Ciblé méthylation de l'ADN Analyse par séquençage de nouvelle génération

L’objectif global de cette procédure est de quantifier la méthylation des CPG dans des régions d’intérêt ciblées à partir de l’ADN génomique, isolé à partir de tissus ou de cellules d’intérêt. Ceci est accompli en concevant d’abord des amorces PCR spécifiques au sulfite pour amplifier les régions d’intérêt à partir de l’ADN génomique converti au bi-sulfite. Dans la deuxième étape, la région d’intérêt convertie en bisulfite est amplifiée, et des banques de séquençage ou NGS de nouvelle génération sont générées à partir des amplicons cons.

Ensuite, les bibliothèques sont séquencées et les fichiers FASTQ sont générés pour l’analyse. Dans la dernière étape, les lectures de séquençage sont alignées sur la séquence cible de référence convertie au bisulfite, et les cinq pour cent mc sont calculés en fin de compte par séquençage d’amplicon de sulfite ou BS a s peut être effectué pour quantifier avec précision et exactitude la méthylation CPG dans n’importe quelle région d’intérêt à partir de n’importe quel organisme modèle. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le séquençage de Sanger est que BS A S fournit une quantification précise et précise de la méthylation CPG de manière rapide et à haut débit, offrant la possibilité d’analyser plusieurs régions dans un grand nombre d’échantillons.

Après avoir identifié la cible et conçu l’amorce, assemblez la réaction pour l’optimisation de l’amplification de la cible d’un seul amplicon, puis scellez une plaque PCR avec un film thermosoudé pour visualiser les amplicons par électrophorèse de page. Ensuite, chargez les puits appropriés avec 30 microlitres de réactions PCR ou d’échelle, puis faites fonctionner le gel à 200 volts pendant environ 45 minutes. Lorsque le premier colorant atteint la fin du gel, arrêtez la réaction, puis recouvrez tout le gel de cinq microgrammes par millilitre de bromure AUM fraîchement préparé.

Après cinq minutes, imagez le gel via un transluminateur UV à une longueur d’onde d’excitation de 482 nanomètres. Utilisez l’échelle pour dimensionner les AMPLICONS PCR afin de déterminer la spécificité de la réaction. Recherchez plusieurs bandes autres que la taille d’amplicon attendue pour déterminer la taille moyenne des pics de bibliothèque détectés et une estimation de la molarité.

Ensuite, exécutez les banques sur une puce de taille d’ADN par électrophorèse capillaire avec un test d’ADN à haute sensibilité selon les instructions du fabricant. Quantifier les bibliothèques par QPCR. Utilisez des amorces conçues contre les séquences d’adaptateur dans les bibliothèques et les étalons générés avec une concentration connue sur un instrument en temps réel, en utilisant les paramètres de quantification absolus selon les instructions du fabricant.

Utilisez ensuite la taille des banques et la quantification molaire de la QPCR pour calculer les concentrations molaires des bibliothèques. Après le séquencement, importez les fichiers Q rapides compressés dans le pipeline d’analyse de séquençage approprié, sélectionnez importer, puis sélectionnez la méthode de séquençage utilisée pour générer les lectures afin de conserver les scores Q pour les applications de découpage de lecture. Importez les fichiers Q Fast Reads compressés appropriés, puis sous Options générales, désélectionnez Ignorer les scores de qualité.

Sélectionnez un emplacement pour les lectures importées et cliquez sur Terminer. Ensuite, sous les outils de base NGS, sélectionnez les séquences de découpage. Mettez en surbrillance les lectures à tronquer, en ne conservant que les lectures contenant des scores supérieurs ou égaux à Q 30.

Sélectionnez ensuite la garniture à l’aide des scores de qualité et fixez la limite à 0,001. Pour ne sélectionner que les anches contenant moins ou moins d’un nucléotide ambigu. Sélectionnez Supprimer les nucléotides ambigus et définir le nombre maximal d’ambiguïtés sur un.

Sélectionnez ensuite un emplacement pour enregistrer les lectures tronquées et cliquez sur terminer pour mapper les résolutions coupées à la référence de gène convertie in silico par sulfite. Sous Outils de base NGS, sélectionnez Lectures de carte. Pour référencer, sélectionnez les lectures tronquées à mapper et cliquez sur Suivant.

Ensuite, sous Masquage de référence, sélectionnez la séquence de référence convertie et sélectionnez Aucun masquage. Cliquez sur Suivant, puis attribuez un score de trois pour les incompatibilités, les insertions et les suppressions. Attribuez un score de un pour la fraction minimale de la carte de longueur de lecture à la référence et attribuez un score de 0,9 pour la fraction minimale d’identité entre la carte, la lecture et la référence dans le cadre de la gestion des correspondances non spécifiques, sélectionnez, ignorez et cliquez sur Suivant sous les options de sortie.

Ensuite, sélectionnez Créer des mappages de lecture autonomes. Ensuite, sous Gestion des résultats, cliquez sur Enregistrer. Sélectionnez un emplacement pour enregistrer le mappage de lecture et cliquez sur Terminer pour exécuter la variante appelant les lectures mappées.

Sous Analyse de reséquençage, sélectionnez la détection de variante basse fréquence et choisissez le mappage de lecture à analyser. Cliquez sur Suivant, puis sous le paramètre de variante basse fréquence, entrez 0,01 % et cliquez sur Suivant. Sous les filtres généraux, réglez la couverture minimale sur 1000 pour vous assurer que la séquence est à une profondeur supérieure ou égale à 1000 x.

Enfin, cliquez sur Suivant, puis sous Options de sortie, sélectionnez créer une table annotée et sélectionnez un emplacement pour enregistrer le fichier de table de variantes, cliquez sur terminer et utilisez les fréquences de variantes sur les sites CPG annotés dans la région d’intérêt du fichier de table de variantes pour calculer la fréquence de méthylation de la cytosine sur une cytosine de référence dans un contexte CG par séquençage d’amplicon de sulfite Les lectures correctement alignées sur la séquence de référence convertie ressembleront à celles illustrées dans la figure. Les dinucléotides CPG peuvent être clairement identifiés et les états de méthylation peuvent être estimés en observant les appels de base sur les sites CPG. Dans les lectures cartographiées, la méthylation de 0 % entraînera des lectures cartographiées contenant de la thymine cartographiées sur les sites CPG.

contrôles de méthylation à 100 % permettront d’obtenir des lectures cartographiées contenant des cytosines cartographiées sur les sites CPG. Dans cette expérience, l’ARN et l’ADN ont été co-isolés d’une souris, d’un cervelet et de la rétine. L’expression sélective de l’opsine exprimée dans le tissu rétinien a ensuite été mesurée à l’aide de la QPCR comme prévu.

L’ARN de l’opsine n’a été détecté que dans la rétine après quantification des niveaux de méthylation de la CPG dans la région promotrice de l’opsine par séquençage par amplification du bi-sulfite. Cependant, les niveaux cumulés de méthylation dans la région promotrice étaient supérieurs à 80 % dans le cervelet contre moins de 15 % dans la rétine. La quantification de la méthylation B SAS bénéficie de la quantification de la méthylation spécifique au site, permettant de comparer les niveaux de méthylation sur une base spécifique CPG dans une région génomique donnée.

En effet, dans cette expérience, les niveaux de méthylation de la CPG à travers le promoteur de l’opsine se sont avérés être significativement plus élevés dans les échantillons cérébelleux par rapport aux échantillons de rétine. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier la méthylation des CPG dans des régions d’intérêt ciblées à partir de l’ADN génomique, isolé à partir de tissus ou de cellules.