Name: Super-résolution de limagerie cellulaire Synapse immunologique Natural Killer sur un verre soutenu par Planar lipidique en deux couches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Découvrez l'imagerie super-résolution des synapses immunologiques des cellules NK par microscopie STED sur bicouche lipidique planaire supportée par verre. Cette méthode permet de visualiser l'ultrastructure du cytosquelette d'actine et des granules lytiques.

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Nous remercions Emily Mace et Malini Mukherjee pour l’imagerie et l’analyse de déconvolution. Les travaux dans le laboratoire Liu ont été soutenus en partie par le Baylor-UTHouston Center for AIDS Research Core Support Grant numéro AI36211 de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses, le Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine, le Texas Children’s Hospital Pediatric Pilot Research Fund et le Lymphoma SPORE Developmental Research Program du Baylor College of Medicine et du Methodist Research Institute.

<ol><li>Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic immunological synapses.</a> Immunol. Rev. 235 (1), 24-34 (2010).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. upferH., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Hafeman, D. G., von Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+antibody-dependent+interactions+between+macrophages+and+lipid+haptens+in+planar+lipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Specific antibody-dependent interactions between macrophages and lipid haptens in planar lipid monolayers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 78 (7), 4552-4556 (1981).</li>
<li>Tscharner, V., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+properties+of+lipid+monolayers+on+alkylated+planar+glass+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Physical properties of lipid monolayers on alkylated planar glass surfaces.</a> Biophys J. 36 (2), 421-427 (1981).</li>
<li>Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TIRF+microscopy+technique+for+real-time%2C+simultaneous+imaging+of+the+TCR+and+its+associated+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+HIV-1+envelope-induced+virological+synapse+and+signaling+on+synthetic+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging of HIV-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. , (2008).</li>
<li>Michalet, X., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photon+statistics+to+boost+microscopy+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Using photon statistics to boost microscopy resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (13), 4797-4798 (2006).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Methods. 6 (1), 21-23 (2009).</li>
<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li>
<li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151(2011).</li>
<li>Leutenegger, M., Ringemann, C., Lasser, T., Hell, S. W., Eggeling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+with+a+total+internal+reflection+fluorescence+STED+microscope+%28TIRF-STED-FCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy with a total internal reflection fluorescence STED microscope (TIRF-STED-FCS).</a> Opt Express. 20 (5), 5243-5263 (2012).</li>
<li>Liu, D., Bryceson, Y. T., Meckel, T., Vasiliver-Shamis, G., Dustin, M. L., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+organization+and+bidirectional+vesicular+traffic+at+cytotoxic+immune+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent organization and bidirectional vesicular traffic at cytotoxic immune synapses.</a> Immunity. 31 (1), 99-109 (2009).</li>
<li>Liu, D., Peterson, M. E., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+protein+Crk+controls+activation+and+inhibition+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells.</a> Immunity. 36 (4), 600-611 (2012).</li>
<li>Wu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+conjugated+supported+lipid+bilayer+for+capturing+and+purification+of+viable+tumor+cells+in+blood+for+subsequent+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture.</a> Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La nouveauté de l&#39;étude est qu&#39;il combine la technique SLB avec STED pour étudier synapses des cellules NK. Des études antérieures ont imager la bicouche lipidique avec TIRF pour étudier des cellules T 8 la formation des synapses et la traite molécule de signalisation sur la membrane plasmique 6. D&#39;autres ont décrit STED imagerie des synapses des cellules NK en utilisant des lames de verre recouvertes d&#39;anticorps 13,14. Procédé hybride décrit ici en outre se appuie sur ces efforts par imagerie de la synapse des cellules NK avec la pureté améliorée conférée par imagerie super-résolution sur la surface de la bicouche lipidique, qui meilleurs modèles dynamique de la surface d&#39;une APC. Bien que des membranes artificielles SLBS sont dépourvues de cytosquelette, les radeaux lipidiques et d&#39;autres ligands que les cellules cibles réelles ou des APC possèdent, cette technique peut récapituler caractéristiques importantes telles que la mobilité et de l&#39;orientation de ligands. Cela permet au système SLB pour servir une approche réductionniste à disséquer til contribution des récepteurs et des ligands individuels à la formation de l&#39;IS et de la dynamique des IS. La caractéristique la plus importante de SLBS est que les chercheurs peuvent combiner cette technique avec des approches d&#39;imagerie à haute résolution, comme la microscopie confocale et la FRBR. L&#39;introduction de la microscopie STED augmente encore cet avantage, fournissant un aperçu sans précédent en est la recherche et de ses applications cliniques. Une critique potentiel de ce système est que le SLB ne reproduit pas de manière adéquate la surface d&#39;une APC complexe, donnant ainsi lieu à des caractéristiques anatomiques potentiellement non physiologiques dans les synapses qui en résultent. Se il est vrai que le répertoire limité de molécules de surface sur le SLB ne récapituler pas entièrement la surface hétérogène peuplé d&#39;une APC, cette limite peut également être avantageuse en ce qu&#39;elle permet aux chercheurs de déterminer l&#39;influence des interactions des récepteurs et ligands individuels sur la formation des synapses . Tvoici plusieurs étapes cruciales dans le processus. Parmi les plus critiques, ce est que l&#39;oxydation des liposomes être empêchée par l&#39;utilisation de l&#39;argon constamment à déplacer l&#39;oxygène dans le tube et une solution, par exemple dans les étapes 2,6, 1,10, et 2,11. L&#39;oxydation des lipides se traduira par une diminution de la mobilité des lipides, ce qui empêche ainsi la capacité des protéines de surface de se déplacer librement et de participer à la structuration synaptique. De même, il est également crucial d&#39;enlever tout le chloroforme dans le liposome par lyophilisation (étape 1.2). Dans la détermination de la densité de la protéine dans la bicouche lipidique, il est d&#39;une importance de premier disperser les perles de silicium en une suspension homogène exempt de groupes. Si nécessaire, la sonication de billes peut être appliquée. Dans le montage de la SLB, les premières étapes (05.01 à 05.08), dans lequel les lamelles sont nettoyés, les gouttes sont placées, et lamelle est apposée sont vitales. Une erreur dans l&#39;un de ces peut nécessiter de commencer l&#39;expérience plus (depuis le début de l&#39;article 5). Pour cette raison, il estbonnes pratiques pour nettoyer plus de lamelles sera nécessaire pour gagner du temps en cas d&#39;accident. Non-regroupement est la question la plus fréquente lorsque l&#39;on travaille avec ce système. Si, lors de la visualisation des cellules dans l&#39;étape finale, on ne parvient pas à trouver des synapses fluorescentes, il ya quelques étapes qui peuvent être prises. Une autre tache pour le récepteur de surface cellulaire apparenté peut être ajouté à la chambre afin de vérifier que la cellule n&#39;a pas formé une synapse avec la bicouche, Alors que les cellules peuvent adhérer de manière non spécifique à la surface de la lamelle de verre ou bicouche, les protéines de surface synaptique-impliquées devraient apparaît comme grappes distinctes au niveau du plan de l&#39;interface cellule-bicouche, tandis que les protéines de surface non engagés devraient apparaître comme coloration diffuse autour du périmètre de la cellule. Si cette méthode échoue, il faut vérifier leurs cellules par cytométrie de flux pour assurer que le marqueur particulier une espère étudier est exprimée en abondance suffisante sur la surface de la cellule. Certains prote de surfaceins sont connus pour être régulé à la baisse plus long terme dans la culture vivo. Bien que ce protocole détails spécifiquement comment NK visualiser la formation des synapses des cellules, le système SLB peut être utilisée pour étudier la formation des synapses dans toute immunocytes imaginable simplement par la substitution du ligand dans l&#39;étape primaire 5,11. Plusieurs ligands peuvent également être ajoutés simultanément. Un devez également pas utiliser un système streptavidine-biotine pour faire adhérer les protéines de surface dans la bicouche. Nickel-NTA: interactions histidine sont également viable. Toutefois, en raison de la résistance élevée et la spécificité de la streptavidine: interaction biotine, notre laboratoire préfère ce système. On peut également faire varier la concentration de cellules ajoutées sur la bicouche de la densité prédéterminée à l&#39;étape 5.13, ainsi que la durée de la période d&#39;incubation subséquente afin d&#39;observer les synapses à différents stades de maturation. Cela peut même être fait en direct, bien que cela exclut évidemment la possibilité de visualiser str intracellulaireuctures (sauf se ils sont déjà étiquetés avec une étiquette fluorescente fusionnée; notre laboratoire utilise quelques telles lignées cellulaires modifiées). En raison du degré élevé de personnalisation possible dans ce protocole, on peut utiliser la technique SLB de base, ainsi que l&#39;imagerie STED, pour répondre à un éventail incroyable diversité de questions en immunologie, la biologie cellulaire et la biochimie, y compris la dynamique de lipides de base 15, la formation des synapses 16, 17 signalisation intracellulaire, et la cellule tumorale 18 métastases.

La synapse immunologique (IS) se trouve à un carrefour critique pour l&#39;activation et la fonction une cellule. Ce est le moyen principal par lequel la présentation des antigènes et de l&#39;immunité à médiation cellulaire sont réalisés. Les premières études microscopiques de la formation des synapses utilisés un système conjugué cellule-cellule 2. La principale limite de cette approche est que la plupart des conjugués sera consulté &#39;profil&#39;, pour ainsi dire, limitant ainsi le point de vue de l&#39;observateur de la structure synaptique lui-même. En 1999, le laboratoire Dustin adressée cette limitation en utilisant la technique 3-verre soutenue bicouche lipidique (SLB), qui avait été un pionnier tôt par le laboratoire 4,5 McConnel. Cette approche disposé de cellules présentatrices d&#39;antigène (CPA) en faveur d&#39;une surface plane lipidique verre soutenue, dans lequel protéines pourraient être attachés et se déplacent librement dans deux dimensions. En utilisant cette méthode, Dustin et ses collègues ont pu pairs directement vers le haut dans til Synapse utilisant la microscopie à fluorescence haute résolution, et pour la première fois obtenir un look &quot;face-à-face&quot; à la structure de l&#39;IS. Avec l&#39;utilisation du système SLB, le détail avec lequel la SI peut être visualisé a été limité seulement par les limites des techniques actuelles d&#39;imagerie 8.6. En utilisant des techniques d&#39;éclairage classiques, la résolution minimale (ce est à dire, la distance minimale entre deux objets distincts dans laquelle ils peuvent être distingués) a été &lt;200 nm sur la base du critère de Rayleigh neuf. Cette limite empêche l&#39;imagerie de structures très fines, à l&#39;échelle moléculaire qui composent la synapse, et jusqu&#39;à ce que le développement de techniques d&#39;imagerie de super-résolution 12/10, la visualisation de ces structures se est limitée à l&#39;imagerie de cellules fixées à l&#39;aide de la microscopie électronique. Avec l&#39;avènement récent d&#39;une variété de techniques de super-résolution, telles que la carte SIM (microscopie éclairage structuré), PALM (microscopie de localisation photoactivé), STORM (microscopie de reconstruction optique stochastique) et STED 10-12, les enquêteurs sont maintenant en mesure d&#39;étudier ces structures synaptiques en détail sans précédent, qui a à son tour fourni une compréhension de plus clarifié de l&#39;IS. Les avantages de la microscopie STED ont été décrits avant le 13. Nous décrivons ici super-résolution imagerie par microscopie STED équipé du laser 660 nm d&#39;épuisement nouvellement développé. Par rapport à la 592 nm laser appauvrissement classique, le laser de 660 nm permet une sélection plus large de colorants fluorescents (voir http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), en particulier ces fluorophores rouges. Autres publications ont décrit l&#39;imagerie STED des synapses des cellules NK sur des lames de verre recouvertes d&#39;anticorps 13,14. Ici, le système est combiné avec SLB super-résolution microscopie STED pour étudier la cellule NK synapse. Cette technique présente l&#39;avantage par rapport aux anticorps-des lames revêtues d&#39;être une mosaïque de fluide, dans lequel les protéines de surface embarqués peuvent se déplacer librement dans une surface à deux dimensions à plat (plan xy). Cela imite plus fidèlement la surface organique et mobiles d&#39;une cellule cible, et par conséquent mieux récapitule la formation d&#39;une synapse immunologique physiologiquement pertinent. L&#39;objectif de ce protocole est de fournir à l&#39;utilisateur final avec une description détaillée de la façon de l&#39;image de la synapse immunologique des cellules NK en combinant le système SLB et de super-résolution STED microscopie. Il fournira à l&#39;utilisateur final avec les mesures nécessaires pour: préparer les liposomes, construire bicouches protéines intégré, déterminer la densité de protéine sur les bicouches lipidiques, et acquérir des images de super-résolution utilisant la microscopie STED. Ces techniques ne sont pas limités au domaine de l&#39;immunologie, et peuvent être largement utilisés dans divers domaines.

<table><tbody><tr><td>18:1 (&Delta ; 9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti&nbsp ;</td><td>850375C</td><td>Préparation de liposomes</td></tr><tr><td>18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sel de sodium)</td><td>Avanti&nbsp ;</td><td>870273C&nbsp ;</td><td>Préparation des liposomes</td></tr><tr><td>Gaz argon,</td><td>air</td> comprimé<td>UN1006</td><td>Préparation de liposomes</td></tr><tr><td>A lyophiliseur</td><td>Labconco&nbsp ;</td><td>Freezone 7740020</td><td>Préparation de liposomes</td></tr><tr><td>Tubes lyophilisateurs</td><td>Labconco&nbsp ;</td><td>7540200</td><td>Préparation des liposomes</td></tr><tr><td>Colonnes de chromatographie</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-205558</td><td>Préparation des liposomes</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td><td>Ambion&nbsp ;</td><td>AM9856</td><td>Préparation de liposomes</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Ambion&nbsp ;</td><td>AM9759</td><td>Préparation de liposomes</td></tr><tr><td>Octyl-&beta ;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>O1008</td><td>Préparation des liposomes</td></tr><tr><td>Tube de dialyse</td><td><a href="http://www.spectrumlabs.com/generic/tms.html ? LiFrom=%2Fdialysis%2FRCtubing.html ; FrName=Spectra %2FPor+RC+Tubing ; rtm=Kit ;#KIT">Spectrum Labs&nbsp ; </a></td><td>132676</td><td>Préparation des liposomes</td></tr><tr><td>Plaque de polystyrène à fond en V à 96 puits (non traitée)</td><td>Détermination de la densité des anticorps</td> <td>Corning</td><td>3896</td></tr><tr><td>Perles de silice non fonctionnalisées</td><td>Bangs Laboratories&nbsp ;</td><td>SS06N</td><td>détermination</td></tr><tr><td>de la densité des anticorps Tubes FACS</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>14-959-2A&nbsp ;</td><td>détermination de la densité des anticorps</td></tr><tr><td>Perles QuantumTM MESF</td><td>Bangs Laboratories</td><td>Détermination de</td><td>la densité</td>variable</tr><tr><td>des anticorps Caséine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>C0875</td><td>Préparation de bicouche lipidique</td></tr><tr><td>HEPES solution saline tamponnée + 1 % HSA</td><td>Préparation bicouche lipidique maison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine&nbsp ;</td><td>Technologies du vivant&nbsp ;</td><td>434301</td><td>Préparation de bicouche</td></tr><tr><td>lipidique Protéine biotinylée marquée par fluorescence</td><td>Préparation bicouche lipidique maison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ibidi Sticky-Slide VI 0.4</td><td>ibidi&nbsp ;</td><td>80608</td><td>Préparation de la bicouche lipidique</td></tr><tr><td>25x75 mm lamelle en verre</td><td>ibidi&nbsp ;</td><td>10812</td><td>Préparation de bicouches lipidiques</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène (30 %)</td><td>Fisher Scientic&nbsp ;</td><td>BP2633</td><td>Préparation de bicouche lipidique</td></tr><tr><td>Acide sulfurique</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>258105</td><td>Préparation de bicouche lipidique</td></tr><tr><td>D-Biotine</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>B20656</td><td>Préparation de la bicouche lipidique</td></tr><tr><td>Papier pour lentilles</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>54826-001</td><td>Pour l’imagerie</td></tr><tr><td>de l’huile d’immersion de type F</td><td>Leica&nbsp ;</td><td>11 513 859</td><td>Pour l’imagerie</td></tr><tr><td>Un microscope Leica TCS STED</td><td>Leica</td><td></td><td>Pour l’imagerie</td></tr></tbody></table>

super-résolution de l&#39;imagerie cellulaire synapse immunologique natural killer sur un verre soutenu par planar lipidique en deux couches

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

Le système bicouche lipidique planaire soutenu par du verre a été utilisé dans diverses disciplines. L’une des applications les plus utiles de cette technique a été l’étude de la formation immunologique des synapses, en raison de la capacité des bicouches lipidiques planes soutenues par du verre à imiter la surface d’une cellule cible tout en formant une interface horizontale. Les progrès récents de l’imagerie à super-résolution ont permis aux scientifiques de mieux voir les détails de la structure des synapses. Dans cette étude, l’une de ces techniques avancées, la déplétion par émission stimulée (STED), est utilisée pour étudier la structure des synapses cellulaires tueuses naturelles (NK) sur la bicouche lipidique supportée. Vous trouverez ici un protocole facile à suivre détaillant : comment préparer des phospholipides synthétiques bruts pour une utilisation dans la synthèse de bicouches supportées par du verre ; comment déterminer la densité des protéines d’une concentration donnée qui occupent les sites d’attache de la bicouche ; comment construire une bicouche lipidique supportée contenant des anticorps contre le récepteur d’activation des cellules NK CD16 ; et enfin, comment imager les cellules NK humaines sur cette bicouche à l’aide de la microscopie à super-résolution STED, en mettant l’accent sur la distribution des granules lytiques positifs à la perforine et de l’actine filamenteuse au niveau des synapses NK. Ainsi, en combinant le système de bicouche lipidique planaire soutenu par du verre avec la technique STED, nous démontrons la faisabilité et l’application de cette technique combinée, ainsi que des structures intracellulaires au niveau de la synapse immunologique NK avec super-résolution.

La figure 1 montre le résultat de la densité de l&#39;anticorps sur la bicouche lipidique. Le principe est d&#39;utiliser des billes standard pour rendre la courbe standard du MESF par rapport IMF par cytométrie de flux (A). Le MFI de la série d&#39;échantillons a été converti en MESF en utilisant la courbe standard. La densité d&#39;anticorps sur la bicouche lipidique est linéairement corrélée avec la concentration d&#39;anticorps (B). Figure 2 montrent la couleur triple STED l&#39;image de NK synapse sur verre-support plan bicouche lipidique. L&#39;anticorps anti-CD16 sur la bicouche lipidique se accumule, provoquant la formation de F-actine et de la polarisation et de la pénétration à travers les mailles perforine F-actine à partir du panneau central de synapse immunologique des cellules NK. En utilisant cette approche combinée, on peut observer les microamas proprement marquées par fluorescence de anti-CD16 dans le SLB, qui reflète directement le regroupement de CD16 sur la cellule NK. Par rapport à l&#39;image confocale classique, la structure du CD16 central cluster est plus facilement discerné dans l&#39;image la STED en raison de la fluorescence ambiante appauvri. En outre, l&#39;ultrastructure du cytosquelette d&#39;actine est vu avec une résolution améliorée de manière significative. Conformément aux observations antérieures 16,17, les granules lytiques perforine positif sont considérés positionné au-dessus des régions de faible densité F-actine dans l&#39;image la STED, un détail crucial qui est la plupart du temps perdu dans l&#39;image confocale. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig1highres.jpg" /> Figure 1. Densité d&#39;anticorps 3G8 sur bicouche lipidique. (A) de corrélation linéaire entre MESF et IMF pour la série standard. (B) corrélation linéaire entre la densité des protéines et de la concentration pour la série protéine échantillon de dilution, indiquant le nombre de monomères marquées par fluorescence protéines par unité de surface en fonction de la concentration croissante de Si revêtus de lipidesperles de lica. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52502/52502fig2highres.jpg" /> Figure 2. STED imagerie de NK synapse sur plan bicouche lipidique. Cellules NK primaire ont été stimulées sur le SLB contenant biotinylé marqué par fluorescence anti-CD16 (rouge), fixées, perméabilisées, puis colorées avec la phalloïdine (bleu) et anti-F-actine (vert). Une cellule individuelle a été imagé sous le paramètre confocal normale, puis le réglage STED. Images confocale et STED ont été déconvolution en utilisant un logiciel Huygens. Barre d&#39;échelle, une um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52502/52502fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour une version plus grande de cette figure.</a>

Nous décrivons ici une combinaison de la technique de bicouche lipidique soutenue par du verre pour former des synapses immunologiques avec la technique d’imagerie à super-résolution de la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). L’objectif de ce protocole est de fournir aux utilisateurs les instructions nécessaires pour mener à bien ces deux techniques.

Super-résolution de l&#39;imagerie cellulaire Synapse immunologique Natural Killer sur un verre soutenu par Planar lipidique en deux couches

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer comment capturer avec succès des images en super-résolution des synapses immunologiques des cellules natural killer, ou cellules NK, sur un bicouche lipidique supportée. Cette étape est réalisée en construisant une bicouche lipidique plane supportée par du verre, contenant des anticorps dirigés contre le récepteur activateur des cellules NK, CD16, dans des lamelles-chambres. Les cellules NK préalablement isolées sont ensuite ajoutées sur la bicouche lipidique plane intégrant les anticorps, suivies d'une coloration des cellules avec l'actine F et la perforine.La dernière étape consiste à imager les synapses des cellules NK résultantes à l'aide du microscope stead, permettant finalement d'obtenir une image de la synapse NK sur le bicouche lipidique supportée. L'utilisation de la technique stead révèle la synapse de la cellule NK avec un détail accru, permettant ainsi de visualiser l'ultrastructure du cytosquelette d'actine et des granules lytiques positifs en perran positionnés au-dessus des régions de faible densité d'actine F. L'intérêt principal de cette technique réside dans le fait que la barrière lipidique plane supportée par verre peut imiter la membrane plasmique de la cellule cible, ainsi que les protéines présentes sur cette barrière lipidique plane.Ils peuvent se déplacer latéralement, ce qui permet de mieux recréer la formation du synapse immunitaire, un phénomène très pertinent sur le plan logique. Ce dispositif peut aider à répondre à des questions fondamentales dans le domaine de l'immunologie, permettant aux chercheurs de visualiser la formation du synapse de manière contrôlée et en détail, ce qui est inatteignable avec les approches commerciales et microscopiques classiques. Un postdoctorant et une bourse doctorale démontreront la procédure pour assembler la bicouche lipidique plane supportée sur verre.Préparez d'abord 100 millilitres de solution de piranha en mélangeant du peroxyde d'hydrogène à 30 % avec de l'acide sulfurique dans un rapport de un à trois dans un bécher. Placez deux lamelles rectangulaires en verre numéro 1,5 dans cette solution pendant 20 à 30 minutes, le temps de les nettoyer. Récupérez un tube contenant précédemment préparé des lipides DOPC à 400 micromolaire et un tube contenant précédemment préparé des lipides biotine-PE à 80 micromolaire.Les transporter sur glace jusqu'au réservoir d'argon après avoir désossigéné un nouveau tube de microcentrifugeuse avec de l'argon. Ajouter ensemble le DOPC et le PE biotine dans un rapport un pour un. Le volume spécifique variera selon les besoins expérimentaux, mais doit être d'au moins deux microlitres.Chaque désoxygène le tube du mélange et les tubes de réactifs individuels avant de remettre l'échelle au réfrigérateur. Une fois le nettoyage terminé, rincez soigneusement les lamelles avec de l'eau distillée. Laissez les lamelles sécher à l'air libre pendant quelques minutes, puis prélevez 1,5 microlitre du mélange de liposomes et répartissez-le en une seule goutte dans l'une des chambres de migration d'une lame à chambres.L'utilisation de deux gouttes par lane est courante, mais pas obligatoire. Placez maintenant rapidement et efficacement la lame couvre-objet sèche au-dessus des gouttes, en veillant à ce qu'elles soient suffisamment espacées pour ne pas fusionner une fois la lame couvre-objet posée. En outre, assurez-vous que les gouttes restent circulaires et bien délimitées, sans toucher les bords des parois de la chambre.Appuyez fermement entre chaque piste et autour de celles-ci pour assurer un joint étanche entre le couvercle. Marquez à l’aide d’un stylo-feutre les positions des gouttes. Ensuite, faites passer 100 microlitres d’une solution aqueuse à 5 % de casing à travers la chambre pour bloquer la bicouche.Veillez à ce qu'il n'y ait pas de bulles dans la chambre d'écoulement. Ensuite, injectez 100 microlitres de streptadine à une concentration de 333 nanogrammes par millilitre dans chaque canal. Après une incubation de 10 à 15 minutes à température ambiante, effectuez un lavage en faisant circuler trois millilitres de solution saline tamponnée HEPES contenant 1 % d'albumine sérique humaine dans chaque canal.Pour éliminer l'excès de tritine, ajouter 100 microlitres d'anticorps anti-CD16 marqué par biotine et fluorescent à la concentration protéique précédemment déterminée, comme décrit dans le protocole du texte, après une incubation à l'abri de la lumière pendant 20 à 30 minutes. Rincer à nouveau en faisant passer trois millilitres de solution saline tamponnée au HEPES contenant 1 % d'albumine sérique humaine à travers chaque compartiment. Ensuite, faire circuler 100 microlitres de D-biotine à une concentration de 25 nanomolaire à travers la chambre afin de lier tout excès de STR tabin et ainsi éliminer tout risque de liaison non spécifique du STR tabin aux cellules.Comptez ensuite les cellules NK humaines et resuspendez-les à une concentration de 500 000 par millilitre dans du tampon salin avec 1 % d'albumine sérique humaine. Éliminez le D-biotine de la chambre à l'aide de trois millilitres supplémentaires de tampon salin avec 1 % d'albumine sérique humaine par voie. Une fois les cellules resuspendues à la concentration souhaitée, ajoutez 100 microlitres dans chaque voie.Placer la chambre dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 à 60 minutes. Après cette période d'incubation, fixer les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante pendant 10 à 20 minutes. Laver en faisant passer trois millilitres de solution saline tamponnée au phosphate dans chaque canal pour éliminer le paraformaldéhyde.Ensuite, ajouter 400 microlitres de tampon de blocage avant d'incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Puis, colorer l'actine F et la perforine en ajoutant deux microlitres de phalloïdine marquée au fluorochrome diluée et d'anticorps monoclonal marqué au fluorochrome anti-perforine, et incuber à température ambiante pendant une heure avant de laver en faisant passer trois millilitres de solution saline tamponnée au phosphate à travers la chambre. La chambre est alors prête pour la réalisation des images.Activez tous les modules matériels nécessaires du microscope stead. Lancez le logiciel d'analyse d'images et activez les modules de balayage résonant et de stead. Après avoir effectué ces sélections, attendez environ trois à cinq minutes que le logiciel s'initialise.Cliquez sur l'onglet configuration en haut de l'écran, sélectionnez laser config. Ensuite, activez la lumière blanche et les lasers stéd à 592 nanomètres. Choisissez l'objectif 100 x et alignez le faisceau laser d'excitation avec un laser de déplétion de 592 nanomètres.Sélectionnez le module de configuration laser, désactivez le laser de déplétion à 592 nm et activez le laser de déplétion à 660 nanomètres. Placez la lame sur la platine au-dessus de l'objectif. Mettez au point les cellules liées à la région de bicouche délimitée à l’aide de la lampe à lumière blanche et des oculaires.Ensuite, revenez directement à l'onglet d'acquisition situé juste à droite de l'onglet de configuration. Cliquez sur l'onglet de lumière blanche, activez ensuite ce module et faites glisser la ligne laser d'excitation jusqu'à la longueur d'onde appropriée. Après avoir sélectionné le détecteur souhaité et défini la plage de détection, cliquez sur le bouton séquentiel dans la barre d'outils d'acquisition située à gauche pour afficher la boîte de dialogue de balayage séquentiel en bas de la barre d'outils gauche.Cela permet à l'utilisateur d'ajouter plusieurs séquences, chacune avec un faisceau d'excitation différent pour une couleur distincte. Cliquez entre les images, puis définissez la fréquence d'excitation, le détecteur et la plage de détection pour chaque couleur supplémentaire. Une fois tous les paramètres optimisés, appuyez sur démarrer pour commencer le processus d'acquisition.L’image stable en triple couleur de la synapse de cellule NK sur une bicouche lipidique plane supportée par du verre montre que l’anticorps anti-CD16, représenté en rouge, s’accumule sur la bicouche lipidique, induisant la formation d’actine F et la polarisation ainsi que la pénétration de la perforine, représentée en bleu, à travers le réseau d’actine F au niveau du plan focal. Grâce à cette approche combinée, on peut observer clairement les micro-amas d’anticorps anti-CD16 marqués de manière fluorescente au sein de la bicouche lipidique supportée par du verre, reflétant directement l’agrégation de CD16 sur la cellule NK. Par rapport à l’image confocale conventionnelle, la structure en anneau de l’amas central de CD16 est plus facilement discernable sur l’image stable en raison de la fluorescence ambiante atténuée.En outre, la structure ultrafine du cytosquelette d'actine est observée avec une résolution nettement améliorée. Conformément aux observations antérieures, les granules lytiques positifs pour la périphérie sont observés positionnés au-dessus des régions présentant une faible densité d'actine F. Dans l'image STEAD, un détail crucial qui est en grande partie perdu dans l'image confocale. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ quatre heures si elle est effectuée correctement.Il est important de garder votre échantillon désossigéné en déplaçant répétitivement l'oxygène par de l'argon, et en assemblant la chambre en posant rapidement la lame couvre-objet sur votre échantillon et en l'immergeant dans la solution d'enrobage.

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