Name: Nucléocapside recuit-Mediated électrophorèse (NOM) Assay permet lidentification rapide des VIH-1 inhibiteurs Nucleocapsid (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Découvrez un test d'électrophorèse pour identifier rapidement les inhibiteurs de la protéine nucléocapside du VIH-1. Cette méthode utilise des séquences d'ARN spécifiques et l'électrophorèse sur gel sans marquage radioactif.

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Ce travail a été soutenu par Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unità per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant : PGR Italy-USA) et par MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant : 2010W2KM5L_006).

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

NAME est un test qui permet d&#39;évaluer rapidement l&#39;inhibition de l&#39;activité de chaperon de la protéine de nucléocapside du VIH-1, une cible intéressante pour la recherche de nouveaux médicaments anti-VIH. NC annèle rapide et à des acides nucléiques de température ambiante dont pliage stable exigerait autrement dénaturation thermique à haute température suivi d&#39;un recuit prudent. Le dosage peut être effectué soit avec pleine longueur NC ou avec le tronquée (12-55) NC: dans les deux cas, les deux acides nucléiques (ARN et sa copie d&#39;ADN complémentaire) sont recuits rapidement. Ceci est cohérent avec l&#39;observation de la littérature avec le tronc NC peptide: recuit est initiée par la fusion efficace de la tige de cTAR suivie par interaction de la boucle apicale complémentaire, qui est un faible site de liaison de NF, avec la séquence complémentaire de TAR boucle apicale, de se retrouver à travers plusieurs intermédiaires instables à l&#39;hybride recuit étendu. 21 NC est une prot très stableein et quelques problèmes lors de NOM performant peuvent se produire. Il est très important cependant pour ajouter SDS fraîchement préparés dans le Gel Loading Buffer utilisé pour arrêter la réaction: si cela ne est pas atteint, le gel ne sera pas montrer les bandes d&#39;acides nucléiques dans les positions correctes. En fait, NC est une protéine de liaison d&#39;acide nucléique, de sorte que de visualiser correctement TAR / cTAR heteroduplex par électrophorèse sur gel de SDS doit être présent dans le tampon de chargement de gel pour dénaturer la protéine et le libérer de son complexe étanche avec les acides nucléiques. Ce est aussi un possible dépannage de l&#39;expérience, ce est à dire la formation de bandes décalées pendant la course au gel. Cet effet est particulièrement évident lorsque la pleine longueur NC a été utilisé, comme dans la figure 2, et est liée à la présence de la queue N-terminale fortement basique, ayant un effet d&#39;agrégation solide sur les acides nucléiques. La présence de la queue de base terminal effectue la réaction de recuit plus difficile d&#39;être inhibé, comme le montrentn à la figure 3 en utilisant le composé 1, un filetage intercalant représentant, soit une intercalant particulièrement efficace à stabiliser les structures tige-boucle de goudron et de cTAR. En fait, ce type d&#39;interaction avec des acides nucléiques est favorisée lorsque des renflements et des boucles interrompent la continuité de la double hélice, ce qui permet un enfilage plus facile de les substituants volumineux dans les paires de bases. Stabilisation de TAR et cTAR par ces liants d&#39;acides nucléiques a été préalablement analysé par la détermination de l&#39;augmentation de la température de fusion des deux oligonucleotides. 14 En outre, l&#39;augmentation de la température de fusion est en corrélation avec l&#39;inhibition de l&#39;hybridation catalysée par le VIH-1 NC, conduisant à la formation réduite de la TAR hétéroduplex / cTAR et indiquant que intercalants filetage constituent une classe intéressante de liants pour des structures dynamiques de l&#39;ARN tel que l&#39;élément TAR. 14 Le mécanisme d&#39;action invoquée pour ces compounds peut encore être validé en effectuant le test in NOM différents formats de rechange, comme représenté sur la figure 4: dans le cas des agents intercalants de l&#39;inhibition de recuit heteroduplex est améliorée lorsque le médicament est incubé avec les deux oligos pliées. Composés agissant avec mécanisme d&#39;action différent, comme liants directs de la protéine NC, seraient moins touchés par les différents mode de pré-incubation. NOM test effectué dans les deux méthodes peuvent donc être utilisés pour cribler des bibliothèques de composés pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs NC, et aussi pour évaluer le mécanisme d&#39;action présumé des réponses positives lors de la recherche pour les médicaments anti-VIH ciblées au NC. De toute évidence, l&#39;utilisation de ces seules techniques lors réclamé un mécanisme spécifique d&#39;action des inhibiteurs identifiés NC ne est pas suffisant, et d&#39;autres tests biochimiques appropriés sont nécessaires pour soutenir l&#39;hypothèse de travail. 14 Enfin, il faut souligner que NOM utilise trèsenzymes purifiées, soit recombinaison ou de synthèse, ce qui donne des informations précieuses sur l&#39;inhibition &quot;in vitro&quot; de NC par les composés testés. Ce est la &quot;force et la faiblesse&quot; de l&#39;essai: NOM peut ainsi compléter criblage virtuel et modélisation moléculaire approches dans les étapes préliminaires de programmes de découverte de médicaments, permettant de construire et d&#39;analyser rapidement les relations structure-activité et éventuellement réorienter la conception de synthèse et de drogues. Cependant, comme d&#39;autres dosages biochimiques utilisés dans des projets de développement de médicaments dans le VIH, NOM ne donnera pas d&#39;informations sur les effets des inhibiteurs putatifs dans les cellules infectées par le virus.

La protéine de nucléocapside NCp7 (NC) de l&#39;immunodéficience humaine virus de type 1 (VIH-1) est une petite protéine basique qui est étroitement associé à l&#39;ARN génomique du virus infectieux mature, jouant un rôle essentiel dans la réplication du virus en tant que cofacteur pendant la transcription inverse , la reconnaissance du génome, et l&#39;emballage. 1-3 NC agit comme un chaperon d&#39;acide nucléique catalyser la déstabilisation des structures stables d&#39;acide nucléique et l&#39;hybridation de séquences complémentaires. Son activité acide nucléique agrégation réside principalement dans les 11 acides aminés N-terminal alors que l&#39;activité déstabiliser duplex a été cartographiée à ses structures de doigt de zinc (12 à 55 peptidiques). 4 La protéine chargée positivement abaisse la barrière électrostatique de la réaction d&#39;hybridation et augmente la vitesse à laquelle les deux séquences complémentaires distincts se rejoignent. Les acides nucléiques pliées de conformation stable exigent les activités chaperonnes de NC à facilitate leur recuit 5 Cela est particulièrement important dans la transcription inverse, où NC est critique dans des événements de transfert de brins:. dans le transfert brin moins, l&#39;ADN d&#39;arrêt brin moins, tout rétrotranscrit, doit être transférée et hybridée à une séquence complémentaire de la région R à l&#39;extrémité 3 &#39;du génome de l&#39;ARN matrice. 6 Bien que thermodynamiquement favorisée, cette réaction ne se produit pas largement en l&#39;absence de NC en raison de la présence de la structure stable de l&#39;activation trans région sensible (TAR) ARN dans les régions de recherche, qui doit être associé à sa copie d&#39;ADN (cTAR ADN). Les sept régions cTAR et TAR sont, en fait, très structuré avec une tige-boucle conformation caractéristique. NC protéine se dénature ces épingles à cheveux, et favorise le transfert de brin négatif en augmentant le taux de recuit intermoléculaire entre les brins d&#39;acide nucléique complémentaires. Le mécanisme de NC recuit de goudron et cTAR a été soigneusement étudié et dedécrite comme test TAR de recuit dans plusieurs documents de recherche et le schéma proposé est représenté dans d&#39;excellentes critiques. 8-11 Résumer, NC déstabilise la structure secondaire de l&#39;ARN stable comme TAR-ARN, déstabilise la structure secondaire de sa séquence complémentaire, cTAR-DNA et favorise la réaction d&#39;annelage de l&#39;ARN / ADN conduisant à TAR / cTAR formation d&#39;hétéroduplex. 10,11 Par conséquent, l&#39;étape de transfert de brin pendant la replication du VIH est favorisée. 12 NC est une cible intéressante pour le développement de nouveaux agents antiviraux puisque les risques d&#39;interférence induite par de petites molécules en vue NC entraînerait une diminution de la transcription inverse du génome viral à la suite d&#39;une activité NC compromise. 2,13 Cette approche pourrait finalement conduire au développement d&#39;agents anti-VIH réussies. Dans le cadre d&#39;un dépistage de la NC inhibiteurs 14 nous avons développé un test en se appuyant sur ​​les propriétés bien connuesde nucléocapside de déstabiliser efficacement et recuit oligonucléotides complémentaires 10,11. Nous l&#39;avons appelé N ucleocapsid Un nnealing- M ediated E lectrophoresis (NOM) dosage. NOM essai utilise NC pour arbitrer le recuit entre les copies de manière stable structurés d&#39;acides nucléiques complémentaires, dans notre cas de l&#39;oligonucléotide correspondant à la partie apicale d&#39;une séquence TAR-ARN avec sa séquence d&#39;ADN complémentaire (cTAR) pour donner le hybride TAR / cTAR heteroduplex . L&#39;analyse de la TAR / cTAR réaction de recuit en présence de NC peut être étudiée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (PAGE). Ce protocole montre comment effectuer le dosage NOM à recuire rapidement à des oligonucleotides à la température ambiante dans des structures pliées en épingle à cheveux stable, la manière d&#39;analyser les résultats de la réaction et éventuellement de dépannage de l&#39;expérience. Le marquage radioactif de l&#39;acide nucléique ne est pas demandée, et detectisur des bandes d&#39;oligonucléotides peut être réalisée par des procédés classiques de coloration. L&#39;essai, qui emploie soit la protéine pleine longueur recombinant ou une version synthétique tronqué de NC, permet l&#39;identification des agents intercalants d&#39;enfilage NC inhibant une activité corrélée à une forte liaison à l&#39;ARN et de l&#39;ADN 14.

<table><tbody><tr><td>cTAR, oligo-ADN 29-mer. Dessalé. HPLC purifié.</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>Stockez la solution stock à -20 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>TAR, ARN oligo-mère 29. Dessalé. HPLC purifié.&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>Stocker l’aliquote de stock à -80 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>(12-55)NC peptide</td><td>EspiKem srl</td><td></td><td>Stocker la solution mère à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Tubes de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120 086</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Tubes de 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121 023</td><td>Autoclave avant utilisation</td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tips 0.1-10 &micro ; l</td><td>Sarstedt</td><td>701,130,210</td><td></td></tr><tr><td>Embouts filtrants pour la biosphère 2-20 & micro ; l</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>Infos filtres pour la biosphère 200&nbsp ; et micro ; l</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue 0,22&nbsp ; et micro ; m</td><td>Biosigma srl</td><td>51,798</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414631</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71725-50G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfoxyde de diméthyle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-1L</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>Perchlorate</td><td>de magnésium Sigma-Aldrich</td><td>222283-100G</td><td>Stocker le 1&nbsp ; M à -20&nbsp ; &deg ; C</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49770-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>GE Soins de santé Sciences de la vie</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime ;,N&prime ; -Tétraméthyléthylènediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7460-500G</td><td>Préparez la solution à 10 % fraîchement avant utilisation</td></tr><tr><td>Acrylamide-bis solution prête à l’emploi 40 % (19:1)</td><td>Merck Millipore</td><td>1006401000</td><td>Le polyacrylamide est hautement neurotoxique : porter des gants pendant la coulée</td></tr><tr><td>de gel Tris ultrapur</td><td>Applichem</td><td>A1086, 1000</td><td></td></tr><tr><td>Eau traitée DEPC</td><td>Ambion</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>22,621,408</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre NanoDrop 1000</td><td>Spectromètre Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Lambda 20</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-1803</td><td></td></tr><tr><td>Alimentation de base PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>SybrGreen II Coloration au gel d’ARN</td><td>Lonza</td><td>50523</td><td>Effectuez la dilution 1/10 000 dans TBE 1x. Rangez-le dans l’obscurité à 4 &deg ; C pendant deux semaines.</td></tr><tr><td>Système d’imagerie Geliance 600</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nucléocapside recuit-mediated électrophorèse (nom) assay permet l&#39;identification rapide des vih-1 inhibiteurs nucleocapsid

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

ARN ou ADN plié en pliage tridimensionnel stable sont des cibles intéressantes dans le développement de médicaments antiviraux ou anti-tumorale. Dans le cas du VIH-1, les protéines virales impliquées dans la régulation de l&#39;activité du virus reconnaissent plusieurs acides nucléiques. La protéine de nucléocapside NCp7 (NC) est une protéine de régulation clé plusieurs procédés au cours de la réplication du virus. NC est en fait un chaperon déstabilisant les structures secondaires de l&#39;ARN et de l&#39;ADN et facilitant leur recuit. L&#39;inactivation du NC est une nouvelle approche et une cible intéressante pour la thérapie anti-VIH. Le N ucleocapsid Un nnealing- M ediated E lectrophoresis (NOM) test a été développé pour identifier des molécules capables d&#39;inhiber la fusion et le recuit de l&#39;ARN et de l&#39;ADN plié en conformations tridimensionnelles thermodynamiquement stables, comme les structures en épingle à cheveux de goudron et éléments cTAR du VIH, par la protéine de nucléocapside du VIH-1. Le nouveau test emploie soit la rérecombinant ou la synthèse des protéines, des oligonucléotides et sans la nécessité de leur marquage précédente. L&#39;analyse des résultats est réalisée par électrophorèse sur gel de Polyacrylamide standard (PAGE) suivie d&#39;une coloration d&#39;acide nucléique conventionnel. Le protocole rapporté dans cet ouvrage explique comment effectuer le NOM test avec la protéine pleine longueur ou sa version tronquée dépourvue du domaine N-terminal de base, à la fois compétente comme les acides nucléiques chaperons, et comment évaluer l&#39;inhibition de l&#39;activité de chaperon NC par un filetage intercalant. En outre, le nom peut être effectué dans deux modes différents, utile pour obtenir des indications sur le mécanisme d&#39;action présumé des inhibiteurs NC identifiés.

La figure 1 montre un résultat représentatif de l&#39;essai Nucleocapsid recuit Mediated électrophorèse (NOM), effectué i) avec la protéine recombinante pleine longueur, ii) sans la protéine, ce est à dire le mélange cTAR + TAR et l&#39;incubation jusqu&#39;à 1 heure à température ambiante, et iii ) le même essai réalisé avec (12-55) NC, un peptide synthétique ne ayant pas les 11 acides aminés du domaine N-terminal. Le TRE pré-pliée et cTAR ont été mélangés et la formation d&#39;heteroduplex recuit du TRE / cTAR a été contrôlée en présence de la pleine longueur recombinant NC (voies gauche de la figure 1), en l&#39;absence de protéine (pistes au centre de la figure 1 ), et en présence des (12-55) NC (peptides tronqués voies de droite sur la figure 1). Les contrôles sont: croisés cTAR, TAR pliées et recuites hybride (TAR / cTAR), obtenu par dénaturation thermique des structures de manière stable pliées de TAR à cTAR suivie par leur annealin lenteg. 14 La capacité de NC pour dénaturer deux séquences d&#39;acide nucléique stables dans l&#39;hélice heteroduplex étendue est clairement évidente: la pleine longueur de protéine NC conduit immédiatement à la formation de la TAR / cTAR hybride: 0 »indique le temps minimal passant entre l&#39;addition de NC pour les échantillons et addition de tampon de chargement de gel, ce qui stoppe la réaction; formation complète est déjà atteint après 15 &#39;temps d&#39;incubation. L&#39;augmentation de l&#39;intensité de l&#39;hétéroduplex recuit est parallèle à la diminution de l&#39;intensité des oligonucléotides cTAR TAR et pliées. La formation d&#39;heteroduplex est obtenu également en présence de la forme tronquée, ce est à dire le (12-55) NC, confirmant l&#39;activité biologique du peptide synthétique. En l&#39;absence de la protéine ou du peptide de la formation d&#39;heteroduplex est pas respecté, et le goudron et les oligonucleotides cTAR ne se anneler à la température ambiante dans l&#39;hétéroduplex (figure 1). Entoutes les expériences, la formation rapide des intermédiaires instables (les «complexes intermédiaires» à la figure 1) qui diminuent au fil du temps est observée, en conformité avec le mécanisme proposé d&#39;échange de brin à travers les épingles de cTAR et TAR jusqu&#39;à ce que les acides nucléiques repliement correct. 17 Un dépannage possible de l&#39;expérience est le manque de SDS dans le tampon de chargement de gel. En l&#39;absence de SDS dans le GLB le résultat de la réaction est représenté sur la figure 2 et par rapport à l&#39;issue de GLB + SDS. Le TAR pré-plié et cTAR étaient mélangés et incubés pendant 3 heures à température ambiante d&#39;pendant 3 heures à 37 ° C avec le pleine longueur protéine NC recombinant. Après incubation, les échantillons ont été divisés en deux: d&#39;une moitié du tampon de charge de gel sans SDS (GLB) a été ajoutée, tandis que l&#39;autre moitié était GLB avec SDS (SDS GLB). Les échantillons ont été chargés sur le gel, et la position des bandes d&#39;acides nucléiques a été visualisée après que le gel de fonctionner parcolorant coloration. Lorsque NC était présent mais les échantillons ont été chargé avec GLB, toutes les bandes des acides nucléiques ont été décalées vers le haut: ce est prévu et indique une forte liaison entre la protéine et les acides nucléiques. Les résultats avec GLB SDS sont présentés dans l&#39;extrême droite du gel: l&#39;addition de SDS dénature les protéines et libère les acides nucléiques du complexe stable avec la protéine, ce qui permet la comparaison avec les contrôles. Le dosage de nom est utilisé pour évaluer la capacité de filetage intercalateurs pour stabiliser des structures dynamiques d&#39;acide nucléique et d&#39;inhiber NC activité chaperon. 14 intercalateurs Threading sont des molécules aromatiques planaires substitués par des chaînes latérales volumineuses situées sur les sites opposés du système de cycle, comme l&#39;anthraquinone représentés sur la figure 3A. 18 Ces agents intercalants sont en mesure de fil à travers la double hélice des acides nucléiques, localiser finalement leurs chaînes latérales dans chaque sillon de la doublehélice. 19,20 La figure 3B montre les résultats de l&#39;essai NOM en présence du composé 1, un agent intercalant de filetage connu, 18 en présence de pleine longueur NC ou du peptide tronqué. Dans les deux cas, la formation de l&#39;hybride TAR / cTAR par NC est réduite en augmentant la concentration de l&#39;agent intercalant, tandis que, en même temps, la quantité de goudron libre et augmente cTAR. La forme tronquée de la protéine dépourvue de la queue N-terminale (12-55NC) est plus sensible à l&#39;inhibition de son activité: cette différence a été vérifiée avec les composés testés à ce jour. Le dosage de nom peut être réalisé de deux manières, soit par pré-incubation du composé d&#39;essai avec NC, puis on ajoute les oligonucleotides pliées (mode NC-préincubation), ou en pré-incubant le composé d&#39;essai pendant 15 min avec les substrats d&#39;acides nucléiques pliées , suivi par l&#39;addition de NC et une nouvelle incubation pendant 15 min (oligo-prmode eincubation). Bien que le temps total d&#39;incubation est le même dans les deux modes, la préincubation avec les oligonucléotides pliées avant l&#39;addition du NC permet plus de temps pour l&#39;enfilage des intercalants dans l&#39;acide nucléique repliée. Il en résulte une stabilisation plus forte de leurs structures dynamiques et plus facile en une inhibition des activités chaperonnes CN. L&#39;analyse de l&#39;essai de NOM dans les deux modes améliore donc les différences dans le mécanisme d&#39;action des inhibiteurs de NF, comme représenté sur la figure 4: lorsque le composé 1 a été analysée par leur nom dans le mode d&#39;oligo-préincubation (figure 4, voies à gauche) il montre une inhibition puissante de recuit NC-médiée, alors que l&#39;inhibition observée est beaucoup plus faible dans le mode NC-préincubation (figure 4, voies à droite). Se il vous plaît noter que pour la détermination des concentrations inhibitrices Pendant le filtrage séries de composés apparentés avec ce dosage et dans ces conditions, chacun EXPERIment doit être effectuée au moins en triple, avec des concentrations très rapprochées (en particulier autour de la valeur IC 50). 14 <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig1highres.jpg" /> Figure 1:. NOM dosage avec pleine longueur et avec le NC (12-55) NC TAR Plié et cTAR, chaque 1 uM tronqué, ont été incubées avec recombinant NC ou avec (12-55) NC (oligos / NC = 1 / 8) de 0 min, 15 min, 30 min et 1 h. TAR cTAR et incubées en l&#39;absence de protéine (0 min, 15 min, 30 min et 1 h) ont été utilisés comme témoin négatif. TAR plié, plié cTAR hybride et le TRE / cTAR obtenus après dénaturation thermique suivie d&#39;un recuit in vitro ont été utilisés comme témoins. Les réactions ont ensuite cessé d&#39;utiliser GLB SDS. Les échantillons ont été séparés sur un gel de Polyacrylamide à 12% dans 1 x TBE; Après électrophorèse des acides nucléiques sur le gel ont été colorées et détecté sur un transilluminateur. <html><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig2highres.jpg" /> Figure 2:. Effet de SDS dans le tampon de chargement de gel (GLB) lors de l&#39;analyse TAR / cTAR recuit par NC TAR et cTAR, préplié dans TNMg 1x, ont été incubées avec pleine longueur recombinantes NC (oligos / NC = 1/8) pour 3 h à la température ambiante ou à 37 ° C. GLB GLB ou SDS ont ensuite été ajoutés aux échantillons incubés avec NC. Contrôles: TAR, cTAR et TAR hybride recuit / cTAR (chacun 1 uM). L&#39;électrophorèse a été effectuée en utilisant un gel de Polyacrylamide à 12% dans du TBE 1x; Après électrophorèse des acides nucléiques sur le gel ont été colorées et détecté sur un transilluminateur. Ce chiffre a été modifié depuis Figure S4:. Sosic, A. et al Conception, synthèse et l&#39;évaluation biologique de goudron et de liants cTAR que le VIH-1 inhibiteurs de la nucléocapside MedChemComm 4, 1388-1393, doi:. 10.1039 / c3md00212h (2013) . &quot;&gt; <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig3highres.jpg" /> Figure 3: (A) la structure chimique du filetage intercalant 1. (B) Effet de filetage intercalant une évalués par NOM dosage. Plié TAR et cTAR, chaque 1 uM, ont été incubées en présence de concentrations indiquées du composé avec une pleine longueur NC ou avec le (12-55) NC, chaque 8 uM. TAR plié, plié cTAR et de la TAR hétéroduplex étendue / cTAR ont été utilisés comme témoins. Les réactions ont ensuite cessé d&#39;utiliser GLB SDS. Les échantillons ont été séparés sur un gel de Polyacrylamide à 12% dans 1 x TBE; Après électrophorèse des acides nucléiques sur le gel ont été colorées et détecté sur un transilluminateur. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52474/52474fig4highres.jpg" /> Figure 4: Oligo-préincubation par rapport modes NC-préincubation: effets sur NOM dosage Oligo-préincubation mod.e: TAR pliée et repliée cTAR, chaque 1 uM, ont été pré-incubées avec les concentrations indiquées du filetage intercalant une pendant 15 minutes, puis pendant encore 15 min en présence de la pleine longueur NC (8 uM) NC-de préincubation. Mode: les concentrations indiquées du filetage intercalant 1 ont été pré-incubé avec la pleine longueur NC (8 uM) pendant 15 min, puis pendant encore 15 min en présence de TAR plié et replié cTAR, chaque 1 uM. TAR plié, plié cTAR et de la TAR hétéroduplex étendue / cTAR ont été utilisés comme témoins. Toutes les réactions ont finalement cessé d&#39;utiliser GLB SDS. Les échantillons ont été séparés sur un gel de Polyacrylamide à 12% dans 1 x TBE; Après électrophorèse des acides nucléiques sur le gel ont été colorées et détecté sur un transilluminateur.

Ce protocole décrit NAME, un test qui permet d’identifier rapidement des molécules capables d’inhiber in vitro les activités chaperonnes de la protéine nucléocapside du VIH-1.

Nucléocapside recuit-Mediated électrophorèse (NOM) Assay permet l&#39;identification rapide des VIH-1 inhibiteurs Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

L'objectif général de l'expérience est l'identification rapide de molécules capables d'inhiber les activités chaperonnes de la protéine du nucléocapside du VIH-1. In vitro, NC est une petite protéine fortement basique dont la structure est caractérisée par un domaine terminal flexible et par deux doigts de zinc hautement conservés, qui interagissent avec les acides nucléiques viraux. NC interagit avec l'épinglette en ARN tar et sa séquence complémentaire en ADN CT A r, et favorise la fusion de leurs structures secondaires afin de les rendre disponibles pour la formation de l'hybride tar-CTAr.Le protocole est réalisé en utilisant la partie apicale des séquences de tar et de sitar lorsqu'elles sont mélangées ensemble et incubées avec la nc. L'hybride se forme par enfilage, les circulateurs interagissant avec des oligonucléotides qui inhibent la formation de l'hybride catalysée par la NC. Le résultat de la réaction est analysé par électrophorèse standard sur gel de polyacrylamide ; TAR et CA présentent une mobilité différente sur gel par rapport à l'hybride.Des concentrations croissantes d'intercalation dans l'intercollateur entraînent une diminution de l'hybride en parallèle avec l'apparition de tar libre et de CT A. Le principal avantage de cette technique par rapport aux protocoles existants, tels que l'analyse de migration sur gel ou le tarage, est qu'elle ne nécessite aucune manipulation préalable des acides nucléiques, comme le marquage radioactif. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la découverte de médicaments, telles que les inhibiteurs du VIH-1 et du C. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés avec l'organisation globale du protocole, en particulier concernant la dilution en série de chaque stock, la durée exacte d'incubation et la procédure correcte pour arrêter la réaction.Pour commencer cette procédure, préparez 10 microlitres d'une solution mère de tar à une micromolaire et 10 microlitres d'une solution mère de CT A à une micromolaire dans du tampon TNMG 1 X. Chauffez les tubes à environ 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis laissez-les refroidir à température ambiante afin que TAR et CT A forment leurs structures en boucle avec renflement et tige. Pour préparer une solution micromolaire d'hybride tar-CT A servant de témoin, mélangez un microlitre de tar à 10 micromolaire avec un microlitre de CT A à 10 micromolaire dans du tampon TNMG 1 X.Remplir le tube avec de l’eau DEPC jusqu’à un volume total de 10 microlitres. Ensuite, dénaturer les oligonucléotides en chauffant le tube à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Laisser refroidir lentement jusqu’à la température ambiante afin que le tar s’hybride à sa séquence complémentaire, CT A, et forme l’hybride double brin tar CT A. Une fois toutes les solutions refroidies à la température ambiante, effectuer une courte centrifugation, puis ajouter trois microlitres de GLB avec SDS à chaque solution et mélanger trois fois à l’intérieur du tube.Placer les échantillons sur de la glace jusqu'à l'étape de chargement. Dans cette procédure, préparer 10 microlitres de dilutions de 500 micromolaire, 250 micromolaire, 50 micromolaire et 5 micromolaire du composé un dans de l'eau milli Q. Préparer ensuite 27,5 microlitres de 4 micromolaire de goudron et 27,5 microlitres de 4 micromolaire de CTA dans du tampon TNMG un X.Chauffer les deux tubes à environ 95 degrés Celsius pendant cinq minutes afin de replier les structures, puis utiliser 2,5 microlitres de ces solutions d'oligonucléotides repliés pour les étapes suivantes. Ensuite, diluer la solution mère de la protéine NC et du peptide NC 12 à 55 dans de l'eau jusqu'à une concentration de 80 micromolaire. Lorsque les solutions TAR et CAR ont refroidi à température ambiante, effectuer une courte centrifugation des deux tubes, puis préparer 20 tubes vides stérilisés et disposer deux rangées de 10 tubes chacune dans le support pour les échantillons de laboratoire.Ensuite, ajoutez 2,5 microlitres de l'ARNt replié dans chaque tube de la première rangée. Ajoutez ensuite 2,5 microlitres de l'ARNt CT A replié dans chaque tube. Dans la deuxième rangée, ajoutez deux microlitres du composé approprié, une dilution à l'ARNt et à CT A r.Remplacer le composé par de l'eau dans les échantillons destinés à l'analyse du peptide NC et NC 12 à 55 dans les témoins. Incuber les échantillons pendant 15 minutes à température ambiante. Après 15 minutes, mélanger les échantillons CT A R avec les échantillons tar correspondants.Ajouter un microlitre de NC à 80 micromolaire aux échantillons destinés à l'analyse de la NC, ou un microlitre de peptide NC 12 à 55 à 80 micromolaire aux échantillons destinés à l'analyse du peptide NC 12 à 55. Après une nouvelle incubation de 15 minutes à température ambiante, arrêter la réaction en ajoutant trois microlitres de GLB avec SDS à chaque échantillon. Pippetter une fois le mélange de chaque tube trois fois, puis placer sur de la glace.Répétez cette étape en utilisant les échantillons pour l'analyse des peptides NC et NC 12 à 55, et conservez les échantillons sur de la glace jusqu'à l'étape de chargement. Retirez maintenant le couvercle de l'appareil à gel. Chargez 13 microlitres de chaque échantillon dans les puits.Remplacez le couvercle de l'appareil à gel avant de l'allumer. Faites migrer le gel pendant deux heures et 30 minutes à 200 volts constants, jusqu'à ce que le colorant ait migré à 1,5 centimètre au-dessus du bas du gel. Ensuite, placez le gel dans un récipient approprié contenant une solution de coloration des acides nucléiques choisie, pendant 30 à 45 minutes avec agitation.Placez le gel sur un système d'imagerie transilluminateur pour détecter les acides nucléiques par le signal fluorescent. Le nom de test est utilisé pour évaluer la capacité des intercalateurs à fil et des intercollateurs à stabiliser les structures dynamiques des acides nucléiques et à inhiber l'activité de chaperon de la nucléocapside (NC). Les intercalateurs à fil sont des molécules aromatiques planes substituées par de longues chaînes latérales situées sur les côtés opposés du système cyclique, comme l'anthraquinone illustrée ici.Cette figure montre le résultat du test nommé en présence du composé un, un intercalateur filant connu, en présence de NC pleine longueur ou du peptide tronqué. Dans les deux cas, la formation du tar ct, un hybride par NC, est réduite par l'augmentation de la concentration de l'intercalateur. En même temps, la quantité de tar libre et de CT A R augmente.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir d'utiliser du tampon de charge JA contenant du SDS. Cette étape est cruciale pour la réussite optimale de name. En effet, si cette étape n'est pas suivie, il n'est pas possible de distinguer les bandes d'acides nucléiques dans le système de gel.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une AEM avec des oligonucléotides à température ambiante pliés en structures secondaires stables, ainsi que de l'analyse des résultats de la réaction, en utilisant soit la protéine NC recombinante complète, soit un peptide NC synthétique tronqué, afin d'identifier les intercalateurs inhibiteurs de la NC. N'oubliez pas que le travail avec les intercalants et l'acrylamide peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d'une blouse de laboratoire, de gants et de lunettes de protection doivent toujours être prises lors de l'exécution de ce protocole.

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