Spectrométrie de masse quantitative de profilage Protéomes Cancer-cellulaires dérivées de liquide et de tumeurs solides

L’objectif global de cette procédure est d’élucider les profils d’expression protéique des tumeurs liquides et solides. Ceci est accompli en enrichissant d’abord les cellules cancéreuses à partir d’échantillons de sang ou de tissus dérivés de patients. Dans un deuxième temps, les protéines sont isolées des cellules cancéreuses, puis mélangées à un étalon de quantification du susac spécifique à la tumeur.

Dans la dernière étape, le mélange de protéines est digéré. En fin de compte, la spectrométrie de masse est utilisée pour montrer les profils d’expression des protéines des tumeurs liquides et solides. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’oncologie et de la pathologie, telles que : comment identifier les cibles médicamenteuses et les mécanismes de résistance aux traitements ?

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la découverte de biomarqueurs, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que l’étude de divers cancers solides et liquides. Pour préparer les cellules tumorales liquides pour le tri fluorescent par cytométrie en flux, commencez par Ali en citant un millilitre de l’échantillon de cellules mononucléées humaines en suspension dans le PBS plus 2 % FBS pour le contrôle négatif, et un millilitre pour chaque colorant fluorescent utilisé dans la coloration finale. Ensuite, incubez les cellules avec les anticorps appropriés pour isoler la population de cellules leucémiques et pour les contrôles de compensation sur glace.

Après 30 minutes, lavez les cellules deux fois avec du PBS plus 2 % FCS. Ajoutez ensuite une coloration de viabilité cellulaire dans les tubes appropriés et triez les cellules selon le schéma. Collecte des échantillons en IMDM plus 10 %FCS pour collecter les tumeurs solides par microdissection par capture laser.

Tout d’abord, utilisez un microtome pour couper des sections de cinq à 10 micromètres d’épaisseur à partir d’échantillons fixés en paraffine de formine. Ensuite, montez les sections sur des lames de membrane recouvertes d’un film et séchez les échantillons à 37 degrés Celsius après une heure. Dépariser et réhydrater les sections par incubations successives d’une minute dans de l’éthanol absolu de xylène, de l’éthanol à 70 % et de l’eau.

Colorez ensuite les sections avec de l’hématine pendant 20 secondes. Rincez-les à l’eau du robinet et collectez les cellules d’intérêt avec le système de microdissection par capture laser pour extraire les protéines des cellules tumorales liquides triées. Faites tourner l’échantillon trois fois, en lavant les cellules dans 500 microlitres de PBS froid au cours des deux secondes centrifugations.

Ensuite, incubez les cellules dans 40 microlitres de tampon de lyse par une fois 10 à six cellules. Après 15 minutes, centrifugez le lysat et transférez le surnageant contenant du lysat clair dans un nouveau tube de réaction pour extraire la protéine des cellules tumorales solides micro disséquées. Incuber l’échantillon de tissu avec 60 microlitres de tampon de lyse tissulaire à 72 degrés Celsius.

Après 15 minutes, recueillir le fluide par une courte centrifugation et transférer le surnageant dans un nouveau tube de réaction. Ensuite, sonicez le lysat sur de la glace pendant trois minutes, suivi d’une incubation avec 15 microlitres contenant 20 % de sulfate de sodium ESAL à 99 degrés Celsius dans un bloc chauffant avec 600 tr/min d’agitation. Au bout d’une heure, faites tourner le lysat et transférez le S natin dans un nouveau tube.

Ensuite, déterminez les concentrations protéiques de l’étalon cellulaire et super SLAC, puis mélangez des quantités égales de morceaux de cellules tumorales avec l’étalon super SLAC, suivi du lithium. Faites du tampon de sulfate de dessalement à 25 % du volume de l’échantillon et de l’agent réducteur à 10 % du volume de l’échantillon. Ensuite, chauffez la solution obtenue dans un bloc chauffant pendant 10 minutes à 72 degrés Celsius.

Pour mesurer la concentration en protéines du lysat de tumeur solide sur un lecteur de plaques, mélanger une série de solutions standard de dilution de l’albumine sérique bovine, le lysat et l’étalon super SLAC approprié avec un dosage protéique disponible dans le commerce et une plaque à 96 puits. Après une minute d’agitation, incubez l’échantillon pendant la période de temps appropriée et mesurez l’absorbance comme indiqué par le fabricant. Mélangez ensuite des quantités égales de lysat clarifié et de l’étalon super SLAC avec 200 microlitres d’urée dans une unité de filtration et centrifugez les échantillons pendant 30 minutes.

Analyser les lysats de cellules tumorales par chromatographie liquide et analyse par spectrométrie de masse. Commencez par résoudre les peptides d’intérêt dans 30 microlitres de tampon de charge pendant cinq minutes dans un bain de sonication. Ensuite, faites tourner la protéine et transférez le surnageant clair dans un flacon d’échantillonneur automatique par spectrométrie de masse.

Ensuite, injectez cinq microlitres d’échantillon par analyse dans le nano lc, le système MS autos, l’échantillonneur, et concentrez et dessalez les peptides en ligne dans une configuration de colonne montée et ventilée de phase C 18 préco inversée. Enfin, séparez les peptides sur une micro-colonne de phase C 18 inversée dans une colonne de pulvérisation de nanos auto-rythmée. En utilisant un gradient de 90 minutes de cinq à 35 % d’acétylnitrile contre 0,1 % d’acide formique aqueux à 300 nanolitres par minute, utilisez ensuite une source d’ions de nanopulvérisation pour transférer et analyser les peptides.

En utilisant l’une des 15 principales méthodes d’acquisition dépendantes des données, différents types de spectromètres de masse peuvent être utilisés pour analyser les peptides. Le profilage protéomique des tumeurs liquides et solides des patients est une approche prometteuse pour la découverte de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et prédictifs. Par exemple, cette première figure illustre une stratégie de contrôle exemplaire pour isoler les cellules leucémiques de CD 17 à partir d’un échantillon de tumeur liquide.

Alors qu’ici, une section de cinq à 10 micromètres d’épaisseur montée sur film recouvre des lames de membrane comme nous venons de le démontrer. Comme montré, une région d’intérêt a ensuite été sélectionnée manuellement et excisée par micro dissection par capture laser, l’analyse en grappes non supervisée des profils d’expression protéique d’échantillons de tumeurs liquides et solides peut ensuite être effectuée par spectrométrie de masse, permettant la séparation claire des différentes entités tumorales en fonction de leurs profils d’expression protéique distincts. Ces données peuvent ensuite contribuer à l’établissement de biomarqueurs cliniquement pertinents.

La mise en œuvre de stratégies d’enrichissement pour les modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation ou la ventilation UIC peut également être effectuée pour répondre à des questions supplémentaires telles que, comment les modèles de kinases dérégulés peuvent-ils être identifiés après son développement ? Cette technique permet aux chercheurs du domaine de la pathologie et de l’oncologie d’explorer les biomarqueurs et les voies de signalisation spécifiques dans une variété d’entités cancéreuses. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les protéines des cancers en tant que sous-populations pour analyser leurs modèles d’expression protéique et leurs états de signalisation par spectrométrie de masse.