Name: Blessure mécanique des bateaux dans embryons de poissons zèbres (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Apprenez à créer une blessure mécanique des vaisseaux chez les embryons de Danio rerio pour étudier l'hémostase et la cicatrisation. Cette méthode permet d'observer en temps réel l'inflammation et la réparation vasculaire par microscopie.

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Les auteurs tiennent à remercier les Drs Stephen Wilson et Lisa Wilsbacher pour leurs discussions utiles. Ce travail a été soutenu en partie par les NIH HL054737.

Nota: Les procédures utilisant le poisson zèbre ont été approuvés par Institutional Animal Care UCSF et l&#39;utilisation Comité. 1. Préparation des outils <ol><li> Insérer la goupille de point caractéristique dans un porte-broche et serrer la goupille. </li><li> Utilisation pince fine pointe de, pliez la pointe de la broche pour créer un léger crochet. </li><li> Pour la manipulation et à la stabilisation de l&#39;embryon au cours de blessure, pliez la fin d&#39;une aiguille de ½ pouce 28 jauge montée sur une seringue à insuline en utilisant une pince à bec effilé. </li></ol> 2. Préparation des embryons de poissons zèbres pour blessures <ol><li> Mettre en place couples reproducteurs de poisson zèbre et de ramasser les œufs dans l&#39;eau d&#39;œuf (60ug / mL sels d&#39;aquarium) comme indiqué précédemment 22. </li><li> Ajouter 0,003% de N-phénylthiourée (PTU) à l&#39;eau d&#39;œuf lorsque les embryons sont environ après la fécondation de 8 heures (HPF) pour empêcher mélanisation. </li><li> Dechorionate deux fertilisation poste de jour (DPF) embryons avant l&#39;expérience à l&#39;aide de pince fine de pointe. <br/&gt; NOTE: Les embryons peuvent être blessés à tout moment après le début de la circulation. Les données présentées ici sont pour 2 dpf embryons, mais la technique a été appliquée avec succès dans les embryons jusqu&#39;à 5 dpf. </li><li> Anesthésier les embryons avec 0,02% tamponné acide 3-aminobenzoïque (tricaïne) environ 10 min avant de manipulations. </li></ol> 3. navire mécanique blessures d&#39;embryons <ol><li> Transfert d&#39;embryons anesthésiés à une diapositive de la dépression sur un stéréomicroscope à dissection en utilisant une pipette de transfert. </li><li> En utilisant le côté plat court de l&#39;aiguille de la seringue pour manipuler l&#39;embryon avec la main dominante, placer l&#39;embryon sur le côté avec la face ventrale tournée à l&#39;opposé de l&#39;aiguille. </li><li> Positionner la goupille de minutie avec la pointe dirigée directement contre la surface ventrale de la partie postérieure de poisson à l&#39;ouverture de urogénital. Placez la tige de minutie à un léger angle tel que l&#39;extrémité incurvée est capable de percer le périderme directement dans la veine caudale (Figure 1 &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Utilisation de l&#39;aiguille de la seringue pour manipuler l&#39;embryon, percer la veine caudale avec la broche de point caractéristique en appuyant sur l&#39;embryon dans l&#39;axe pour raccorder la broche légèrement dans la veine. </li><li> Utilisation de l&#39;aiguille de la seringue, l&#39;embryon tirer loin de l&#39;axe de minutie pour créer une petite déchirure dans le récipient. NOTE: Une blessure réussie entraîner des saignements immédiate de la veine. </li></ol> 4. Analyse de l&#39;hémostase <ol><li> Choisissez seuls les embryons avec circulation visiblement cellules sanguines pour cette procédure. </li><li> Préparer la minuterie pour commencer dès que la broche de point caractéristique est extrait de la cuve. </li><li> Lancer la minuterie dès que la perte de sang peut être visualisé à partir de la plaie. Lorsque la perte de sang de la plaie cesse, arrêter le chronomètre et le temps total que Temps de saignement. Si la coagulation est inhibée, enregistrer le temps au moment où il n&#39;y a plus visiblement les cellules sanguines circulantes. </li></ol> 5. Analyse de la cicatrisation <ol><li> Transfert post-blessures animaux dans des plats d&#39;imagerie à fond de verre pour la microscopie. </li><li> Retirer la majorité de l&#39;eau de l&#39;oeuf. </li><li> Couvrir les embryons dans 0,3 à 1,2% bas point de fusion agarose dissous dans l&#39;eau d&#39;œuf, chauffé entre 42 et 45 ° C et additionné de 0,02% tricaïne. </li><li> embryons de position sur leurs côtés à l&#39;aide de pinces. </li><li> Après l&#39;agarose refroidit, remplir la cuve avec 0,02% de tricaïne dans l&#39;eau d&#39;œuf. </li><li> Acquérir des images à l&#39;aide de clair, épifluorescence ou microscopie confocale. </li><li> Retirer embryon à partir de l&#39;agarose en utilisant une pince et transfert retour à l&#39;eau d&#39;œuf. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le poisson zèbre ont été utilisés avec succès en tant que modèle pour les différents types de plaies, y compris les blessures laser 13 à 15, la thrombose induite par laser 16, 10 et épithéliale blessant. Nous rapportons une méthode de blessure mécanique qui est simple à exécuter et produit une blessure contrôlée dans un modèle in vivo qui est prête très bien à la microscopie en temps réel. Résultats de blessures dans une réponse hémostatique rapide et mesurable et un programme de ...

Les poissons-zèbres ont été largement utilisés pour étudier une variété de sujets en biologie vasculaire, y compris le développement vasculaire, l’angiogenèse, le développement hématopoïétique et la pathologie1-3. Les embryons développent une circulation fonctionnelle ainsi que des leucocytes et d’autres composants du système immunitaire inné 1 jour après la fécondation (dpf) 1,4,5. La conservation de la réponse inflammatoire et leucocytaire aux lésions a fait de l’embryon de poisson-zèbre un modèle informatif pour des processus inflammatoires aussi divers que l’infection tuberculeuse, l’entérocolite et la régénération tissulaire6-9. Les embryons de poisson-zèbre ont été utilisés pour étudier l’inflammation liée à une blessure, en particulier dans le contexte des lésions épithéliales et de la réponse des neutrophiles10,11. Les lésions infligées à l’embryon entraînent une réponse cellulaire hautement conservée des cellules situées sur le site de la lésion et des cellules immunitaires innées recrutées pour répondre à la lésion et réguler sa résolution11,12. D’autres modèles de lésions ont utilisé des impulsions laser focalisées pour localiser spatialement les lésions dans des types de cellules spécifiques, notamment les neurones, les cellules musculaires et les cardiomyocytes13-15. 
Les embryons de poisson-zèbre ont été utilisés comme modèle pour étudier l’hémostase et la thrombose dans des conditions de manipulation pharmacologique et génétique, en utilisant à la fois la formation mécanique et induite par laser16-19. Les composants de la cascade de coagulation semblent être bien conservés et les transgéniques ont permis d’étudier en détail le dépôt de thrombocytes et de fibrine au site de la coagulation17,20,21. La procédure présentée dans cet article complète ces méthodes en fournissant un système d’étude des lésions mécaniques des vaisseaux entraînant une brèche dans les vaisseaux, la formation et la résolution de thrombus et la réparation des vaisseaux.

<table><tbody><tr><td>Goupilles Minutia</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10 Diamètre de</td><td>la pointe 0,0125 mm, diamètre de la tige 0,1 mm</td></tr><tr><td>Porte-goupille</td> Outils <td>de science fine</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pince à pointe fine</td><td>Outils de science fine 11254-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lame de dépression en verre</td><td>Écosystèmes aquatiques</td><td>M30</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Lonza&nbsp ;</td><td>50081</td><td>Préchauffé à 42 &ordm ; C</td></tr><tr><td>N-Phénylthiourée (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Acide 3-aminobenzoïque (Tricaïne)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H7016</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes d’imagerie à fond de verre</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à dissection</td><td>Olympus</td><td>SZH10</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td>Sels d’aquarium</td><td>Seringue à insuline Instant Ocean</td><td></td><td></td></tr><tr><td>avec aiguille de 28,5 G</td><td>Becton Dickinson&nbsp ;</td><td></td><td></td>329461</tr></tbody></table>

blessure mécanique des bateaux dans embryons de poissons zèbres

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Les embryons de poisson-zèbre (Danio rerio) se sont avérés être un modèle puissant pour l’étude d’une variété de processus de développement et de maladies. Le développement externe et la transparence optique rendent ces embryons particulièrement sensibles à la microscopie, et de nombreuses lignées transgéniques qui marquent des types de cellules spécifiques avec des protéines fluorescentes sont disponibles, ce qui fait de l’embryon de poisson-zèbre un système idéal pour visualiser l’interaction des types de cellules vasculaires, hématopoïétiques et autres lors de lésions et de réparations in vivo. La génétique directe et inverse chez le poisson-zèbre est bien développée, et la manipulation pharmacologique est possible. Nous décrivons un modèle de lésion vasculaire mécanique à l’aide de techniques de micromanipulation qui exploite plusieurs de ces caractéristiques pour étudier les réponses aux lésions vasculaires, y compris l’hémostase et la réparation des vaisseaux sanguins. En utilisant une combinaison de microscopie vidéo et timelapse, nous démontrons que cette méthode de lésion vasculaire entraîne des réponses mesurables et reproductibles pendant l’hémostase et la réparation de la plaie. Cette méthode fournit un système permettant d’étudier en détail les lésions vasculaires et la réparation dans un modèle animal entier.

Lésion vasculaire mécanique a été effectuée sur deux dpf embryons (Figure 2A - C). Résultats de blessures dans une réponse rapide et fiable la coagulation telle que mesurée par le temps à la cessation du saignement (figure 2D). Pour déterminer si les différences dans la réponse de coagulation peuvent être mesurés, l&#39;hirudine anticoagulant a été administré à des embryons par injection dans le canal de Cuvier immédiatement avant la blessure (10.5 nl de 1 unité par ml ...

Cet article décrit une méthode pour créer une lésion mécanique des vaisseaux chez les embryons de poisson-zèbre. Ce modèle de blessure fournit une plate-forme pour étudier l’hémostase, l’inflammation liée à une blessure et la cicatrisation des plaies dans un organisme parfaitement adapté à la microscopie en temps réel.

Blessure mécanique des bateaux dans embryons de poissons zèbres

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Le but global de la procédure suivante est de créer une lésion vasculaire mécanique chez des embryons de poisson zèbre. Cette lésion est réalisée en perforant la veine coddle de l'embryon de poisson zèbre à l’aide d’une aiguille minutieuse. Ensuite, l’hémostase est évaluée en mesurant la durée pendant laquelle le sang s’écoule activement depuis la plaie.Ensuite, une microscopie en lapse de temps est réalisée afin de visualiser des aspects de la cicatrisation, tels que la réparation des vaisseaux. Les résultats montrent que les lésions mécaniques des vaisseaux chez les embryons de zebrafish peuvent être utilisées pour mesurer de manière reproductible des paramètres relatifs à l’hémostase et à la réparation tissulaire, comme les temps de saignement et la durée nécessaire pour rétablir le flux sanguin. Le principal avantage de cette technique par rapport aux modèles murins et à d'autres modèles de lésion standards réside dans le fait que, chez l'embryon de zebrafish, l'inflammation, l'hémostase et la réparation peuvent facilement être observées en temps réel par microscopie.Pour commencer, insérez une pointe de minutie dans un support de pointe et fixez-la à l’aide de pinces fines. Courbez délicatement l’extrémité de la pointe pour former un léger crochet permettant de manipuler et de stabiliser l’embryon pendant la blessure. Utilisez une pince à bec effilé pour courber l’extrémité d’une aiguille de calibre 28, d’un demi-pouce, montée sur une seringue à insuline.Ensuite, préparez des embryons de poisson zèbre en mettant en place des couples reproducteurs et en collectant les œufs dans de l'eau pour œufs comme indiqué précédemment. Lorsque les embryons atteignent un stade de huit à 24 heures post-fécondation, ou HPF, ajoutez du PTU à l'eau pour œufs afin d'empêcher la pigmentation à deux jours post-fécondation, ou DPF. Utilisez des pinces fines pour dégorger les embryons, puis anesthésiez-les à l'aide d'une concentration finale de 0,02 % de trica tamponné afin de provoquer une lésion mécanique des vaisseaux sanguins embryonnaires.Utilisez une pipette de transfert pour placer les embryons anesthésiés sur une lame creuse. En maintenant un microscope stéréoscopique, tenez du côté dominant l'aiguille de seringue par son extrémité courte et plate, puis positionnez l'embryon sur le côté, la surface ventrale orientée à l'opposé de l'aiguille. Placez ensuite la pointe de la minutie de manière à ce qu'elle soit dirigée exactement contre la surface ventrale du poisson, en arrière de l'orifice urogénital.Placez-le selon un léger angle afin que la pointe courbe puisse percer le péricarpe directement dans la veine coddle. Ensuite, utilisez l’aiguille de la seringue pour manipuler l’embryon. Utilisez l’aiguille de minutie pour percer la veine coddle en tapotant l’embryon contre l’aiguille, de manière à accrocher légèrement la veine avec l’aiguille de la seringue.Tirer l'embryon loin de l'aiguille de minutie afin de créer une petite déchirure dans le vaisseau. Une lésion réussie entraînera un saignement immédiat de la veine. Pour cette procédure, choisir uniquement les embryons présentant des cellules sanguines en circulation visible.Avec l'épingle minutieuse en place, retirez-la du vaisseau et dès que la perte de sang devient visible au niveau de la plaie, déclenchez un chronomètre. Lorsque l'hémorragie cesse, arrêtez le chronomètre et enregistrez le temps total comme temps de saignement ; si la coagulation est inhibée, enregistrez le moment où il n'y a plus de cellules circulantes visibles. Transférez les animaux après la blessure dans des boîtes de microscope à fond en verre pour l'imagerie, puis retirez la majeure partie de l'eau d'œuf, suivie d'un supplément de 0,3 à 1,2 % d'agarose à bas point de fusion additionnée de 0,02 % de trica et chauffée entre 42 et 45 degrés Celsius. Recouvrez les embryons.Utilisez une pince pour positionner les embryons sur le côté. Une fois que l'aro a refroidi, remplissez la boîte avec 0,02 % de trica dans de l'eau pour œufs. Utilisez un microscope à épifluorescence en champ clair ou un microscope confocal pour acquérir des images après l'acquisition d'images.Utilisez une pince pour transférer les embryons dans l'eau pour œufs. Cette vidéo montre une lésion mécanique du vaisseau réalisée sur un embryon PF 2D. Une perte de sang active est visible, suivie d'un arrêt du saignement ; la lésion provoque une réponse de coagulation rapide et reproductible, mesurée par le temps nécessaire à l'arrêt du saignement, afin de déterminer si des différences dans la réponse de coagulation pouvaient être observées.L'anticoagulant odin a été administré aux embryons par injection dans le canal de QVA immédiatement avant la blessure. Comme illustré ici, le médicament a augmenté de manière significative les temps de saignement par rapport au témoin véhiculaire. Dans cette vidéo, des signes de dommages vasculaires et de coagulation peuvent être observés immédiatement après la lésion à l'aide de lignées transgéniques exprimant des marqueurs de l'endothélium et des globules rouges.Des images ont été acquises toutes les cinq minutes pendant une période de 12 heures, montrant les différentes étapes de la réparation de la plaie. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'induire une lésion mécanique chez des embryons de poisson zèbre.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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