS pour faire 0,1 mg/ml de solution mère</td></tr><tr><td>Anticorps anti-glucuronoxylomannane (anti-GXM)</td><td></td><td></td><td>Don d’Arturo Casadevall La concentration du laboratoire est de 1,98 mg/ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>Dissoudre 0,8 g de Giemsa dans 25 ml de glycérol et chauffer à 60 &deg ; C pendant 1 h. Ajouter 25 ml de méthanol à la solution et laisser vieillir à température ambiante pendant au moins 1 mois.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 microscope avec AxioCam MRm pour la prise d’images</td></tr></tbody></table>

cholestérol des macrophages épuisement et ses effets sur la phagocytose des<em&gt; cryptococcus neoformans</em

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcose est une infection mortelle provoquée par des champignons pathogènes du genre Cryptococcus. L&#39;infection se produit lors de l&#39;inhalation de spores, qui sont capables de se répliquer dans le poumon profond. Phagocytose par les macrophages de Cryptococcus est l&#39;un des moyens que la maladie est capable de se propager dans le système nerveux central pour provoquer une méningo-encéphalite mortelle. Par conséquent, l&#39;étude de l&#39;association entre Cryptococcus et macrophages est important de comprendre la progression de l&#39;infection. La présente étude décrit un protocole étape par étape pour étudier macrophages infectiosité par C. neoformans in vitro. En utilisant ce protocole, le rôle des stérols d&#39;accueil sur les interactions hôte-pathogène est étudiée. Différentes concentrations de méthyl - cyclodextrine (MCD) ont été utilisés pour épuiser le cholestérol du réticulum sarcome murin macrophage lignée cellulaire J774A.1. Cholestérol appauvrissement a été confirmée et quantifiée en utilisant à la fois un stock pour le commercee kit cholestérol quantification et chromatographie sur couche mince. cellules de cholestérol appauvri ont été activés à l&#39;aide Lipopolysacharide (LPS) et l&#39;interféron gamma (IFN) et infectés par Cryptococcus neoformans anticorps opsonisé cellules H99 de type sauvage à un rapport effecteur à cible de 1: 1. Les cellules infectées ont été surveillées après 2 h d&#39;incubation avec C. neoformans et leur indice de phagocytose a été calculé. Cholestérol épuisement a entraîné une réduction significative de l&#39;indice phagocytaire. Les protocoles présentés offrent un moyen commode pour imiter l&#39;initiation du processus d&#39;infection dans un environnement de laboratoire et d&#39;étudier le rôle de la composition lipidique de l&#39;hôte dans l&#39;infectivité.

Cholestérol épuisement Analyse du surnageant réservée à l&#39;étape 1.3 du protocole en suivant les instructions du fabricant dans le kit de dosage du cholestérol Amplex Rouge donne une concentration élevée de cholestérol dans l&#39;échantillon MβCD traité par rapport au contrôle PBS 1x. Selon le type de cellule et de la concentration utilisée MβCD cholestérol épuisement peut varier. Pour J774 traité avec 10 mM MβCD, un appauvrissement d&#39;environ 50% a été observée. L&#39;épuisement peut êtr...

Dans cet article, un protocole pour l’infection des macrophages par Cryptococcus neoformans est décrit. En outre, une méthode d’appauvrissement des stérols des macrophages est expliquée. Ces protocoles fournissent un guide pour étudier les infections fongiques in vitro et examiner le rôle des stérols dans de telles infections.

Cholestérol des macrophages épuisement et ses effets sur la phagocytose des<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

L'objectif général de cette procédure est de préciser le rôle du cholestérol dans l'absorption de Cryptococcus neoformans par les macrophages. Cette étape est réalisée en premier lieu en éliminant le cholestérol d'une lignée cellulaire de macrophages murins à l'aide de méthyl-bêta-cyclodextrine. Ensuite, la diminution du cholestérol est confirmée et quantifiée par chromatographie sur couche mince et à l'aide d'un kit disponible commercialement.Ensuite, les cellules de *Cryptococcus neoformans* sont marquées par des anticorps spécifiques dirigés contre le glucuronoxylomannane ou le composant GXMA de la capsule de *Cryptococcus*. Enfin, les macrophages appauvris en cholestérol sont infectés par *Cryptococcus neoformans* opsonisé. En définitive, la microscopie à fluorescence et la microscopie optique sont utilisées pour visualiser les cellules infectées et permettre le calcul du degré de phagocytose.Les principaux avantages de cette technique sont qu'elle peut être réalisée avec du matériel de laboratoire de base en un temps relativement court tout en obtenant des résultats quantitatifs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la pathogénie fongique. Par exemple, quel est le rôle des greffons lipidiques de l'hôte dans l'optique des pathogènes fongiques ?L'application de cette technique s'étend à la thérapie ou à la prise en charge des infections à *Occus*, car l'internalisation au sein des macrophages constitue une étape critique pour l'initiation de causes graves. Bien que ces méthodes permettent d'obtenir des informations sur la virulence des agents pathogènes fongiques, elles peuvent également être appliquées à d'autres organismes, tels que les pathogènes intracellulaires obligatoires. Dans une cabine de sécurité biologique stérile, ensemencer 10⁵ cellules de type macrophage J774A.1 par puits dans une plaque de culture de 96 puits. Ajouter 200 microlitres de DMEM supplémenté avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine (PS), puis incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de CO₂. Le jour suivant, poursuivre l'expérience.Retirer le milieu de la monocouche cellulaire et utiliser du PBS filtré ou autoclavé pour laver les cellules deux fois. Ajouter 200 microlitres de solution de méthyl béta cyclodextrine ou d'embeta CD à la concentration souhaitée, ou un XPBS comme témoin, puis incuber 30 minutes à 37 degrés Celsius sous agitation. Retirer le surnageant et le conserver à température ambiante pour une analyse quantitative à l’aide d’un kit disponible commercialement.Immédiatement après cette procédure avec du PBS ou du DMEM sans sérum, laver les cellules deux à trois fois avant de procéder à la quantification du cholestérol ou de poursuivre l'infection. Étape d'infection des macrophages appauvris en cholestérol dans une hotte de sécurité biologique stérile. Séminer 10 puissance cinq cellules de type macrophage par puits.Dans une plaque de 96 puits, incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % CO₂ en même temps. Faire croître une culture de C neoformans H 99 en isolant une colonie à partir d'une plaque striée et en inoculant 10 millilitres de YNB ; incuber toute la nuit à 30 degrés Celsius avec agitation le jour suivant. Centrifuger la culture de C neoformans à 1 700 × g et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes.Éliminer le surnageant et ajouter cinq millilitres de PBS 1X avant de centrifuger à nouveau. Ensuite, utiliser du PBS 1X filtré pour laver les cellules trois fois supplémentaires avant de resuspendre les cellules dans cinq millilitres de PBS 1X. Ensuite, pour préparer une dilution sériée de la culture lavée, ajouter 100 microlitres de l'échantillon d'origine à 900 microlitres de PBS 1X.Pour obtenir une dilution au 1/10, ajoutez 100 microlitres de l'échantillon dilué au 1/10 à 900 microlitres de PBS 1X afin d'obtenir une dilution au 1/100. Enfin, ajoutez 200 microlitres de l'échantillon dilué au 1/100 à 800 microlitres de PBS 1X. Pour obtenir une dilution au 1/500, ajoutez 10 microlitres de la dilution finale à un hémocytomètre et comptez afin de calculer le nombre de cellules nécessaire à la préparation d'une solution de travail pour l'activation des macrophages et l'opsonisation de C. neoformans. Diluez 100 fois le LPS et l'interféron gamma à partir des solutions mères en mélangeant 10 microlitres de chaque composé avec 990 microlitres de PBS. Pour chaque échantillon, combinez 7,5 microlitres de LPS, 1,25 microlitre d'interféron gamma, 1,25 microlitre d'anticorps anti-GXM et 1,25 × 10⁵.Observez les cellules de neo forman, puis, en utilisant du DMEM supplémenté en FBS et en Ps, ajustez le volume à 250 microlitres par échantillon. Vortexez la solution et incubez pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius avec agitation avant d'infecter les macrophages. La déplétion en cholestérol peut être réalisée après cette déplétion. Utilisez du DMEM sans sérum pour les laver deux fois avant d'ajouter 200 microlitres de la solution working d'Opsonize C neoformans à chacun.Incuber correctement pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Ensuite, fixer et colorer les cellules. Après avoir lavé les cellules deux fois avec du DMEM et laissé sécher à l'air la monocouche cellulaire pendant 10 minutes, ajouter 200 microlitres de fixateur de méthanol glacé pendant 15 minutes à température ambiante, puis éliminer tout méthanol résiduel.Ensuite, ajoutez 200 microlitres de giza 10 x et incubez pendant cinq minutes à température ambiante. Puis, lavez deux ou trois fois avec de l'eau déionisée, laissez le bouchon ouvert et faites sécher toute la nuit le lendemain ou jusqu'à une semaine plus tard sous un microscope. Comptez 300 cellules par point de données et notez le nombre de macrophages infectés ainsi que le nombre de cellules de cryptococcus englobées.Calculer l'indice acide PHA en multipliant le pourcentage de macrophages infectés par le nombre moyen de C neoformans par macrophage. Normaliser l'indice acide F en exprimant les valeurs en pourcentage par rapport au témoin traité au XPBS. Après plusieurs essais, calculer la valeur moyenne et l'écart type de la moyenne afin de déterminer les tendances de l'indice acide F.Utilisez le test t de Student pour déterminer la significativité, comme indiqué ici. L'analyse du surnageant prélevé à partir de cellules traitées avec embeta CD a révélé une élévation du cholestérol par rapport au surnageant isolé de cellules contrôles au PBS, indiquant un degré plus élevé de déplétion du cholestérol dans les cellules traitées avec M beta CD. La déplétion peut être calculée à l'aide des valeurs de cholestérol obtenues à partir du surnageant et du lysat cellulaire, comme illustré ici, afin de confirmer les résultats de déplétion du cholestérol.L'analyse du lysat cellulaire par chromatographie sur couche mince (CCM) révèle une diminution marquée de la coloration du cholestérol dans les cellules traitées avec des concentrations croissantes de M beta CD en cytométrie. L'analyse de la CCM montre une tendance similaire à celle de l'essai quantitatif : après infection, les cellules restent adhérentes et intactes, et la morphologie cellulaire demeure inchangée dans les cellules infectées par neoformans par rapport aux cellules contrôles non traitées. Les micrographies de cellules infectées de manière optimale montrent clairement c neoformans englobé à l'intérieur des cellules de mammifères.Ce graphique montre que, lorsqu'il est calculé à partir de 300 cellules de macrophages par groupe de traitement, une réduction de l'indice F acide a été observée dans les cellules appauvries en cholestérol. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ cinq heures, hors temps d'incubation qui doivent être effectués toute une nuit suivant cette procédure. D'autres méthodes, telles que l'extraction de membranes résistantes aux détergents à partir des macrophages, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme savoir si l'appauvrissement en cholestérol réduit l'optique de cryptococcus en affectant les greffons lipidiques de l'hôte après son développement.Ces techniques ouvrent la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie membranaire et de l'immunologie pour comprendre les mécanismes de la phagocytose par les interactions entre macrophages et agents pathogènes chez les champignons pathogènes. N'oubliez pas que le travail avec des agents pathogènes peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d'équipements de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Un protocole est présenté pour la culture cellulaire de macrophages dérivés de monocytes humains différenciés par le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF). Le protocole utilise la cryoconservation des monocytes associée à leur différenciation en macrophages. Ensuite, les macrophages récoltés peuvent ensuite être ensemencés dans des puits de culture aux densités cellulaires requises pour la réalisation d’expériences.

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Présenté ici est un protocole pour quantifier et produire des images dynamiques de la régulation médiée par les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la phagocytose des macrophages (MΦ) des particules de levure non opsonisées (zymosan) qui sont conjuguées à une molécule fluorescente sensible au pH.

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Cholestérol des macrophages épuisement et ses effets sur la phagocytose des

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