Super-résolution de l'imagerie cellulaire Synapse immunologique Natural Killer sur un verre soutenu par Planar lipidique en deux couches

L’objectif global de cette procédure est de démontrer comment capturer avec succès des images à super résolution des synapses immunologiques des cellules tueuses naturelles ou NK sur la bicouche lipidique supportée. Ceci est accompli en construisant une bicouche lipidique planaire supportée par du verre contenant des anticorps contre le récepteur d’activation des cellules NK CD 16 dans des lames de chambre. Les cellules NK précédemment isolées sont ensuite ajoutées à la bicouche lipidique planaire intégrée dans l’anticorps, suivie d’une coloration des cellules avec de l’actine f et de la perforine.

La dernière étape consiste à imager les synapses des cellules NK résultantes à l’aide du microscope stead, puis à imager la synapse NK sur la bicouche lipidique supportée. L’utilisation de stead montre la synapse des cellules NK avec plus de détails, ce qui permet de visualiser l’ultrastructure du cytosquelette d’actine et des granules litiques positifs perran positionnés sur des régions de faible densité d’actine F. L’essentiel de cette technique est donc que la barrière lipidique simple supportée en verre peut imiter la membrane positive de la cellule tuck, la protéine sur cette barrière lipidique simple.

Ils peuvent se déplacer latéralement, ce qui peut mieux récapituler la formation de l’immunosynapse très logiquement pertinente. Ce message peut aider à répondre aux chrétiens clés dans le domaine de l’immunologie, permettant aux chercheurs de visualiser la formation des synapses de manière contrôlée avec des détails, ce qui est irréalisable en utilisant des approches commerciales et microscopiques. Un boursier postdoctoral en peinture et une bourse d’étudiant diplômé feront la démonstration de la procédure d’assemblage de la bicouche lipidique planaire soutenue par du verre.

Tout d’abord, préparez 100 millilitres de solution de piranha en mélangeant 30 % de peroxyde d’hydrogène avec de l’acide sulfurique dans un rapport de un à trois dans un bécher dans cette solution. Placez deux lamelles rectangulaires numéro 1.5 pendant 20 à 30 minutes pendant le nettoyage des lamelles. Récupérez un tube de 400 lipides DOPC micromolaires préalablement préparés et un tube de lipides PE de biotine 80 micromolaires préalablement préparés.

Transportez-les sur de la glace jusqu’au réservoir d’argon après oxygénation désoxygénée d’un nouveau tube de micro-centrifugeuse avec de l’argon. Additionnez le DOPC et la biotine PE dans un rapport de un pour un. Le volume spécifique variera en fonction des besoins expérimentaux, mais devrait être d’au moins deux microlitres.

Chaque désoxygénation du tube de mélange et des tubes de réactifs individuels avant de remettre l’échelle dans le réfrigérateur. Une fois le nettoyage terminé, rincez abondamment les lamelles à l’eau distillée. Mettez le couvercle à sécher à l’air libre pendant quelques minutes, puis prélevez 1,5 microlitres du mélange de liposomes et aliquote en une seule goutte dans l’une des chambres de couloir d’une lame de chambre.

L’utilisation de deux chutes par voie est typique mais pas nécessaire. Maintenant, rapidement et efficacement, placez la lamelle sèche sur les gouttelettes, assurez-vous que les gouttes sont suffisamment espacées pour qu’elles ne fusionnent pas une fois la lamelle placée. De plus, assurez-vous que les gouttes restent circulaires et bien définies sans toucher les bords des parois de la chambre.

Appuyez fermement entre et autour de chaque voie pour assurer une étanchéité entre le couvercle. Glissez et glissez pour marquer les positions des gouttes à l’aide d’un marqueur. Passez ensuite 100 microlitres de boyau aqueux à 5 % à travers la chambre pour bloquer la bicouche.

Essayez de vous assurer qu’il n’y a pas de bulles dans la chambre d’écoulement. Injectez ensuite 100 microlitres d’adin streptoctique à une concentration de 333 nanogrammes par millilitre dans chaque voie. Après avoir incubé pendant 10 à 15 minutes à température ambiante, laver en faisant couler trois millilitres de sérum salin tamponné avec 1 % d’albumine sérique humaine dans chaque voie.

Pour éliminer l’excès de tritine, ajoutez 100 microlitres d’anti CD 16 biotinylé marqué par fluorescence à la concentration protéique précédemment déterminée comme décrit dans le protocole textuel après une incubation dans l’obscurité pendant 20 à 30 minutes. Lavez à nouveau en faisant passer trois millilitres de tas de solution saline tamponnée avec 1 % d’albumine sérique humaine dans chaque voie. Ensuite, faites couler 100 microlitres de biotine D à une concentration de 25 nanomolaires à travers la chambre afin de lier tout excès de STR tabin et ainsi éliminer le risque de liaison non spécifique de STR tabin aux cellules.

Ensuite, comptez les cellules NK humaines et mettez-les en suspension à une concentration de 500 000 par millilitre dans des tas de solution saline tamponnée avec 1 % d’albumine sérique humaine. Lavez la biotine D de la chambre avec trois autres millilitres de solution saline tamponnée avec 1 % d’albumine sérique humaine par voie. Une fois que les cellules ont été remises en suspension à la concentration souhaitée, ajoutez 100 microlitres dans chaque voie.

Placez la chambre dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de dioxyde de carbone pendant 30 à 60 minutes. Après cette période d’incubation, fixez les cellules avec 4 % d’aldéhyde paraforme à température ambiante pendant 10 à 20 minutes. Lavez en faisant couler trois millilitres de solution saline tamponnée au phosphate dans chaque voie pour éliminer l’aldéhyde paraforme.

Ajoutez ensuite 400 microlitres de tampon de blocage avant d’incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, colorez l’actine et la perforine en ajoutant deux microlitres de Phin dilué marqué par fluorescence et d’anticorps monoclonal anti-perran marqué par fluorescence incuber à température ambiante pendant une heure avant de laver en faisant passer trois millilitres de solution saline tamponnée au phosphate à travers la chambre. La chambre est prête pour le début de l’imagerie.

Allumez tous les modules matériels nécessaires du microscope stead. Démarrez le logiciel d’analyse d’images et activez les modules de balayage résonant et de stabilité. Après avoir effectué ces sélections, attendez environ trois à cinq minutes que le logiciel se lance.

Cliquez sur l’onglet de configuration en haut de l’écran, sélectionnez configuration laser. Allumez ensuite la lumière blanche et les lasers stead 592 nanomètres. Choisissez l’objectif 100 x et alignez le faisceau laser d’excitation avec un laser d’épuisement de 592 nanomètres.

Sélectionnez le module de configuration laser, désactivez le laser d’appauvrissement 592 et allumez le laser d’appauvrissement de 660 nanomètres. Placez la glissière sur la platine au-dessus de l’objectif. Mettez au point les cellules liées à la région bicouche délimitée à l’aide de la lampe à lumière blanche et des oculaires.

Revenez ensuite à l’onglet d’acquisition directement à droite de l’onglet de configuration. Cliquez sur l’onglet de commutation vers la lumière blanche, puis allumez ce module et faites glisser la ligne laser d’excitation sur la longueur d’onde appropriée. Après avoir sélectionné le détecteur souhaité et réglé la plage de détection, cliquez sur le bouton séquentiel dans la barre d’outils d’acquisition de gauche pour afficher la boîte de dialogue de balayage séquentiel en bas de la barre d’outils de gauche.

Cela permet à l’utilisateur d’ajouter plusieurs séquences, chacune avec un faisceau d’excitation différent pour une couleur différente. Cliquez entre les images, puis définissez le détecteur de fréquence d’excitation et la plage de détection pour chaque couleur supplémentaire. Une fois tous les paramètres optimisés, appuyez sur Démarrer pour commencer le processus d’acquisition.

L’image tricolore stable de la synapse des cellules NK sur une bicouche lipidique planaire soutenue par du verre montre que l’anticorps anti-CD 16 montré en rouge s’accumule sur la bicouche lipidique, déclenchant la formation de l’actine F, et la polarisation et la pénétration de la perforine montrées en bleu à travers le maillage de l’actine f au niveau du panneau focal. En utilisant cette approche combinée, on peut observer proprement les micro-amas d’anti-CD 16 marqués par fluorescence dans la bicouche lipidique supportée par du verre, qui reflète directement l’agrégation de CD 16 sur la cellule NK. Par rapport à l’image confocale conventionnelle, la structure en anneau de l’amas central de CD 16 est plus facilement discernée dans l’image stable en raison de la fluorescence ambiante appauvrie.

De plus, l’ultrastructure du cytosquelette d’actine est observée avec une résolution considérablement améliorée. Conformément aux observations précédentes, les granules lytiques positifs à la périne sont positionnés sur des régions de faible densité d’actine F. Dans l’image au lieu de cela, un détail crucial qui est la plupart du temps perdu dans l’image confocale Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée environ quatre heures si elle est bien faite tout en la parcourant.

Il est important de ne pas oublier de garder votre échantillon désoxygéné en déplaçant à plusieurs reprises l’oxygène avec de l’argonne, et lors de l’assemblage de la chambre, en plaçant rapidement la lamelle sur votre échantillon et en l’immergeant dans la solution du tubage.