Super-résolution de l'imagerie cellulaire Synapse immunologique Natural Killer sur un verre soutenu par Planar lipidique en deux couches

L'objectif général de cette procédure est de démontrer comment capturer avec succès des images en super-résolution des synapses immunologiques des cellules natural killer, ou cellules NK, sur un bicouche lipidique supportée. Cette étape est réalisée en construisant une bicouche lipidique plane supportée par du verre, contenant des anticorps dirigés contre le récepteur activateur des cellules NK, CD16, dans des lamelles-chambres. Les cellules NK préalablement isolées sont ensuite ajoutées sur la bicouche lipidique plane intégrant les anticorps, suivies d'une coloration des cellules avec l'actine F et la perforine.

La dernière étape consiste à imager les synapses des cellules NK résultantes à l'aide du microscope stead, permettant finalement d'obtenir une image de la synapse NK sur le bicouche lipidique supportée. L'utilisation de la technique stead révèle la synapse de la cellule NK avec un détail accru, permettant ainsi de visualiser l'ultrastructure du cytosquelette d'actine et des granules lytiques positifs en perran positionnés au-dessus des régions de faible densité d'actine F. L'intérêt principal de cette technique réside dans le fait que la barrière lipidique plane supportée par verre peut imiter la membrane plasmique de la cellule cible, ainsi que les protéines présentes sur cette barrière lipidique plane.

Ils peuvent se déplacer latéralement, ce qui permet de mieux recréer la formation du synapse immunitaire, un phénomène très pertinent sur le plan logique. Ce dispositif peut aider à répondre à des questions fondamentales dans le domaine de l'immunologie, permettant aux chercheurs de visualiser la formation du synapse de manière contrôlée et en détail, ce qui est inatteignable avec les approches commerciales et microscopiques classiques. Un postdoctorant et une bourse doctorale démontreront la procédure pour assembler la bicouche lipidique plane supportée sur verre.

Préparez d'abord 100 millilitres de solution de piranha en mélangeant du peroxyde d'hydrogène à 30 % avec de l'acide sulfurique dans un rapport de un à trois dans un bécher. Placez deux lamelles rectangulaires en verre numéro 1,5 dans cette solution pendant 20 à 30 minutes, le temps de les nettoyer. Récupérez un tube contenant précédemment préparé des lipides DOPC à 400 micromolaire et un tube contenant précédemment préparé des lipides biotine-PE à 80 micromolaire.

Les transporter sur glace jusqu'au réservoir d'argon après avoir désossigéné un nouveau tube de microcentrifugeuse avec de l'argon. Ajouter ensemble le DOPC et le PE biotine dans un rapport un pour un. Le volume spécifique variera selon les besoins expérimentaux, mais doit être d'au moins deux microlitres.

Chaque désoxygène le tube du mélange et les tubes de réactifs individuels avant de remettre l'échelle au réfrigérateur. Une fois le nettoyage terminé, rincez soigneusement les lamelles avec de l'eau distillée. Laissez les lamelles sécher à l'air libre pendant quelques minutes, puis prélevez 1,5 microlitre du mélange de liposomes et répartissez-le en une seule goutte dans l'une des chambres de migration d'une lame à chambres.

L'utilisation de deux gouttes par lane est courante, mais pas obligatoire. Placez maintenant rapidement et efficacement la lame couvre-objet sèche au-dessus des gouttes, en veillant à ce qu'elles soient suffisamment espacées pour ne pas fusionner une fois la lame couvre-objet posée. En outre, assurez-vous que les gouttes restent circulaires et bien délimitées, sans toucher les bords des parois de la chambre.

Appuyez fermement entre chaque piste et autour de celles-ci pour assurer un joint étanche entre le couvercle. Marquez à l’aide d’un stylo-feutre les positions des gouttes. Ensuite, faites passer 100 microlitres d’une solution aqueuse à 5 % de casing à travers la chambre pour bloquer la bicouche.

Veillez à ce qu'il n'y ait pas de bulles dans la chambre d'écoulement. Ensuite, injectez 100 microlitres de streptadine à une concentration de 333 nanogrammes par millilitre dans chaque canal. Après une incubation de 10 à 15 minutes à température ambiante, effectuez un lavage en faisant circuler trois millilitres de solution saline tamponnée HEPES contenant 1 % d'albumine sérique humaine dans chaque canal.

Pour éliminer l'excès de tritine, ajouter 100 microlitres d'anticorps anti-CD16 marqué par biotine et fluorescent à la concentration protéique précédemment déterminée, comme décrit dans le protocole du texte, après une incubation à l'abri de la lumière pendant 20 à 30 minutes. Rincer à nouveau en faisant passer trois millilitres de solution saline tamponnée au HEPES contenant 1 % d'albumine sérique humaine à travers chaque compartiment. Ensuite, faire circuler 100 microlitres de D-biotine à une concentration de 25 nanomolaire à travers la chambre afin de lier tout excès de STR tabin et ainsi éliminer tout risque de liaison non spécifique du STR tabin aux cellules.

Comptez ensuite les cellules NK humaines et resuspendez-les à une concentration de 500 000 par millilitre dans du tampon salin avec 1 % d'albumine sérique humaine. Éliminez le D-biotine de la chambre à l'aide de trois millilitres supplémentaires de tampon salin avec 1 % d'albumine sérique humaine par voie. Une fois les cellules resuspendues à la concentration souhaitée, ajoutez 100 microlitres dans chaque voie.

Placer la chambre dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 à 60 minutes. Après cette période d'incubation, fixer les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante pendant 10 à 20 minutes. Laver en faisant passer trois millilitres de solution saline tamponnée au phosphate dans chaque canal pour éliminer le paraformaldéhyde.

Ensuite, ajouter 400 microlitres de tampon de blocage avant d'incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Puis, colorer l'actine F et la perforine en ajoutant deux microlitres de phalloïdine marquée au fluorochrome diluée et d'anticorps monoclonal marqué au fluorochrome anti-perforine, et incuber à température ambiante pendant une heure avant de laver en faisant passer trois millilitres de solution saline tamponnée au phosphate à travers la chambre. La chambre est alors prête pour la réalisation des images.

Activez tous les modules matériels nécessaires du microscope stead. Lancez le logiciel d'analyse d'images et activez les modules de balayage résonant et de stead. Après avoir effectué ces sélections, attendez environ trois à cinq minutes que le logiciel s'initialise.

Cliquez sur l'onglet configuration en haut de l'écran, sélectionnez laser config. Ensuite, activez la lumière blanche et les lasers stéd à 592 nanomètres. Choisissez l'objectif 100 x et alignez le faisceau laser d'excitation avec un laser de déplétion de 592 nanomètres.

Sélectionnez le module de configuration laser, désactivez le laser de déplétion à 592 nm et activez le laser de déplétion à 660 nanomètres. Placez la lame sur la platine au-dessus de l'objectif. Mettez au point les cellules liées à la région de bicouche délimitée à l’aide de la lampe à lumière blanche et des oculaires.

Ensuite, revenez directement à l'onglet d'acquisition situé juste à droite de l'onglet de configuration. Cliquez sur l'onglet de lumière blanche, activez ensuite ce module et faites glisser la ligne laser d'excitation jusqu'à la longueur d'onde appropriée. Après avoir sélectionné le détecteur souhaité et défini la plage de détection, cliquez sur le bouton séquentiel dans la barre d'outils d'acquisition située à gauche pour afficher la boîte de dialogue de balayage séquentiel en bas de la barre d'outils gauche.

Cela permet à l'utilisateur d'ajouter plusieurs séquences, chacune avec un faisceau d'excitation différent pour une couleur distincte. Cliquez entre les images, puis définissez la fréquence d'excitation, le détecteur et la plage de détection pour chaque couleur supplémentaire. Une fois tous les paramètres optimisés, appuyez sur démarrer pour commencer le processus d'acquisition.

L’image stable en triple couleur de la synapse de cellule NK sur une bicouche lipidique plane supportée par du verre montre que l’anticorps anti-CD16, représenté en rouge, s’accumule sur la bicouche lipidique, induisant la formation d’actine F et la polarisation ainsi que la pénétration de la perforine, représentée en bleu, à travers le réseau d’actine F au niveau du plan focal. Grâce à cette approche combinée, on peut observer clairement les micro-amas d’anticorps anti-CD16 marqués de manière fluorescente au sein de la bicouche lipidique supportée par du verre, reflétant directement l’agrégation de CD16 sur la cellule NK. Par rapport à l’image confocale conventionnelle, la structure en anneau de l’amas central de CD16 est plus facilement discernable sur l’image stable en raison de la fluorescence ambiante atténuée.

En outre, la structure ultrafine du cytosquelette d'actine est observée avec une résolution nettement améliorée. Conformément aux observations antérieures, les granules lytiques positifs pour la périphérie sont observés positionnés au-dessus des régions présentant une faible densité d'actine F. Dans l'image STEAD, un détail crucial qui est en grande partie perdu dans l'image confocale. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ quatre heures si elle est effectuée correctement.

Il est important de garder votre échantillon désossigéné en déplaçant répétitivement l'oxygène par de l'argon, et en assemblant la chambre en posant rapidement la lame couvre-objet sur votre échantillon et en l'immergeant dans la solution d'enrobage.