Name: Validation des Nanobodies et Anticorps Based In Vivo Expériences tumeur xénogreffe NIRF-imagerie dans des souris en utilisant Ex Vivo Cytométrie en flux et microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Apprenez la validation d'imagerie NIRF in vivo par cytométrie en flux et microscopie ex vivo chez des souris porteuses de xénogreffes tumorales. Cette méthode améliore la spécificité des anticorps fluorescents.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;école doctorale «Inflammation et la régénération» du Centre de recherche en collaboration 841 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Alexander Lenz, Valentin Kunick, William Fumey), par le Centre de recherche en collaboration 877 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Friedrich Koch-Nolte) , par la Fondation Werner Otto (Peter Bannas), par la Fondation Wilhelm Sander (Peter Bannas, Friedrich Koch-Nolte), et par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Martin Trepel, Friedrich Haag et Friedrich Koch-Nolte). Nous remercions l&#39;Université Cancer Center Hamburg (UCCH) dans un établissement de Vivo optique Imaging Core et le personnel de l&#39;UKE de consultation et de leur service de haute qualité. L&#39;installation de base a été financé en partie par des subventions de Deutsche Krebshilfe (Aide allemande contre le cancer).

NOTE: Des expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices internationales sur l&#39;utilisation éthique des animaux et ont été approuvés par la commission de l&#39;University Medical Center, Hambourg bien-être animal local. 1. Préparation des cellules tumorales, les souris et les constructions d&#39;anticorps <ol><li> Préparation des cellules de lymphome et le sous-sol Aliquotage Matrix (Matrigel). <ol><li> Le jour avant l&#39;injection des cellules tumorales mis une boîte stérilisée de pointe (1000 conseils de pi) et la pipette appropriée -20 ° C congélateur. </li><li> Décongeler la bouteille avec la matrice du sous-sol sur la glace dans le réfrigérateur à 4 ° C O / N. </li><li> Le jour de l&#39;injection remplir un seau à glace et placer la matrice de sous-sol avec pipette, les pointes, et seringues de 1 ml avec 30 g d&#39;aiguilles sur la glace. </li><li> des cellules de lymphome de l&#39;aliquote en un volume de 100 ul de milieu RPMI à 1,5 ml des tubes de microcentrifugation et mélanger soigneusement avec 100 pl de la matrice de sous-sol. Aspirer dans une pré-refroidiseringues et mis sur la glace jusqu&#39;à l&#39;injection. REMARQUE: Utilisez la bonne technique stérile et de travailler sur la glace tout le temps pour éviter le colmatage de la matrice de sous-sol. </li></ol></li><li> Souris Préparation <ol><li> Utilisez 8-10 semaines vieille souris nude athymiques (NMRI- Foxn1 n u). </li><li> Pour réduire autofluorescence de l&#39;intestin garder souris sur un régime sans luzerne pour 1 semaine avant l&#39;imagerie in vivo. </li><li> Pour l&#39;injection des cellules de lymphome de souris pour effectuer anesthésier avec 2% d&#39;isoflurane dans une chambre d&#39;induction. Maintenir 1-2% d&#39;isoflurane pendant la durée de la procédure en utilisant un collecteur isofluorane. </li><li> Injecter des cellules de lymphome sous-cutanée dans les flancs de l&#39;épaule. A titre de comparaison intra-individuelle directe injecter des cellules positives à l&#39;antigène et de l&#39;antigène négatif sur le côté droit et gauche respectivement. <ol><li> Utilisez le pouce et l&#39;index pour pincer la peau de la souris et tirez loin du corps de la souris. Injecter lentement et uniformément dansla poche créée par les doigts, la création d&#39;un cluster unique des cellules sous la peau. La matrice de sous-sol aide à garder cellules injectées en place. </li></ol></li></ol></li><li> Préparation des anticorps Les constructions <ol><li> Étiqueter les anticorps monoclonaux et nanocorps de domaine unique avec un kit de marquage de protéines disponibles dans le commerce pour le colorant fluorescent AlexaFluor-680 (AF680) (onde d&#39;excitation = 679 nm, longueur d&#39;onde d&#39;émission = 702 nm) selon les instructions du fabricant. Calculer le nombre de colorants par nanocorps et anticorps classique en utilisant des coefficients d&#39;extinction molaires de 15 720 mol -1 cm -1 et 203 000 mol -1 cm -1, respectivement. Évaluer la pureté des constructions d&#39;anticorps par SDS-PAGE taille fractionnement et bleu brillant Coomassie. </li><li> Assurer la spécificité des conjugués marqués en procédant à une série d&#39;expériences in vitro avant que les études d&#39;imagerie réels. Test de la spécificité d&#39;un étiquetétibody construit in vitro grâce à des études de blocage et non spécifique isotype contrôle 8,20. NOTE: Dans l&#39;étape 1.2.4 nombre de cellules pour cellules présentatrices d&#39;antigène négative et positives à l&#39;antigène (ou des différentes lignes de cellules) peut être adapté en fonction de différents taux de croissance. Pour ces expériences, les cellules positives 0,5x10 6 DC27.10 ARTC2 négatif et 1,5x10 6 DC27.10 ARTC2 ont été utilisés pour obtenir des tumeurs de taille similaire. Dans l&#39;étape 1.3.1 le processus de l&#39;étiquetage et l&#39;étiquetage efficacité des sondes anticorps avec des fluorophores peut différer par le kit de marquage utilisé. </li></ol></li></ol> 2. In Vivo Imaging <ol><li> Après 7-9 jours, lorsque les tumeurs atteignent environ 8 mm de diamètre, 50 ug d&#39;injecter AlexaFluor680 constructions d&#39;anticorps marqué dans un volume de 200 ul de solution saline par voie intraveineuse dans la veine caudale de la souris (mAb-AF680: 50 ug avec deux colorants / molécule ≈ ~ 4 ^ 14 fluorochromes ≈ ~ 0,8 ug fluorochromes; Nanobody-AF680: 50 μ0,3 g de colorants / molécule ~ 5,6 ≈ 14 ^ ~ fluorochromes ≈ 1,1 ug fluorochromes). </li><li> Initialiser le système d&#39;imagerie et anesthésier les souris pour effectuer avec 3% d&#39;isoflurane utilisant un système d&#39;anesthésie XGI-8 dans la chambre d&#39;induction avant l&#39;imagerie. Maintenir 1-2% d&#39;isoflurane pendant la durée de la procédure de formation d&#39;image à l&#39;aide du collecteur isoflurane logé dans la chambre d&#39;imagerie. <ol><li> souris de position sur la scène de l&#39;imagerie chauffée avec des tumeurs dirigés vers la caméra. Surveiller la bonne anesthésie en pinçant l&#39;orteil ou de la queue de l&#39;animal; aucune réaction de l&#39;animal indique que l&#39;anesthésie est trop léger. </li><li> Surveiller le taux de respiration; l&#39;anesthésie est trop léger si le taux de respiration est augmentée et trop profond si le taux de respiration est diminuée, profonde ou irrégulière. Protéger les cornées de l&#39;animal avec une pommade ophtalmique pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. </li></ol></li><li> Choisissez jeux de filtres fluorescents de 615 à 665 nm pour l&#39;excitation, de 695 à 770 nm pour EMISSIOn, et de 580 à 610 nm pour l&#39;excitation soustraction de fond 51 avec une taille de 2 x 512 matrice de pixels. Réglez le temps d&#39;exposition à l&#39;auto, pixel binning à moyen et F / STOP pour deux. REMARQUE: Réduction des temps d&#39;exposition permettent plus rapides des taux de trame; plus longues durées d&#39;exposition offrent une plus grande sensibilité. Regroupement contrôle la taille de pixel sur la caméra CCD. L&#39;augmentation de la catégorisation augmente la taille du pixel, la sensibilité, et la cadence, mais réduit la résolution spatiale. F / arrêt définit la taille de l&#39;ouverture de l&#39;objectif de la caméra. La taille de l&#39;ouverture contrôle la quantité de lumière détectée et la profondeur de field.Note que les paramètres peuvent différer par le dispositif et expérimentale mise en place d&#39;imagerie. Consultez le manuel du fabricant pour des résultats optimaux. <ol><li> Dans le logiciel d&#39;imagerie temps d&#39;exposition d&#39;optimiser, F / arrêt et pixel binning basés sur le niveau de la lignée cellulaire d&#39;expression. Modifier ces paramètres à tout moment au cours d&#39;une expérience sans impact sur le résultat quantitatif. Sinon, laissez le logiciel Assistant Imaging déterminer automatiquementles paramètres. </li></ol></li><li> souris de l&#39;image avant l&#39;injection et 6 heures après l&#39;injection de constructions d&#39;anticorps. NOTE: L&#39;efficacité de l&#39;étiquetage peut influer sur la dose nécessaire requis pour des résultats optimaux d&#39;imagerie. Par conséquent, la quantité d&#39;anticorps requise-assemblage pour un résultat optimal d&#39;imagerie doit être déterminée de manière empirique. Elle peut varier en fonction de l&#39;efficacité de marquage et la taille de la construction ainsi que le modèle de tumeur et l&#39;expression de l&#39;antigène cible. </li></ol> 3. La récolte et la préparation des tumeurs <ol><li> Remplir un seau à glace et placer 4% de paraformaldehyde (PFA) une solution saline tamponnée phosphate (PBS) / inhibiteur de protease (AEBSF) et du PBS / 0,2% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) sur de la glace. </li><li> Une fois la session de formation d&#39;image est terminée, augmenter la concentration d&#39;isoflurane à 4%. Après animaux cesse la respiration, le retirer de la scène d&#39;imagerie et d&#39;effectuer dislocation cervicale. </li><li> Mont souris sur un bloc de polystyrène et de pulvérisation avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Utilisez ciseauxs et une pince pour couper la peau extérieure et le tirer en arrière soin d&#39;exposer les tumeurs. Enlever des tumeurs au bistouri pour assurer le tissu tumoral reste intacte. </li><li> Tumeurs couper en deux à l&#39;aide d&#39;un scalpel. Placer une moitié dans un tube de prélèvement avec du PBS / AEBSF pour les analyses FACS, et l&#39;autre moitié dans un tube de 50 ml avec 4% de PFA pour l&#39;immunohistochimie. </li><li> Préparation pour l&#39;immunohistochimie <ol><li> Gardez tumeurs dans 4% PFA dans le réfrigérateur à 4 ° C pendant 24 heures. Transfert des tumeurs à un tube avec du PBS / 30% de saccharose et de garder au réfrigérateur à 4 ° C jusqu&#39;à ce que les puits de la tumeur au fond du tube. </li><li> Couper les tumeurs en morceaux appropriés pour les cryomoules. Mettez les tumeurs dans cryomoules et remplir avec le composé octobre afin que les tumeurs sont couverts. </li><li> Mettez les moules sur glace sèche et d&#39;attendre jusqu&#39;à ce que le composé est complètement gelé. Transfert tumeurs congelés à -80 ° C congélateur et stocker pour l&#39;immunohistochimie. </li><li> Cut gelé tumeurs dans les sections de 8 pm avec un microtome. Utilisez immunohistochimique normeprotocole de chimie pour colorer avec un anticorps contre CD31-AF488 de visualiser les vaisseaux sanguins et diamidino-phénylindole (DAPI) pour visualiser les noyaux. NOTE: Les sections de tumeurs sont très sensibles à la lumière, car ils contiennent déjà des anticorps marqués par fluorescence. Minimiser l&#39;exposition à la lumière, autant que possible. </li></ol></li><li> Préparation pour l&#39;analyse FACS <ol><li> Placez boîte de Pétri sur de la glace et enlever le piston d&#39;une seringue 2,0 ml. Mettez la tumeur dans le tamis cellulaire et coupez-le délicatement dans 3-4 morceaux à l&#39;aide d&#39;un scalpel. Verser la première PBS dans la boîte de Pétri et utiliser le bout plat du piston pour écraser la tumeur dans le tamis cellulaire. </li><li> Rincer la crépine de la cellule avec l&#39;initiale PBS pour laver toutes les cellules avec une pipette de 10 ml. Transfert suspension de cellules dans un nouveau tube et de spin à 500 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS / BSA à 0,2%. Compter les cellules. </li><li> Aliquotes 1-5 x 10 6 cellules de lymphome dans un FACS tube 5 ml. cellules Spin nouveau (500XG), éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 100 ul de PBS / BSA à 0,2%. </li><li> Eventuellement, le bloc FcR utilisant un anticorps anti-CD16 / CD32 mAb-(FcgR3 / 2) qui se lie à FcyR sur de la glace pendant 10 min. Laver les cellules une fois avec du PBS / 0,2% de BSA. </li><li> Ajouter anti-CD45-mAb de discriminer leucocytes d&#39;autres cellules. Incuber pendant 20 min sur de la glace dans l&#39;obscurité, suivie par deux lavages avec du PBS / 0,2% de BSA. </li><li> Juste avant l&#39;analyse FACS tache avec l&#39;iodure de propidium pendant 15 min sur la glace de discerner les cellules mortes, suivi par deux lavages avec PBS plaine. Remettre en suspension dans 150 ul pour analyse FACS. NOTE: Dans l&#39;étape 3.7.4 et 3.7.5 étape autres anticorps peut être utilisé en fonction de l&#39;entité de la tumeur. </li></ol></li></ol> 4. Analyse FACS <ol><li> Utilisez une série d&#39;outils de déclenchement à la porte la population d&#39;intérêt sous forme de grande dispersion, la discrimination de doublet, l&#39;exclusion des cellules mortes, gating pour les cellules positives CD45 et gating pour les cellules positives à l&#39;antigène. <ol><li> Dans un premier temps, porte sur cellulaireles débris dans une diffusion vers l&#39;avant (FSC-A) par rapport à la diffusion latérale (SSC-A) en utilisant un terrain à deux paramètres. Doublets de cellules de rejet suivante. Enfin, sur la porte non CD45-positives à l&#39;antigène (CD45) et morts / cellules mourantes (LD - / morts-tache en direct). </li></ol></li><li> échantillons de disques utilisant le même modèle pour toutes les expériences. NOTE: Consultez le protocole du fabricant pour obtenir des conseils techniques sur l&#39;utilisation du matériel et des logiciels d&#39;analyse. </li></ol> 5. Analyse microscopique <ol><li> Analyser cryosections tumorales colorées en utilisant un microscope confocal avec une lentille à immersion d&#39;huile (objectif 40X). Utilisez un Il-Neon 633 nm excitation laser de AF680, un laser Argon pour AF488, et un 405-Diode pour DAPI. </li><li> Traiter les données d&#39;image RAW à l&#39;aide d&#39;un logiciel compatible avec le microscope. Effectuer fond de correction et de filtrage du bruit si nécessaire. Effectuez les réglages d&#39;image supplémentaires telles que la coupe, recadrage ainsi que les réglages de luminosité et de contraste. <ol><li> Enfin generate une image composite unique de superposition de tous les canaux de détection. Régler la luminosité et le contraste des couches individuelles. Les images composites montreront localisation de cellules (DAPI-tache, bleu), la distribution de constructions anticorps marqué (AF680-taches, rouge) et les vaisseaux sanguins (AF488-taches, vert). </li></ol></li></ol> 6. Analyse Vivo Imaging <ol><li> Ouvrir des fichiers image dans un logiciel d&#39;imagerie et de créer une image de superposition en combinant les données d&#39;image de photographie avec des données d&#39;image de fluorescence. Optimiser l&#39;affichage de l&#39;image en éliminant autofluorescence des tissus signal de fond du signal fluorescent spécifique. Cela peut être fait en soustrayant l&#39;image acquise avec un filtre de fond définir à partir de l&#39;image acquise avec le filtre spécifique pour mettre le traceur. </li><li> Dessinez régions de mesure circulaires identiques d&#39;intérêt (ROI) autour de la tumeur antigène-positive et la tumeur de l&#39;antigène négatif. Pour déterminer fond intensité du signal, placez un ROI circulairedans une zone de l&#39;animal où il est prévu signal de fluorescence est faible (par exemple, la jambe de derrière). <ol><li> Utilisez les mêmes ROI pour tous les animaux à tous les points de temps. Pour le positionnement, utilisez les images en noir et blanc photographiques pour identifier les marges tumorales. </li></ol></li><li> Affichage des données ROI dans une table de mesure. Utiliser les données d&#39;efficacité moyenne radiante, qui permet une comparaison plus quantitative des signaux fluorescents pour d&#39;autres analyses statistiques. <ol><li> Comparer les données d&#39;affichage et que les intensités de signaux absolus ou calculer le rapport signal sur bruit de fond en utilisant les données de mesure issues de ROI tissu cible et le tissu de fond. Calculer le rapport tumeur à fond en divisant la valeur d&#39;absorption de la tumeur par la valeur d&#39;arrière-plan déterminée à partir de la patte postérieure. </li><li> Comme témoins, analyser également des tumeurs antigène-négatives et positives à l&#39;antigène dans les mêmes animaux ainsi que des animaux injectés avec contrôles isotypiques marqués d&#39;évaluer la spécificité des signaux in vivo. </li></ol></li&gt; </ol>

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</ol>

Friedrich Koch-Nolte et Friedrich Haag reçoivent une part des ventes d’anticorps et de protéines par l’intermédiaire de MediGate GmbH, une filiale en propriété exclusive du Centre médical universitaire de Hambourg-Eppendorf.

Nous avons utilisé le proche infrarouge fluorophores nanocorps marqués et d&#39;anticorps monoclonaux conventionnels dirigés contre la même cible sur les cellules de lymphome pour une comparaison multimodale in vivo et ex vivo analyses. Nous avons montré que nanocorps sont bien adaptés comme outils de diagnostic pour la détection rapide et spécifique in vivo des lymphomes. In vivo, s + 16a 680 permis une détection rapide et plus spécifique de xénogreffes de ARTC2 positif. Outre les différentes cinétiques pour un affichage optimal de la tumeur in vivo, l&#39;inconvénient majeur de Nika102 680 était le signal non spécifique élevée de tumeurs et de signaux de fond non spécifiques ARTC2 négatif. Analyse ex vivo cytométrie de flux de cellules dispersées provenant de tumeurs disséquées ont montré aucune liaison non spécifique à des cellules de lymphome ARTC2 négatif de AF680-conjugués injectés. Ex vivo ont révélé une forte fluorescence et presque homogèneous coloration des cellules tumorales dans les sections ART2C-positive en cas de + 16a de la nanocorps, confirmant que le nanocorps était en mesure d&#39;atteindre les zones reculées, même au sein de la tumeur après 6 h. En revanche, l&#39;anticorps monoclonal a présenté une coloration plus faible et homogène de cellules dans les tumeurs ARTC2 positif après 6 heures. Résultats de l&#39;imagerie mieux avec les anticorps classique peuvent être atteints après 24 h ou 48 h (données non présentées). Pour effectuer une comparaison approfondie des deux constructions différentes tailles, imagerie à des moments différents (série-imagerie) doit être effectuée pour identifier le point de temps d&#39;imagerie optimale pour chaque construction. Comme d&#39;autres études antérieures, les résultats présentés ici soulignent que in vivo l&#39;imagerie moléculaire avec nanocorps marqués permet l&#39;imagerie de la tumeur même jour rapide et spécifique avec une grande tumeur à-fond ratios 12-15,17-19. Au contraire, les anticorps conventionnels aboutissent à de faibles ratios tumeur à-fond et les signaux non spécifiques de lutte contretumeurs gen-négatives début après l&#39;injection en raison de leur lente clairance du corps. Afin d&#39;obtenir des résultats d&#39;imagerie optimales avec des anticorps conventionnels, le temps d&#39;imagerie fait 24 heures ou même 48 heures après l&#39;injection sont généralement nécessaires. Ces résultats sont en accord avec les études antérieures qui ont suggéré que les anticorps classiques avec un bénéfice thérapeutique avéré ont une utilité limitée en imagerie moléculaire 17,19,26. Par conséquent anticorps conventionnels pourraient être plutôt adapté à des fins thérapeutiques en raison de leur longue demi-vie plasmatique tout nanocorps sont plutôt adaptés à des fins d&#39;imagerie en raison de leur élimination rapide de la circulation. Ces différences sont dues au fait que l&#39;excédent des petits nanocorps (15-17 kDa) est rapidement éliminé par l&#39;élimination rénale tout excès d&#39;anticorps conventionnels plus grands (150 kDa) est retenu dans la circulation. Donc, l&#39;avantage majeur de nanocorps pour l&#39;imagerie moléculaire est le signal de fond bas à des moments d&#39;imagerie début regardless de la dose injectée. Cela permet même imagerie par jour et pourrait être traduisible au réglage. Au contraire cliniques, les anticorps conventionnels doivent être exactement titré à minimiser les signaux de fond non spécifiques, tout en conservant suffisamment de signal spécifique du tissu ciblé (données non publiées). L&#39;une des limitations de la technique in vivo d&#39;imagerie NIRF est la faible profondeur de pénétration qui permet généralement de l&#39;imagerie sous-cutanée uniquement mais non de modèles de tumeur orthotopique. Toutefois, cette limitation pourrait être surmonté dans un cadre expérimental par les techniques de photo-acoustique tomographiques récemment développées qui permettent imagerie du corps entier de la vie des souris 27. Une autre limite de la technique d&#39;imagerie NIRF est l&#39;évaluation de la dose de tissu par rapport à l&#39;imagerie par radionucléide médiée. Cependant, les Nanobodies peuvent être radiomarqués pour la tomographie par émission de positons (TEP) de modèles de xénogreffes et évaluation quantitative exacte detraceur biodistribution. En effet, nos résultats NIRF-imagerie sont conformes à une récente étude qui a comparé nanocorps et des anticorps conventionnels pour l&#39;imagerie PET. Les auteurs sont également venus à la conclusion que nanocorps permettent imagerie même jour avec une grande tumeur à-fond rapports 15. Cependant, seul le marquage de produits d&#39;assemblage d&#39;anticorps avec le proche infrarouge de colorant fluorescent AF680 nous a permis la complète in vitro, in vivo et ex vivo comparaison proche infrarouge imagerie par fluorescence en utilisant la cytométrie en flux, la microscopie à fluorescence, et NIRF-imagerie. Pour cette raison, et parce qu&#39;il est non radioactif, très sensible, peu coûteux, et utilise relativement facile à produire des sondes ciblées, nous préconisons l&#39;utilisation de la technique NIRF-imagerie pour l&#39;évaluation de nouvelles constructions d&#39;anticorps dans l&#39;imagerie moléculaire préclinique.

Dans le présent rapport, nous décrivons la mise en œuvre du proche infrarouge fluorophores sondes marquées pour la validation des expériences in vivo dans d&#39;imagerie de xénogreffe en utilisant ex vivo cytométrie en flux et microscopie de fluorescence des tumeurs de xénogreffe disséqués. Nous comparons une seule Nanobodies de domaine (s + 16a, 17 kDa) 1 et un anticorps monoclonal (Nika102, 150 kDa) 2,3 dirigés vers le même antigène cible pour spécifique in vivo dans le proche infrarouge imagerie de fluorescence dans un modèle de lymphome de xénogreffe. L&#39;antigène cible ADP-ribosyltransférase ARTC2.2 est exprimée en surface cellulaire ecto-enzyme GPI ancrée par des cellules de lymphome 4-9. Nanobodies dérivés de chaîne lourde de camélidé seule anticorps sont les plus petits disponibles fragments de liaison d&#39;antigène 10,11. Avec seulement ~ 15 kDa, ces petits fragments d&#39;anticorps sont solubles, très stable et sont effacés de la circulation rénale 8,10. Tes propriétés les rendent particulièrement appropriés pour le ciblage spécifique et efficace des antigènes tumoraux in vivo 12-20. Les cibles antigéniques communs de Nanobodies disponibles sont le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR1 ou HER-1), humaine croissance épidermique de type facteur 2 (HER-2 ou CD340), l&#39;antigène carcino-embryonnaire (CEA) et l&#39;adhésion cellulaire vasculaire molécule-1 (VCAM-1 ) 21. conjugués Nanobodies sont des outils prometteurs pour l&#39;immunothérapie du cancer et le traitement des maladies inflammatoires 22. Des études récentes ont montré que plus la tumeur nanocorps permettent à fond (T / B) -ratios que les anticorps classiques dans les applications d&#39;imagerie moléculaire in vivo 8,17,19. Ceci se explique principalement par la pénétration de tissu relativement pauvre et lente des anticorps conventionnels, lente clairance de la circulation, et de longue rétention dans les tissus non ciblés 23. En outre, l&#39;excès d&#39;anticorps conventionnels conduit à l&#39;accumulation non spécifique itumeurs antigène négative n cibles causées par la perméabilité et une meilleure rétention (EPR) Effet 24,25. Cela signifie que des doses plus élevées d&#39;anticorps classiques peuvent augmenter non seulement les signaux spécifiques, mais également des signaux non spécifiques, ce qui réduit le rapport maximal réalisable tumeur à fond. En revanche, l&#39;augmentation de la dose de Nanobodies augmente les signaux de tumeurs positives à l&#39;antigène mais non de tissu normal ou des tumeurs de l&#39;antigène négatif (données non publiées). Au-delà de la comparaison des Nanobodies et anticorps classiques, nous présentons une évaluation intra-individuelle de xénogreffes antigène-positives que négatives dans la même souris pour une comparaison directe de signaux spécifiques et non spécifiques en raison de l&#39;effet EPR. Les sondes conjugués fluorophores proche infrarouge nous a permis d&#39;exploiter une seule sonde in vivo et ex vivo utilisant l&#39;imagerie de fluorescence dans le proche infrarouge, cytométrie de flux, et la microscopie de fluorescence. L&#39;application de nos protocoles permet nonoptimisation radioactive, très sensible, et peu coûteuse des expériences in vivo moléculaires d&#39;imagerie telles que l&#39;évaluation de nouvelles constructions d&#39;anticorps spécifique de la tumeur pour le ciblage. L&#39;objectif de cette étude de tutoriel est de mettre en évidence l&#39;utilisation de NIRF-imagerie pour l&#39;évaluation de nouvelles constructions d&#39;anticorps dans l&#39;imagerie moléculaire préclinique. Dans ce protocole, toutes les expériences ont été réalisées avec un système NIRF-imagerie des petits animaux, un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS) cytomètre en flux, et un microscope confocal.

<table><tbody><tr><td>Kit de marquage des protéines AF680</td><td>Invitrogen</td><td>A20172</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD16/CD32</td><td>BioXCell</td><td>BE0008</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD31</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1506</td><td>marqué avec anticorps secondaire avec AF488</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD45 V450</td><td>BD Biosciences</td><td>560501</td><td></td></tr><tr><td>logiciel AxioVision LE</td><td>Zeiss</td><td>www.zeiss.com</td><td></td></tr><tr><td>Matrice de membrane basale</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Un produit alternatif peut être utilisé</td></tr><tr><td>Filtre cellulaire 70 & micro ; m</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>Un autre produit peut être utilisé</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>www.leica-microsystems.com</td><td>Leica SP5 avec les lasers suivants : He-Neon pour AF680, Laser Argon pour AF488 et une diode 405 pour les cellules DAPI</td></tr><tr><td>Sondes</td><td>moléculaires</td><td>DAPI D1306</td><td></td></tr><tr><td>DC27.10.</td><td>spécifique au</td><td></td> laboratoire <td>D’autres cellules avec différentes cibles de surface peuvent être utilisées</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>www.bdbiosciences.com</td><td></td></tr><tr><td>Mircoscope à fluorescence</td><td>Zeiss</td><td>www.zeiss.com</td><td>Zeiss Axiovert 200 avec jeu de filtres #32 pour AF680 : 000000-1031-354</td></tr><tr><td>Logiciel</td><td>ImageJ NIH</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>IVIS 200</td><td>Perkin Elmer</td><td>www.perkinelmer.com</td><td>Système d’imagerie in vivo alternatif peut être utilisé</td></tr><tr><td>Logiciel Leica LAS Logiciel</td><td>Leica</td><td>www.leica-microsystems.com</td><td>spécifique au microscope utilisé</td></tr><tr><td>Logiciel Living Image</td><td>Perkin Elmer</td><td>www.perkinelmer.com</td><td>Logiciel spécifique au système d’imagerie utilisé</td></tr><tr><td>Aiguilles 30 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td>Un autre produit peut être utilisé</td></tr><tr><td>Nika102-anticorps AF680</td><td>spécifique au</td><td></td> laboratoire <td>D’autres anticorps contre différentes cibles de surface peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Dangers potentiels : cancérigène, peut irriter les yeux et la peau, le contact peut provoquer un dessèchement de la peau et/ou une dermatite allergique</td></tr><tr><td>s+16a-nanobody AF680</td><td>laboratoire spécifique</td><td></td><td>D’autres anticorps contre différentes cibles de surface peuvent être utilisés</td></tr><tr><td>Seringues 1 ml</td><td>Braun</td><td>916 1406 V</td><td>Un produit alternatif peut être utilisé</td></tr></tbody></table>

validation des nanobodies et anticorps based<em&gt; in vivo</em&gt; expériences tumeur xénogreffe nirf-imagerie dans des souris en utilisant<em&gt; ex vivo</em&gt; cytométrie en flux et microscopie

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour effectuer la validation ex vivo d’expériences d’imagerie de xénogreffes par fluorescence proche infrarouge (NIRF) in vivo chez la souris à l’aide de nanocorps marqués au fluorophore et d’anticorps conventionnels.
D’abord, nous décrivons comment générer des tumeurs sous-cutanées chez la souris, en utilisant des lignées cellulaires antigéniques négatives comme témoins négatifs et des cellules positives antigéniques comme témoins positifs chez les mêmes souris pour la comparaison intraindividuelle. Nous expliquons comment administrer par voie intraveineuse des nanocorps spécifiques de l’antigène marqués au fluorophore proche infrarouge (AlexaFluor680) et des anticorps conventionnels. L’imagerie in vivo a été réalisée à l’aide d’un système d’imagerie NIRF sur de petits animaux. Après les expériences d’imagerie in vivo, les souris ont été sacrifiées. Nous décrivons ensuite comment préparer les tumeurs pour des analyses ex vivo parallèles par cytométrie en flux et microscopie à fluorescence pour valider les résultats d’imagerie in vivo.
L’utilisation des nanocorps marqués au fluorophore dans le proche infrarouge permet une imagerie non invasive le jour même in vivo. Nos protocoles décrivent la quantification ex vivo de l’efficacité de marquage spécifique des cellules tumorales par cytométrie en flux et l’analyse de la distribution des constructions d’anticorps au sein des tumeurs par microscopie à fluorescence. L’utilisation de sondes marquées au fluorophore dans le proche infrarouge permet d’obtenir une imagerie in vivo non invasive et économique avec la capacité unique d’exploiter la même sonde sans autre marquage secondaire pour des expériences de validation ex vivo utilisant la cytométrie en flux et la microscopie à fluorescence.

Des sondes marquées par fluorescence permettent la combinaison de différentes techniques d&#39;imagerie NIRF (figure 1A). Nous avons cherché à effectuer vivo NIRF-imagerie, la cytométrie en flux et la microscopie de fluorescence de manière séquentielle afin de comparer nanocorps marqués par fluorescence et des anticorps monoclonaux spécifiques pour l&#39;imagerie in vivo (figure 1B). Les souris ont été injectées avec 50 ug d&#39;anticorps monoclonal Nanobodies et d&#39;évaluer la spécificité des produits d&#39;assemblage marqués par fluorescence pour l&#39;imagerie in vivo. Les résultats ont montré un étiquetage spécifique des tumeurs positives à l&#39;antigène à la fois et nanocorps anticorps monoclonal à 6 heures après l&#39;injection (Figure 2). ROI analyse des tumeurs positives à l&#39;antigène a montré un rapport beaucoup plus élevé T / B d&#39;environ 12 pour le rapport de Nanobodies ~ 6 pour l&#39;anticorps monoclonal. En outre, le nanocorps montré aucun signal non spécifique dans les tumeurs de l&#39;antigène négatif, alors que leanticorps monoclonal a montré des signaux de confusion non spécifiques dans les tumeurs de l&#39;antigène négatif. Outre le signal non spécifique des tumeurs négatives, l&#39;anticorps monoclonal a également induit des signaux de fond non spécifique dans l&#39;animal entier. Cela est probablement dû à des anticorps circulants gratuitement excessives, qui sont trop gros pour être excrété par les reins. Au contraire, les animaux injectés avec nanobodies signaux non spécifiques ont montré que dans les reins en raison de l&#39;élimination rénale des petites Nanobodies. La cytométrie en flux analyses de suspensions de cellules tumorales ont montré un marquage spécifique des cellules tumorales positives à l&#39;antigène à la fois conjugués AF680 6 h après l&#39;injection. Le signal de fluorescence plus forte des cellules nanobody marqué par rapport aux cellules productrices d&#39;anticorps monoclonaux marqués reflète les résultats in vivo NIRF-imagerie. Fait important, les analyses de cytométrie en flux révèle qu&#39;il n&#39;y a pas marquage non spécifique des cellules présentatrices d&#39;antigène négatif avec l&#39;un des deuxassemblage (figure 3). La microscopie à fluorescence des coupes cryogéniques de tumeur a montré une forte étiquetage et presque homogène de cellules positives à l&#39;antigène avec la Nanobodies 6 h après l&#39;injection. Au contraire, l&#39;anticorps monoclonal a montré une coloration beaucoup plus faible et plutôt homogène (figure 4A). tumeurs antigène négatif montrent aucune coloration 6 heures après l&#39;injection de la nanocorps, alors que les tumeurs de l&#39;antigène négative injectés avec l&#39;anticorps non spécifique spectacle coloration classique dispersés dans l&#39;espace interstitiel (figure 4B). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig1highres.jpg" /> Figure 1: imagerie Flourescence et constructions d&#39;anticorps. (A) l&#39;installation d&#39;imagerie pour l&#39;évaluation de AF680-conjugués: In vivo NIRF-imagerie suivie par cytométrie en flux et la microscopie de fluorescence. (B </strong&gt;) Schéma de AlexaFluor680 étiqueté + 16a de la nanocorps (rouge) et anticorps monoclonal Nika102 (bleu). Orange étoiles indiquent les fluorochromes AlexaFluor680. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig2highres.jpg" /> Figure 2: In vivo NIRF-imagerie d&#39;images du signal de fluorescence de l&#39;antigène-positive (+) et l&#39;antigène-négatives (-) des tumeurs chez les souris qui ont été injectés avec + l&#39;16a de Nanobodies (A) et l&#39;anticorps monoclonal Nika102 (B). . imagerie in vivo a été réalisée avant (0 h) et 6 h après l&#39;injection. Les intensités de signaux sont affichés sous forme efficacité radiante (p / sec / cm 2 / sr) / (uW / cm 2). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig3highres.jpg" /> Figure 3:Ex vivo analyses FACS de cellules lié constructions d&#39;anticorps à partir de suspensions de cellules tumorales. (A) stratégie déclenchement pour analyses FACS des cellules tumorales. (B) Les histogrammes afficher la quantité de + 16a et anticorps Nika102 du nanocorps AF680 conjugué injecté par voie intraveineuse lié spécifiquement aux cellules tumorales in vivo. tumeurs antigène négatif sont affichés sous forme d&#39;histogrammes en carnet et les tumeurs positives à l&#39;antigène sont affichés sous forme d&#39;histogrammes remplis. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52462/52462fig4highres.jpg" /> Figure 4:. Ex microscopie fluorescence in vivo (A) Vue d&#39;ensemble de la microscopie à fluorescence cryosections tumorales positives à l&#39;antigène entières 6 h après l&#39;injection de s + 16a 680 ou 680 Nika102. Intensités signal du in vivo par voie intraveineuse enjected AF680 conjugués sans aucun agent secondaire étiquetage sont affichées en rouge. Ex vivo noyaux contrecolorées sont affichés en bleu et les navires en vert. Les lignes pointillées indiquent les marges extérieures des tumeurs entières. (B) Gros plan microscopie à fluorescence des tumeurs positives à l&#39;antigène et de l&#39;antigène négatif.

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour effectuer la validation ex vivo d’expériences d’imagerie de xénogreffes de fluorescence dans le proche infrarouge in vivo chez la souris à l’aide de nanocorps marqués au fluorophore et d’anticorps conventionnels.

Validation des Nanobodies et Anticorps Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Expériences tumeur xénogreffe NIRF-imagerie dans des souris en utilisant<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cytométrie en flux et microscopie

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une validation ex vivo d'expériences d'imagerie par fluorescence proche infrarouge in vivo sur des xénogreffes chez la souris, en utilisant des nanocorps ou des anticorps conventionnels marqués avec Fluor four. Cela est réalisé en administrant d'abord des anticorps spécifiques de l'antigène marqués avec un fluorophore proche infrarouge four et des anticorps conventionnels à des souris portant à la fois des xénogreffes positives et négatives pour l'antigène. La deuxième étape consiste à effectuer une imagerie in vivo.Après l'imagerie, les souris sont sacrifiées afin de prélever les xénogreffes, qui sont ensuite préparées pour des analyses ex vivo. En fin de compte, la cytométrie en flux ex vivo et la microscopie à fluorescence sont utilisées pour valider les résultats d'imagerie in vivo. L'avantage de cette méthode par rapport aux méthodes existantes, comme l'imagerie nucléaire, est que l'utilisation d'un colorant fluorescent proche infrarouge permet une comparaison multimodale complète in vitro, in vivo et ex vivo avec une seule sonde, utilisable en cytométrie en flux, en microscopie à fluorescence et en imagerie de fluorescence proche infrarouge.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'imagerie tumorale, telles que la localisation des métastases pendant la chirurgie et le suivi de l'efficacité des thérapies anti-tumorales. La marquage d'anticorps avec fluoro force permet une quantification exacte ex vivo des anticorps liés aux cellules. Cela nous permet de distinguer si les signaux spécifiques que nous observons in vivo sont dus à des anticorps liés à des antigènes de surface cellulaire, ou s'ils sont non spécifiques en raison de l'effet dit de perméabilité et de rétention améliorées.Sept à neuf jours après l'injection des cellules tumorales, lorsque les tumeurs devraient avoir un diamètre d'environ huit millimètres. Préparez-vous d'abord à imager les souris, appliquez un onguent ophtalmique et initialisez le système d'imagerie. Ensuite, placez les souris anesthésiées sur le plateau chauffant avec leurs tumeurs orientées vers la caméra.Conserver un taux de 1 à 2 % d'ISO fluoré pendant toute la durée de la procédure d'imagerie à l'aide du collecteur d'ISO fluoré installé dans la chambre d'imagerie. Surveiller les fréquences respiratoires. Si celle-ci est trop rapide, l'anesthésie est insuffisante ; si elle est lente ou irrégulière, l'anesthésie est trop profonde.Ensuite, imager les souris après avoir obtenu l'image de base. Injecter aux souris 50 microgrammes de LOR six 80 conjugués à des anticorps marqués, dans un volume de 200 microlitres de sérum physiologique par la veine de la queue.Après l'imagerie, euthanasier la souris, puis la fixer sur un bloc de polystyrène et la nettoyer avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, inciser la peau pour exposer les tumeurs. Prélever les tumeurs à l’aide d’un scalpel et conserver les tumeurs intactes.Une fois retirées, coupez les tumeurs en deux moitiés et transférez une moitié dans une boîte contenant une solution de P-B-S-A-E-B-S-F sur de la GLACE pour une analyse par fax, puis transférez l'autre moitié dans du PFA 4 % refroidi à froid pour l'immunohistochimie. Après 24 heures dans le fixateur à quatre degrés Celsius, transférez les tumeurs dans du PBS contenant du saccharose à 30 % et conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu'à ce qu'elles s'enfoncent complètement dans la solution. Ensuite, découpez les tumeurs en morceaux pouvant tenir dans des moules cryogéniques.Remplir les moules avec le composé OCT et y transférer les morceaux de tumeur. Le tissu doit être entièrement immergé dans l'OCT. Ensuite, transférer les moules cryogéniques sur de la glace sèche et, une fois complètement congelés, les conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu'à leur traitement.Pour préparer les cellules, transférez la moitié de la tumeur dans un filtre cellulaire. Coupez-la en trois ou quatre morceaux, puis retirez le piston d'une seringue de deux millilitres et utilisez-le pour écraser le tissu contre le filtre. Récupérez la solution qui passe à travers le filtre. Une fois les tissus broyés, rincez le filtre avec du PBS.Ensuite, transférez la suspension recueillie dans un nouveau tube et centrifugez-la à 500 G pendant cinq minutes. Nous suspendons le culot cellulaire dans 10 millilitres de PBS contenant 0,2 % de BSA. Puis comptez les cellules, aliquotez un à 5 millions de cellules de lymphome dans un tube FACS de cinq millilitres, centrifugez le tube à 500 G et jetez le surnageant.Ensuite, resuspendre les cellules dans 100 microlitres de PBS contenant 0,2 % de BSA. À ce stade, il est possible de bloquer les FcR en utilisant un anticorps dirigé contre le récepteur Fc gamma. Attendre 10 minutes, puis laver les cellules une fois avec du PBS contenant 0,2 % de BSA. Ajouter ensuite un anticorps monoclonal anti-CD45 pour identifier les leucocytes.Incuber les cellules pendant 20 minutes à l'obscurité avec cet anticorps, puis effectuer deux lavages pour l'éliminer juste avant l'analyse en cytométrie en flux. Colorer les cellules avec de l'iodure de propidium pendant 15 minutes sur de la glace afin d'identifier les cellules mortes. Ensuite, les laver soigneusement avec du PBS pur.Procédez ensuite en resuspendant les cellules dans 150 microlitres de PBS et continuez les opérations. Les souris ont reçu une injection de 50 microgrammes de nanocorps et d'anticorps monoclonaux afin d'évaluer la spécificité des conjugués marqués avec un fluorochrome. Pour l'imagerie in vivo.Toutes les imageries ont été réalisées six heures après l'injection du flux. L'analyse cytométrique de suspensions de cellules tumorales a montré un marquage spécifique des cellules tumorales positives pour l'antigène avec les deux conjugués AF six 80. Aucun marquage non spécifique des cellules négatives pour l'antigène n'a été observé avec l'un ou l'autre des constructs.La tumeur. Les sections cryogéniques ont montré une forte marquage quasi homogène des cellules positives pour l'antigène avec le nanocorps. Cependant, l'anticorps monoclonal a donné une coloration beaucoup plus faible et hétérogène, comme prévu pour l'antigène.Les tumeurs négatives n'ont montré aucune coloration par l'anticorps ; les tumeurs négatives pour l'antigène ont présenté une coloration dispersée non spécifique dans l'espace interstitiel après l'injection de l'anticorps classique. Cela était très similaire au motif de coloration observé dans les tumeurs antigéniques positives après injection de l'anticorps classique, une fois maîtrisé.La partie imagerie de cette technologie peut être réalisée en une seule journée en suivant cette procédure. D'autres méthodes, comme le marquage radioactif des nanocorps, peuvent être effectuées afin d'étudier la biodistribution des conjugués injectés dans différents tissus ou pour répondre à d'autres questions. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une validation ex vivo multimodale de votre expérience d'imagerie in vivo par fluorescence proche infrarouge à l'aide d'une sonde marquée au fluoro four.Offrant ainsi une technique d'évaluation de nouveaux constructions d'anticorps pour l'imagerie moléculaire préclinique.

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