Name: Transfection, sélection et Colony-cueillette des induite par lhomme Cellules souches pluripotentes TALEN ciblées avec un gène de la GFP dans le AAVS1 Safe Harbor (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Apprenez l'édition génique TALEN au locus AAVS1 dans des iPS humaines pour intégrer un transgène GFP. Cette méthode permet de générer des clones stables avec expression uniforme pour la recherche en biologie cellulaire.

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Cette recherche a été financée par le Fonds commun des NIH et le programme de recherche intra-muros de l’Institut national de l’arthrite, de l’appareil locomoteur et des maladies de la peau.

1. Préparation de la membrane basale Matrix et Revêtement de Plasticware <ol><li> Placez le congelé membrane basale matrice stocks de -20 ° C sur de la glace et décongeler une nuit à 4 ° C. </li><li> Après décongélation, la pipette des parties aliquotes de 2 mg matrice de membrane basale dans des tubes Eppendorf pré-réfrigérés. Stocker ces à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Pour préparer des plaques de matrice revêtu la membrane basale, dégeler une aliquote sur la glace jusqu&#39;à ce que le dernier morceau de glace dans les disparaît tube Eppendorf (généralement dans ~ 2 h). </li><li> Après décongélation, ajouter matrice de membrane basale de 12 ml de froid (4 ° C) du milieu DMEM / F12 pour faire une solution de revêtement de la matrice de membrane basale. </li><li> Ajouter la solution de matrice de membrane basale dans le récipient de culture approprié. Pour une plaque à 6 puits, distribuer 1 ml par puits. Agiter la plaque pour se assurer que la solution de la matrice de la membrane basale couvre complètement chaque puits. </li><li> Parafilm sceller la membrane basale matrice plaque revêtue / plat, et incuber à room température pendant 1 heure avant utilisation. Alternativement, plaques de matrice revêtu de la membrane basale du magasin / plats à 4 ° C et utiliser dans les 2 semaines de revêtement. REMARQUE: Ajout frais de DMEM / F12 pour la membrane basale matrice plaque revêtue / plat pour éviter le dessèchement. Avant d&#39;utiliser 4 ° C membrane basale stockée matrice plaque revêtue / plat, placez-le dans une enceinte de sécurité biologique et de lui permettre de revenir à la température ambiante pendant au moins 30 min. </li><li> Aspirer matrice de membrane basale complètement avant l&#39;addition de milieu et de cellules. </li></ol> 2. Préparation du milieu E8 <ol><li> Préparer un milieu de culture en décongelant E8 E8 supplément pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Retirer 10 ml de E8 milieu de base de la 500 ml stock et le jeter. </li><li> Pipeter l&#39;ensemble flacon de 10 ml de supplément E8 directement dans 490 ml de milieu de base E8. Avez moyenne E8 complète pas chaud dans un bain-marie à 37 ° C, que les fluctuations de température répétées peuvent dégrader le bFGF dans l&#39;achèvementmoyenne te E8. </li><li> Utilisez milieu complet E8 dans les 2 semaines de plus du supplément. </li></ol> 3. Le dégel des CSPi <ol><li> Retirer un flacon de CSPi congelés de l&#39;azote liquide et le placer sur la glace sèche. </li><li> Décongeler rapidement le flacon dans un bain d&#39;eau à 37 ° C; agiter le flacon dans le bain d&#39;eau jusqu&#39;à ce que seule une infime fragment de restes de glace. </li><li> Vaporisez le flacon avec 70% d&#39;éthanol et le transfert à une enceinte de sécurité biologique. </li><li> Ajouter 1 ml de la température ambiante, goutte à goutte E8 milieu directement dans le flacon. </li><li> Utilisation d&#39;une pipette 2 ml, goutte à goutte de transférer la suspension de cellules dans 9 ml de milieu E8 dans un tube conique de 15 ml. Agiter le tube fréquemment pour se assurer que les cellules et le milieu bien mélanger rapidement. </li><li> Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans un volume approprié de E8 supplémenté avec 10 pM de Y-27632. </li><li> Ajouter les cellules à un nombre approprié de sous-sol membrane matrice puits revêtus, et placer dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur nuit. Il est recommandé à l&#39;assiette au moins 0,2 x 10 6 iPSC par puits d&#39;une plaque à 6 puits pour permettre la récupération rapide après décongélation. </li></ol> 4. Maintenance et repiquage systématique des CSPi <ol><li> Actualiser moyenne quotidienne E8. </li><li> Surveiller la morphologie et la confluence de cellules avec un microscope inversé. CSPi de haute qualité dans les colonies grandissent plats avec des aréoles distinctes; colonies individuelles possèdent une apparence &quot;pavée-like&quot;. </li><li> Passage des cellules CISP quand ils atteignent ~ 70% de confluence. </li><li> Préparer une solution EDTA de passages en ajoutant 0,9 g de NaCl et 500 pi d&#39;EDTA 0,5 M à 500 ml DPBS. Mélangez bien pour dissoudre NaCl, et le filtre à vide à stériliser. Chauffer une partie aliquote de la solution de passages dans un bain d&#39;eau à 37 ° avant le repiquage. </li><li> Au passage, aspirer passé milieu de culture et laver les cellules une fois avec un volume égal de pas chaudssaging solution. Aspirer et pipette assez EDTA solution de passages pour enrober les cellules (1 ml par puits d&#39;une plaque à 6 puits). </li><li> Placez les cellules sous un microscope inversé et observer les colonies iPSC. L&#39;apparition de trous dans les colonies et des frontières soulevées devrait devenir apparente dans les 2-5 min. </li><li> Aspirer soigneusement la solution EDTA de passages. </li><li> En utilisant une pipette de 10 ml, passer 4 ml de milieu E8 (si vous utilisez une plaque de 6 puits) sous haute pression directement dans chaque puits pour être repiquées. </li><li> Recueillir les touffes iPSC, et divisée en un nombre approprié de puits selon le rapport de division de 1: 8 à 1:12. Ne pas trop-pipette, que la désagrégation des amas de cellules entraînera faible viabilité. </li><li> Placer la plaque dans un incubateur, et basculer la plaque de va-et-vient et côte à côte plusieurs fois pour disperser les cellules. </li></ol> 5. Préparation du MEF et CSPi pour Tansfection <ol><li> 48 heures avant la transfection, CSPi de passage à ~ 1: 6 en quatre ou plusieurs puits d&#39;une matrice revêtu plaque de 6 puits membrane basale, de sorte qu&#39;ils seront 70% de confluence dans deux jours. </li><li> Le lendemain, décongeler DR4 MEF MEF dans le milieu constitué de DMEM (glucose élevé) complété avec 10% de FBS et 1x MEM-NEAA. </li><li> Plate DR4 MEF en deux plats de 10 cm à 2 x 10 ~ 4 cellules / cm 2 et incuber une nuit à 37 ° C. </li><li> Le jour de la transfection, changer MEF à E8 milieu supplémenté avec 10 uM Y-27632 30 min avant d&#39;effectuer la transfection sur iPSCs. </li><li> Facultatif: Si l&#39;analyse de cytométrie en flux de post-transfection CSPi est désiré, retirer une matrice-plaque revêtue de la membrane basale de 4 ° C et le lieu à la température ambiante. </li><li> Facultatif: 4 h avant la transfection, compléter pré-transfection de la culture avec COPSi Y-27632 à la concentration finale de 10 uM. </li></ol> 6. brise-cellule de dissociation de traitement réactif Ae transfection de CSPi l&#39;aide d&#39;un système d&#39;électroporation <ol><li> Retirer P3 solution de transfection de cellules primaires de 4 ° C et lui permettre de revenir à la température ambiante pendant ~ 30 min. Ajouter la totalité du supplément de 100 ul de la solution de transfection avant utilisation. </li><li> Douce et chaude cellules réactif de dissociation dans un bain d&#39;eau à 37 C °. </li><li> Obtenir AAVS1 TALENs (PZT-AAVS1-L1 et PZT-AAVS1-R1) et AAVS1-CAG-EGFP donateurs de -20 ° C. </li><li> Retirer CSPi de l&#39;incubateur et laver une fois avec du DPBS. </li><li> Ajouter 1 ml de douce-cellulaire réactif de dissociation par puits, et incuber CSPi à 37 ° C pendant 5 minutes, ou jusqu&#39;à ce que plus de 50% des cellules ont dissocié du récipient de culture. </li><li> Introduire à la pipette les cellules de haut en bas à quelques reprises à l&#39;aide d&#39;une pipette de p1000 de dissocier toutes les cellules restantes de la cuve de culture, et de briser les mottes iPSC. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu E8 à chaque puits, et pipette de haut en bas plusieurs fois en utilisant une pipette de 10 ml à Fürther désagréger amas de cellules en cellules individuelles NOTE: L&#39;efficacité de transfection diminue significativement si des agrégats cellulaires ne sont pas suffisamment désagrégées. </li><li> Recueillir iPSCs dans un tube conique de 15 ml, et centrifuger à 100 g pendant 3 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre les cellules dans une quantité minimale de milieu E8. </li><li> Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre après application d&#39;un colorant vital tel que 0,4% de bleu trypan. Veiller à ce que les cellules sont suffisamment dissociées en comptant (1-3 cellules par &quot;bouquet&quot;). </li><li> Distribuer 3 x 10 6 cellules dans chacun des deux tubes coniques de 15 ml, et centrifuger à nouveau à 100 g pendant 3 min. NOTE: centrifugation à basse vitesse réduit le stress cellulaire et permet facilement remise en suspension des CSPi avant électroporation. </li><li> Réglez le système d&#39;électroporation au programme spécifique de type cellulaire pour la embryonnaires lignée de cellules souches humaines H9 (Programme CB-150). </li><li> Après centrifugation, aspirer le surnageant de la cell pellets. Pour une pastille, ajouter 10 ug du donneur de RH comme échantillon témoin. Pour ajouter l&#39;autre pastille 10 pg du donneur d&#39;HR, avec 5 pg de chaque TALEN (PZT-AAVS1 et PZT-L1-R1-AAVS1) comme échantillon expérimental. </li><li> Remettre en suspension chaque culot cellulaire dans 100 pi de solution de transfection de cellules primaires P3, et la transfère dans une cuvette. </li><li> Effectuer la transfection et ajouter immédiatement 500 ul de milieu de E8 de la température ambiante à chaque cuvette. </li><li> Transférer le CSPi goutte à goutte transfectées à une boîte de 10 cm contenant MEF DR4 préparés à l&#39;étape 5.4. </li><li> Facultatif: ajouter quelques gouttes de chaque expérience dans un puits d&#39;une matrice revêtue plaque à 6 puits membrane basale si ANALYSES cytométrie de flux de l&#39;efficacité de transfection est souhaitée. </li><li> Répétez les étapes 6.15 à 6.17 pour finir les deux échantillons. Le lendemain, laver les cellules avec du DPBS deux fois et basculer milieu de culture pour NutriStem, qui semble soutenir la culture iPSC sur les départs mieux que E8. </li><li> Transient pics d&#39;expression de EGFP dans les 48 à 72 heures après la transfection; évaluer l&#39;efficacité de transfection comme vous le souhaitez. </li></ol> 7. puromycine Sélection des CSPi ciblés <ol><li> Début sélection puromycine 72 heures après transfection lorsque les CSPi atteignent 70% de confluence. </li><li> Pour NCRM5 CSPi, commencer la sélection de la puromycine à 0,5 pg / ml de puromycine (1/2 de la dose complète) dilué dans un milieu de culture NutriStem. La concentration optimale de la puromycine peut varier de 0,25 à 1 ug / mIL pour certaines lignes iPSC. </li><li> CSPi de la culture dans NutriStem + 0,5 pg / ml de puromycine pendant 3 jours, le milieu rafraîchissantes quotidienne. </li><li> Après 3 jours, augmenter la concentration de la puromycine à 1 ug / ml. </li><li> CSPi de Culture de moins de 1 ug / ml de sélection puromycine pendant 7-8 jours, ou jusqu&#39;à colonies distinctes apparaissent assez grand pour la cueillette colonie. </li></ol> 8. prélèvement de colonie et expansion des CSPi ciblées <ol><li> Utilisez membrane basalematrice pour revêtir une plaque de 96 puits en distribuant 50 ul d&#39;une solution de revêtement de la matrice de membrane basale (2 mg matrice de membrane basale dilué dans 12 ml de DMEM / F12) dans chaque puits. Conservez la plaque à 4 ° C pendant la nuit avant de l&#39;utiliser. </li><li> Après avoir laissé la plaque de matrice revêtu membrane basale à venir à la température ambiante, aspirer la matrice de la membrane basale et distribuer 100 pi E8 complété avec 10 uM Y-27632 dans chaque puits. </li><li> Placez un microscope inversé dans une enceinte de sécurité biologique, et vaporiser légèrement avec 70% EtOH à stériliser. </li><li> Tirez une pipette Pasteur en verre au-dessus d&#39;un bec Bunsen pour obtenir un outil colonie cueillette idéal qui a un «crochet» minuscule à la pointe. Stériliser avec EtOH à 70%, et le placer dans la hotte pour sécher. </li><li> Retirer le plat contenant colonies iPSC ciblées de l&#39;incubateur, et la placer dans la hotte sous le microscope. </li><li> Choisissez CSPi en traçant un cercle autour de la frontière de la colonie avec l&#39;outil de la colonie-picking.</li><li> Utilisez le «crochet» de l&#39;outil colonie-cueillette à gratter délicatement et retirez la colonie iPSC de la surface de la plaque. Pour les grandes colonies, dessinant un X avec l&#39;outil de la colonie-picking à la colonie trimestre facilitera la croissance des cellules après re-placage. </li><li> Une fois amas de cellules sont détachées et flottant librement, utiliser une pipette de p200 mis à ~ 30 pi de recueillir les CSPi. cellules de la plaque directement dans la plaque à 96 puits. </li><li> En option: utiliser une pipette de p20 mis à ~ 5 pi de recueillir les CSPi dans un tube Eppendorf, puis ajouter 50 ul douce cellules réactif de dissociation à digérer pendant 5 min à 37 ° C. Après digestion, ajouter 500 pi de milieu E8 dans le tube Eppendorf pour diluer le réactif de dissociation douce cellules et centrifuger les cellules à 200 xg dans une microcentrifugeuse de table standard pour 5 min. Puis aspirer plus du milieu et de laisser ~ 30 pi Pour resuspendre et transférer les cellules dans la plaque 96 puits. NOTE: Ceapproche facilitera la dissociation de la touffe de la cellule et l&#39;expansion rapide de colonie ramassé. </li><li> Continuer colonie cueillette jusqu&#39;à ce qu&#39;un nombre suffisant de colonies iPSC ont été collectées (environ 20 à 30 colonies par expérience est recommandé). </li><li> Après prélèvement de colonie, placer la plaque 96 puits dans un incubateur pendant la nuit. Rafraîchir avec un milieu complet de E8 le lendemain, et la culture jusqu&#39;à ~ 70% de confluence. </li><li> cellules de passage de la 96 puits dans un 24 puits, puis dans un 6 puits, comme décrit dans les étapes 4.5 à 4.10. NOTE: les volumes de solution d&#39;EDTA et E8 milieu devraient être proportionnellement réduite lors de l&#39;utilisation de plus petites que les puits d&#39;une plaque à 6 puits. </li><li> Évaluer ciblage succès en jonction PCR et l&#39;analyse par transfert de Southern pour confirmer l&#39;intégration de la cassette ciblée et l&#39;absence de vecteurs insérées au hasard 16. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

Les étapes les plus critiques pour la génération réussie de AAVS1 Coffre-port ciblées CSPi humaines sont: (1) délivrant efficacement Talen et donateurs plasmides dans CSPi par transfection; (2) optimiser la dissociation des CSPi dans des cellules individuelles avant la transfection et le placage densité après transfection; (3) l&#39;optimisation dose et l&#39;heure de la drogue sélection basée sur la croissance de la ligne iPSC; (4) disséquant soigneusement et choisir colonies ciblées et le transfert à la nouvelle plaqu...

La possibilité de reprogrammer des cellules somatiques humaines en cellules souches pluripotentes souches embryonnaires cellulaires comme induites (CSPi) a été découvert par Takahashi et al. En 2007 1. Fibroblastes dermiques humaines transduites avec rétrovirus exprimant quatre facteurs de transcription (Le Yamanaka soi-surnommé facteurs Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, et Klf4) ont été montrés être très similaire à des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) en fonction de la morphologie, la prolifération, l&#39;expression du gène, et l&#39;état épigénétique; surtout, iPSCs sont également capables de se différencier en cellules des trois couches germinales 1. La capacité potentielle et la différenciation de prolifération des CSPi les rend très attractifs outils; par reprogrammation des cellules provenant de patients souffrant de maladies spécifiques, iPSCs peuvent être utilisés à la fois comme systèmes de modèle in vitro de la maladie et en tant qu&#39;agents thérapeutiques potentiels. Pour ce dernier objectif, plusieurs questions doivent être réglées avant que le plein potentiel de CSPidans un cadre clinique peut être réalisé; le potentiel tumorigène des CSEh et CSPi, l&#39;utilisation de dérivés xénogéniques lors de la reprogrammation et l&#39;entretien des cellules cultivées in vitro, et la nécessité de suivre les cellules transplantées in vivo sont tous les obstacles cruciaux à l&#39;application clinique des cellules souches pluripotentes (Commenté par Hentze et au. 2). Une solution idéale pour la nécessité pour le suivi des cellules différenciées post-transplantation impliquerait un marqueur visuellement détectable qui résiste taire et panachées indépendamment de l&#39;application. Expression forte et soutenue de transgènes intégrés est plus facilement réalisable lorsque l&#39;ADN exogène est introduit dans Coffre-port loci; ce est-à emplacements génomiques qui permettent la transcription suffisante d&#39;un vecteur intégré en même temps l&#39;atténuation des perturbations de l&#39;expression dans trois gènes voisins. Un tel site qui a été très bien caractérisé depuis sa découverte est le virus intégr adéno-associésite ation 1 (AAVS1), dans le premier intron de la protéine phosphatase une sous-unité régulatrice 12C (PPP1R12C) gène. Ce lieu a été démontré non seulement pour permettre l&#39;expression soutenue et robuste de transgènes intégrés dans le temps étendu dans la culture et dans la différenciation in vitro 3, mais aussi pour protéger les gènes de la perturbation de la transcription 4 entourant; les deux éléments sont considérées comme étant dues à la présence d&#39;éléments d&#39;isolateur chromatine endogènes flanquant le site de AAVS1 5. Les progrès dans les outils d&#39;ingénierie des génomes plus juste de la dernière décennie ont grandement facilité la facilité et l&#39;efficacité avec lesquelles les manipulations génétiques dans ne importe quel type de cellule peuvent être atteints. Bien que les expériences réussies début invoqués excessivement faibles niveaux de recombinaison homologue endogène (HR) avec un donneur présenter à atteindre ciblage de gène dans les CES 6,7, l&#39;utilisation des nucléases spécifiques au site, tels que les nucléases à doigts de zinc (de ZFN), qui signitivement induire la recombinaison homologue grâce à la génération d&#39;une rupture d&#39;ADN double brin a considérablement augmenté l&#39;efficacité de ces expériences 8,9. La réorientation des deux transcription activateur comme effecteurs (contes) de plantes pathogène Xanthomonas genres et les cluster régulièrement espacées répétitions palindromiques courts procaryotes (CRISPR) / système Cas9 dans efficaces nucléases de créateurs propres à chaque site a fait le ciblage de gènes dans les cellules souches pluripotentes un accessible et méthodologie possible 10-13. Un article récent décrit une méthode efficace pour l&#39;intégration stable d&#39;une cassette de rapporteur fluorescent vert dans le AAVS1 Coffre-port locus CSPi humaines à l&#39;aide de nucléases TALE (Talens) 14. Ces CSPi ciblées ont maintenu leur fluorescence même après la différenciation dirigé vers les cardiomyocytes et la transplantation dans un modèle de souris de l&#39;infarctus du myocarde (IM), fournissant des preuves solides pour l&#39;utilité de cettede manière stable des cellules souches pluripotentes 14 fluorescent. Pour obtenir des colonies cibles, un procédé de piégeage de gènes a été utilisé dans lequel un épissage accepteur (SA), une séquence de peptide de l&#39;auto-clivage 2A place la puromycine N-acétyl-transférase (PAC) gène sous le contrôle du promoteur PPP1R12C endogène; Ainsi, seules iPSCs qui ont incorporé le donneur d&#39;ADN au locus AAVS1 expriment PAC, les rendant sélectionnable sur la base de la résistance à la puromycine; (Figure 1, 15). Ce protocole détaille les procédures de générer AAVS1-GFP CSPi signalé dans le récent article 14, y compris le processus de transfection CSPi avec TALENs et un donneur de 9,8 kb pour intégrer un fragment d&#39;ADN de 4,2 kb dans le locus AAVS1 Coffre-port, la sélection CSPi basé sur puromycine-résistance, et les colonies de cueillette pour l&#39;expansion clonale. Les techniques décrites ici peuvent être appliqués à de nombreuses expériences d&#39;ingénierie du génome.

<table><tbody><tr><td>Matrigel à facteur de croissance réduit (GFR) Matrice de membrane basale, *sans LDEV, 10 ml</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Stocker à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td>Stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Well Plaques</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>A1517001</td><td>Stockez le milieu basal à 4 &deg ;C. Stockez le supplément à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorhydrate</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Conserver à température ambiante. Une fois dissous dans H2O, stockez-le à -20 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Boîte de culture traitée TC</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>DR4 MEF 2M IRR - Academic</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6204G</td><td>Stocker dans de l’azote liquide.</td></tr><tr><td>DMEM, hyperglycémie, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11995-040</td><td>Stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin défini, origine américaine</td><td>HyClone</td><td>SH30070.03</td><td>Se conserve à -20 &deg ;C. Décongélation à 4 &deg ; C pendant la nuit et aliquote. Stocker les aliquotes à -20 &deg ; C jusqu’à ce que nécessaire.</td></tr><tr><td>Solution d’acides aminés non essentiels MEM (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Stocker à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>Unité 4D-Nucleofector Core&nbsp ;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001B</td><td>fait partie du système d’électroporation</td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X unité&nbsp ;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001X</td><td>fait partie du système d’électroporation</td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (24 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td>À votre arrivée, retirez la solution de cellule primaire et complétez-la et rangez-la à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Se conserver à -20 °C et décongeler pendant la nuit à 4 °C C et réchauffer une aliquote dans un 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation.</td></tr><tr><td>NutriStem XF/FF Culture Medium</td><td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td>Conserver à -20 °C et décongeler pendant la nuit à 4 °C C</td></tr><tr><td>AAVS1 TALENs (pZT-AAVS1-L1 et pZT-AAVS1-R1)</td><td>Addgene</td><td>52637 et 52638</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>AAVS1-CAG-EGFP Donneur de recombinaison homologue</td><td>Addgene</td><td>22212</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorhydrate de puromycine</td> Life <td>Technologies</td><td>A11138-03</td><td>Stocker à -20 &deg ;C. Préparer des aliquotes de travail de 1 mg/ml dans ddH2O.</td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur jetables en verre borosilicaté</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR (réfrigéré), 120 V 60 Hz</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-004-521</td><td></td></tr><tr><td>TX-750 4 &times ; 750 ml Rotor à godet oscillant</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4 %</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

transfection, sélection et colony-cueillette des induite par l&#39;homme cellules souches pluripotentes talen ciblées avec un gène de la gfp dans le aavs1 safe harbor

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

L’ajout ciblé de transgènes peut fournir une expression génique persistante tout en contournant le silençage génique et la mutagenèse insertionnelle causée par l’intégration aléatoire médiée par un vecteur viral. Ce protocole décrit une plate-forme universelle et efficace d’addition ciblée de transgènes dans les iPSC humaines, basée sur l’utilisation de TALEN open source validés et d’un donneur de type piège à gènes pour délivrer les transgènes dans un locus de sphère de sécurité. Il est important de noter qu’une édition génomique efficace est limitée par l’efficacité de la distribution des vecteurs d’édition génomique. Par conséquent, ce protocole se concentre d’abord sur la préparation des iPSC pour la transfection afin d’atteindre une efficacité de livraison nucléaire élevée. Lorsque les iPSC sont dissociées en cellules uniques à l’aide d’un réactif de dissociation cellulaire douce et transfectées à l’aide d’un programme optimisé, >50 % des cellules peuvent être induites à absorber les grands vecteurs d’édition de gènes. Étant donné que le locus AAVS1 est situé dans l’intron d’un gène actif (PPP1R12C), un gène de résistance à la puromycine (PAC) lié à l’accepteur d’épissage (SA) a été utilisé pour sélectionner des iPSC ciblées tout en excluant les cellules aléatoires d’intégration uniquement et les cellules non transfectées. Cette stratégie augmente considérablement les chances d’obtenir des clones ciblés et peut également être utilisée dans d’autres expériences de ciblage génique actif. Deux semaines après la sélection de la puromycine à la dose ajustée pour la lignée iPSC spécifique, les clones sont prêts à être prélevés par dissection manuelle de grandes colonies isolées en petits morceaux qui sont transférés dans un milieu frais dans un puits plus petit pour une expansion plus poussée et un dépistage génétique et fonctionnel. On peut suivre ce protocole pour obtenir facilement plusieurs lignées d’iPSC rapporteures de GFP qui sont utiles pour l’imagerie in vivo et in vitro et l’isolement cellulaire.

Une visualisation du protocole est fourni à la figure 2, avec des périodes au cours de laquelle CSPi sont cultivées dans un milieu différent, mis en évidence par soit vert pour E8 ou bleu pour NutriStem. Il est important pour la transfection seulement CSPi de haute qualité; examiner les boîtes de culture tout au long de l&#39;entretien de routine et de vérifier que les cultures iPSC contiennent des colonies distinctes portant principalement une morphologie pavée comme (figure 3A); les c...

L’édition de gènes médiée par TALEN au locus AAVS1 permet l’ajout de transgènes à haute efficacité dans les iPSC humaines. Ce protocole décrit les procédures de préparation des CSPi pour l’administration de TALEN et du vecteur donneur, la transfection des CSPi, ainsi que la sélection et l’isolement des clones de CSPi afin de réaliser l’intégration ciblée d’un gène GFP pour générer des lignées rapporteures.

Transfection, sélection et Colony-cueillette des induite par l&#39;homme Cellules souches pluripotentes TALEN ciblées avec un gène de la GFP dans le AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

L'objectif général de cette procédure est de générer un isolat AA par rapport à un site refuge, afin d'obtenir des clones de cellules souches pluripotentes induites ciblées ou cellules IPS exprimant GFP. Ceci est réalisé en premier lieu par la livraison efficace, dans les cellules IPS, des plasmides donneurs AAVS1-TALEN et AAVS1-CAG-EGFP par nucléofection. Dans la deuxième étape, les cellules ciblées AA vs un sont sélectionnées par la puromycine sur des cellules nourricières embryonnaires murines.Ensuite, les clones individuels exprimant la GFP de AA VS un sont sélectionnés et transférés dans une plaque de 96 puits revêtue de Matrigel. À l'étape finale, les clones AA VS un G-F-P-I-P-S-C sont agrandis à l’aide du milieu E huit et de techniques standard de culture d’iPS. En définitive, la microscopie par immunofluorescence et la cytométrie en flux sont utilisées pour démontrer une expression uniforme et robuste de la GFP dans les clones d’iPS humaines ciblées AA VS un.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de prélèvement des colonies impliquent une microdissection de clones ciblés à l’aide d’outils spéciaux de prélèvement de colonies sous un microscope, ce qui est difficile à apprendre lors d’une instruction en parallèle. Commencez par laver les cultures d’iPS une fois avec du PBS. Ajoutez ensuite un millilitre de réactif de dissociation cellulaire doux à 37 degrés Celsius dans chaque puits et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes, lorsque plus de 50 % des cellules se sont dissociées du récipient de culture.Utilisez une pipette P1000 pour rompre mécaniquement les agrégats cellulaires résiduels ou les cellules adhérentes. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu E8 dans chaque puits et utilisez une pipette de 10 millilitres pour désagréger davantage les cultures en suspensions monocellulaires. Rassemblez maintenant les cellules récoltées dans un tube conique de 15 millilitres et centrifugez-les.Resuspendez le culot dans une quantité minimale de milieu E huit pour le dénombrement. Ensuite, après avoir confirmé la viabilité des cultures par exclusion du bleu de trypan, ainsi que leur dissociation suffisante, transférez 3 millions de cellules dans chacun des deux tubes coniques de 15 millilitres, puis, pendant que les cellules sont centrifugées, réglez le système d'électroporation sur le programme spécifique au type de cellule pour la lignée de cellules souches embryonnaires humaines H neuf. Ajoutez ensuite 10 microgrammes du donneur de recombinaison homologue seul à un culot pour l'échantillon témoin, et 10 microgrammes du plasmide donneur de recombinaison homologue, ainsi que cinq microgrammes de chaque plasmide talon, pour l'échantillon expérimental.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution de transfection primaire complète P trois à température ambiante à chaque culot témoin et expérimental et resuspendez les cellules. Transférez les échantillons dans des cuvettes individuelles, puis électroporez immédiatement les échantillons après la transfection. Ajoutez 500 microlitres de milieu E huit à température ambiante dans chaque cuvette, puis transférez les échantillons d'iPSCT transfectées goutte à goutte dans des boîtes individuelles de 10 centimètres contenant des fibroblastes embryonnaires de souris DR quatre. Avant de sélectionner les colonies, ensemencez chaque puits d'une plaque de 96 puits avec 50 microlitres de solution de matrice de membrane basale et conservez la plaque toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin,Lorsque la plaque a atteint la température ambiante, aspirez la solution en excès et ajoutez dans chaque puits 100 microlitres de milieu E huit complété avec 10 micromolaires de Y 2 7 6 3 2. Ensuite, placez un microscope inversé dans une cabine de sécurité biologique et stérilisez-le à l’aide d’un léger pulvérisation d’éthanol à 70 %. Puis, placez une pipette Pasteur en verre au-dessus d’un bec Bunsen afin de créer un outil de prélèvement de colonies comportant un minuscule crochet à son extrémité, après stérilisation à l’éthanol à 70 %.Placer le crochet dans la hotte pour le faire sécher, puis placer la culture d'IPSE sur la platine du microscope pour sélectionner les clones. Repérer une colonie appropriée en faible grossissement et utiliser l'outil de sélection de colonies pour la tracer et la diviser en quartiers. Ensuite, gratter délicatement la colonie divisée en quartiers depuis le récipient de culture et utiliser une pipette P200 réglée à environ 30 microlitres pour recueillir les IPC en suspension libre, en ensemencant directement les cellules sur la matrice de membrane basale.Au moment de leur récolte, les CIP doivent s'attacher dans un délai de deux à quatre heures après l'ensemencement. Incuber finalement les colonies sélectionnées toute la nuit à 37 degrés Celsius et renouveler le milieu des cellules avec le milieu E huit complet le lendemain matin. Il est important de transfecter uniquement des CIPS de haute qualité tout au long de l'expérience.Les cultures d'iPS doivent contenir principalement des colonies distinctes présentant une morphologie en pavé, comme les cellules illustrées ici, et les cellules différenciées ne doivent pas représenter plus de 10 % de la culture. La capacité de transfection des iPS peut être évaluée et optimisée à l’aide du petit vecteur GFP PAX, car la transfection avec GFP PAX représente généralement l’efficacité maximale réalisable en raison de sa petite taille. L’expression transitoire d’un A VS un C-A-G-E-G-F-P intel et des iPS transfectées atteint un pic entre 48 et 72 heures après la transfection, ce qui peut être confirmé à l’aide d’une petite portion de cellules transfectées par cytométrie en flux. L’efficacité de transfection peut varier considérablement.Même dans les expériences avec un A, la fraction positive pour GFP n'est que de 10 %. Les clones individuels présentant une fluorescence uniforme doivent être suffisamment grands pour permettre le prélèvement de colonies après sélection à la pureomycine. En outre, une fois mis en format 96 puits, les clones d’iPS ciblés et agrandis doivent exprimer de manière stable et uniforme la GFP. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment transfecter efficacement les iPS par nucléofection et comment isoler le site sûr AV1.Clones IPSE ciblés à l'aide d'outils de prélèvement de colonies.

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Biologie du développement

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Transfection, sélection et Colony-cueillette des induite par lhomme Cellules souches pluripotentes TALEN ciblées avec un gène de la GFP dans le AAVS1 Safe Harbor (Vidéo) | JoVE Journal

Transfection, sélection et Colony-cueillette des induite par l'homme Cellules souches pluripotentes TALEN ciblées avec un gène de la GFP dans le AAVS1 Safe Harbor

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