Transfection, sélection et Colony-cueillette des induite par l'homme Cellules souches pluripotentes TALEN ciblées avec un gène de la GFP dans le AAVS1 Safe Harbor

L’objectif global de cette procédure est de générer un isolat AA par rapport à une cellule souche pluripotente inductible ciblée ou des clones IPSC exprimant la GFP. Ceci est accompli en délivrant d’abord un AAV une griffe et un A VS un C-A-G-E-G-F-P plasmides donneurs efficacement dans les IPC par affection nucléologique. Dans la deuxième étape, les cellules ciblées A a vs one sont sélectionnées par la mycine pure sur des cellules nourricières embryonnaires de souris.

Ensuite, les clones ciblés individuels exprimant une GFP A vs un sont prélevés dans une plaque à 96 puits recouverte de matrigel. Dans la dernière étape, les clones A A VS ONE G-F-P-I-P-S-C sont étendus avec E huit techniques de culture IPSC moyennes et standard. En fin de compte, la microscopie d’immunofluorescence et la cytométrie en flux sont utilisées pour montrer l’expression uniforme et robuste de la GFP dans les clones IPSC humains AA VS ciblés.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de sélection des colonies impliquent une micro-dissection de clones ciblés à l’aide d’outils spéciaux de sélection de colonies au microscope, ce qui est difficile à apprendre lors de l’instruction côte à côte. Commencez par laver les cultures IPSC une fois chacune avec du PBS. Ajoutez ensuite un millilitre de réactif de dissociation cellulaire douce à 37 degrés Celsius dans chaque puits et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes lorsque plus de 50 % des cellules se sont dissociées du récipient de culture.

Utilisez une pipette P 1000 pour perturber mécaniquement les amas de cellules restants ou les cellules attachées. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu E eight dans chaque puits et utilisez une pipette de 10 millilitres pour désagréger davantage les cultures en suspensions unicellulaires. Maintenant, regroupez les cellules récoltées dans un tube conique de 15 millilitres et faites-les tourner.

Mettez à nouveau la pastille en suspension dans une quantité minimale de E huit milieu pour le comptage. Ensuite, après avoir confirmé la viabilité des cultures par exclusion trian blue, ainsi que leur dissociation suffisante, 3 millions de cellules ont été transférées dans chacun des deux tubes coniques de 15 millilitres pendant que les cellules de centrifugation réglaient le système d’électroporation sur le programme spécifique de type de cellule pour la lignée de cellules souches embryonnaires humaines H nine. Ajoutez ensuite 10 microgrammes du donneur de recombinaison homologue seul à une pastille pour l’échantillon de contrôle et 10 microgrammes du plasmide du donneur de recombinaison homologue, ainsi que cinq microgrammes de chaque plasmide de talon pour l’échantillon expérimental.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de transfection complète de cellules primaires P à température ambiante à chacune des pastilles de contrôle et expérimentales et remettez les cellules en suspension. Transférez les échantillons dans des cuvettes individuelles, puis mangez les échantillons immédiatement après la transfection. Ajoutez 500 microlitres de milieu à température ambiante E huit à chaque vétérinaire Q, puis transférez les échantillons IPSC transfectés goutte à goutte dans des boîtes individuelles de 10 centimètres contenant quatre fibroblastes embryonnaires de souris DR Avant de choisir les colonies, co-enseignez bien d’une plaque de 96 puits avec 50 microlitres de solution de matrice de membrane basale, puis stockez la plaque pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain matin.

Lorsque la plaque a atteint la température ambiante, aspirez l’excès de solution et chargez chaque puits avec 100 microlitres de milieu E huit complété par 10 micromolaires Y 2 7 6 3 2. Ensuite, placez un microscope inversé dans une enceinte de sécurité biologique et stérilisez-le avec une légère pulvérisation d’éthanol à 70 %. Placez ensuite une pipette de pâturage en verre sur un bec Bunsen pour créer un outil de cueillette de colonie avec un petit crochet à l’extrémité après stérilisation avec de l’éthanol à 70 %.

Placez le crochet dans le capot pour qu’il sèche puis placez la culture IPSE sur la platine du microscope pour prélever les clones. Localisez une colonie appropriée sous un faible grossissement et utilisez l’outil de cueillette de colonie pour la tracer et la couper en quartiers. Ensuite, grattez doucement la colonie coupée en quartiers du récipient de culture et utilisez une pipette P 200 réglée à environ 30 microlitres pour recueillir les IPC flottant librement, en plaquant les cellules directement sur la matrice de la membrane basale.

Au fur et à mesure de la récolte, les IPC doivent se fixer dans les deux à quatre heures suivant le placage. Enfin, incubez les colonies cueillies pendant la nuit à 37 degrés Celsius et rafraîchissez les cellules avec un milieu E huit complet le lendemain matin. Il est important de ne transfecter que des CSP I de haute qualité tout au long de l’expérience.

Les cultures IPSC doivent contenir principalement des colonies distinctes portant une morphologie de pavé comme les cellules observées ici et les cellules différenciées ne doivent pas dépasser 10 % de la culture, la capacité de transfection des IPC peut être évaluée et optimisée à l’aide du petit vecteur PAX GFP car la transfection avec PAX GFP représente généralement l’efficacité maximale réalisable en raison de sa petite taille. L’expression transitoire d’un intel A VS un C-A-G-E-G-F-P et des IPC transfectées atteint un pic 48 à 72 heures après la transfection, ce qui peut être confirmé avec une petite portion de cellules transfectées par cytométrie en flux. L’efficacité de la transfection peut varier considérablement.

Même dans les expériences avec une fraction positive de la GFP n’est que de 10 %, les clones individuels présentant une fluorescence uniforme devraient être suffisamment grands pour la cueillette en colonie après sélection de mycine pure. De plus, une fois dans le format du puits 96, les clones IPSC ciblés élargis devraient présenter une expression stable et uniforme de la GFP. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transfecter efficacement les CSP I par l’affection nucléaire et de la façon d’isoler AV une sphère de sécurité.

Clonage IPSE ciblé à l’aide d’outils de cueillette de colonies.