Name: Enquête mât cellules sécrétoires granulés; de biosynthèse dexocytose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse de l'exocytose des mastocytes utilisant un gène rapporteur fluorescent et l'imagerie confocale. Cette technique permet d'étudier le développement des granules sécrétoires et leur dynamique en temps réel.

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Nous remercions le Dr U. Ashery pour le don de NPY-mRFP ADNc. Nous remercions les Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, et Y. Zilberstein pour son aide précieuse à la microscopie et analyse d&#39;images. Nous remercions également le Dr Joseph Orly pour la lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation israélienne des sciences, fondée par l&#39;Académie israélienne des sciences (1139-1112 RS-E.).

1. Préparation de RBL Culture Cellulaire médias <ol><li> Mélanger 500 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco faible taux de glucose (DMEM) avec 56 ml de sérum de veau fœtal (cela fait 10% de FBS), puis ajoutez 5,5 ml de pénicilline streptomycine (ce qui rend ~ 1% PEST). </li><li> Filtrez les médias en utilisant 500-1000 ml Bottle-Top filtres à vide avec 0,22 um taille des pores et conserver à 4 ° C. </li></ol> 2. Culture de cellules RBL <ol><li> Cultiver les cellules RBL dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 ° C, dans des plaques ou flacons. Cellules RBL qui gagnent en plaques de 10 cm doivent être complétés par 10 ml de milieu et forment monocouche confluent de ~ 10 7 cellules / plaque. </li><li> Lorsque la couche cellulaire se approche de la confluence, Réensemencement la culture à une densité inférieure. <ol><li> Retirer le milieu de culture à partir de la plaque / fiole à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur stérile raccordée à vide. </li><li> Rincer la monocouche cellulaire avec préchauffé (37° C) 0,25% de trypsine / EDTA qui couvre l&#39;ensemble monocouche (le volume dépend de la taille de la plaque de culture / flacon; 2 ml pour 10 cm de plaque). Cela détacher les cellules. </li><li> Sinon, laver la monocouche cellulaire avec tampon phosphate salin (PBS), retirez le PBS et ajouter préchauffé (37 ° C) de la trypsine / EDTA. Cette étape détache les cellules plus rapidement. </li><li> Placer la plaque / fiole dans un incubateur à 37 ° C (pas plus de 10 min). </li><li> Inspectez les cellules sous le microscope optique pour vérifier se ils ont détaché. Si les cellules ne se détachent au bout de 10 min, appuyez doucement sur la plaque / flacon. </li><li> Ajouter moyen de la plaque de culture / flacon de suspendre les cellules (le volume du milieu doit être au moins 2 fois supérieur au volume de la solution de trypsine). </li><li> Pellet les cellules par centrifugation pendant 3 minutes à 200 g à 25 ° C. </li><li> Resuspendre les cellules dans un milieu. Diluer les cellules en 1h10 et épépiner dans une nouvelle boîte de culture. Incuber les cellules pendant 48 à 72 h, jusqu&#39;à ce qu&#39;ils REACh environ 90% de confluence. </li><li> Répétez la même procédure (section 2.2.1-2.2.8) pour un maximum de trois mois (30 passages). </li></ol></li></ol> 3. Préparation de transfection médias. <ol><li> Préparer une solution de 100 mM pH 7, solution 1 mM de Ca2 + et de la solution de l&#39;acétate 100 mM d&#39;acétate de Mg 2+ K Pipes. </li><li> Diluer la solution 100 mM de K Pipes à pH 7 en utilisant 20 mM de milieu DMEM, ajouter la solution de 1 mM de Ca 2+ de l&#39;acétate à une concentration finale de 10 uM et une solution 100 mM de Mg 2+ acétate à une concentration finale de 2 mM. </li><li> Peser potassium glutamate et l&#39;ajouter à la solution à une concentration finale de 128 mM, bien mélanger et maintenir à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. Gardez les solutions restantes (ie., K-Pipes, Ca 2+ acétate, Mg 2+ acétate) à -20 ° C. </li></ol> 4. Transfection de cellules RBL <ol><li> Retirer le milieu de culture à partir de la plaque / fiole au moyen d&#39;unpipette pasteur stérile connecté à vide. </li><li> Rincer la monocouche cellulaire avec préchauffé (37 ° C) de la trypsine / EDTA qui devrait couvrir l&#39;ensemble monocouche. Placer la plaque / fiole dans un incubateur à 37 ° C (pas plus de 10 min). Vérifiez si les cellules ont détaché en utilisant le microscope optique. </li><li> Ajouter moyen de la plaque de culture / flacon de suspendre les cellules (le volume du support doit être au moins de 2 plus grande et plus que le volume de la solution de trypsine). </li><li> Comptez le nombre de cellules en utilisant hémocytomètre. </li><li> Pellet 1,5 × 10 7 cellules par centrifugation pendant 3 minutes à 200 x g à 25 ° C. Jeter le surnageant et ajouter 280 ul de milieu de transfection. Transférer le mélange de réaction dans 4 mm cuvette. </li><li> Ajouter 20 pg de NPY-mRFP plasmide et soit 30 ug du contrôle plasmide vide ou un plasmide testé. Le volume final du mélange de réaction doit être de 300 ul. </li><li> Placer immédiatement sur de la glace pendant 10 min. Essuyer la cuvette de l&#39;eau résiduelle et procéder à une électroporation à 300 V pendant 9 ms. </li><li> Pour les mesures de l&#39;exocytose, Réensemencement les cellules immédiatement dans 24 des boîtes de culture tissulaire puits contenant 300 ul de milieu. Ajouter 8 ul du mélange de réaction (4 × 10 5 cellules) dans chaque puits. Ajouter cellules 4 × 10 5 non transfectées à des puits supplémentaires pour le contrôle. Préparer suffisamment de puits pour avoir au moins des puits en double pour chaque traitement pour chaque transfection. </li><li> Par microscopie laps de temps, immédiatement Réensemencement les cellules dans un système de lamelle chambre borosilicate 8 puits contenant 80 ul de milieu. Ajouter 1,5 pi de mélange réactionnel (7,5 × 10 4 cellules) pour chaque chambre. (Essayez d&#39;éviter d&#39;utiliser les chambres au bord de la lamelle, les chambres au centre de la lamelle sont plus faciles à l&#39;image). NOTE: Il est important, toutes les cellules de réponse de pas à un déclencheur et parfois la microscopie time-lapse est abrogée en raison de perte de concentration et de la dérive de la borosi de chambre 8 puitssystème de lamelle licate. Par conséquent, préparer au moins 8 chambres pour chaque traitement pour chaque transfection. </li><li> Pour sensibiliser les cellules pendant l&#39;activation médiée par FceRI, ajouter 1 ug / ml de DNP monoclonal de souris spécifique des IgE à la presse (incuber les cellules avec des IgE pendant au moins 2 h). </li><li> Après 18 à 24 h utiliser un microscope à fluorescence pour confirmer que les cellules expriment les plasmides. Les excitation et d&#39;émission des longueurs d&#39;onde de la fluorescence mRFP sont: Xex 584, Xem 607 nm. NPY-mRFP devrait apparaître dans des structures vésiculaires qui correspondent aux SG. Si le second gène d&#39;intérêt est fusionnée à un marqueur fluorescent utiliser un microscope à fluorescence pour confirmer la co-expression des deux plasmides dans les mêmes cellules. Par exemple, si le gène testé est fusionné à la GFP, Les longueurs d&#39;onde d&#39;excitation et d&#39;émission de fluorescence de la GFP sont: Xex 488, Xem 507 nm. La protéine GFP étiqueté devrait apparaître dans les mêmes cellules qui expriment NPY-mRFP. </li><li> Pour les mesures d&#39;exocytose procéder to étape 5 et pour la microscopie laps de temps, passez à l&#39;étape 6. </li></ol> 5. Mesure de NPY-mRFP exocytose <ol><li> Préparation du tampon Tyrode: <ol><li> Préparer une solution de 54 mM de KCl, 20 mM de MgCl2, 2,74 M de NaCl et 8 mM de NaH 2 PO 4 dans DDW. Bien mélanger et stocker à 4 ° C. Cette étape est la préparation de tampon 20x Tyrode. </li><li> Préparer une solution de Hepes 20 mM pH 7, 1,8 mM CaCl 2, 1 mg / ml de BSA, 5,6 mM de glucose et de 1 à 20 dilution de Tyrode 20x dans DDW et bien mélanger. Cette étape est la préparation de tampon 1x Tyrode. </li><li> Aliquoter le tampon 1x Tyrode et conserver à -20 ° C. Évitez congélation et décongélation répétée. </li></ol></li><li> Retirez le milieu de culture de la plaque à 24 puits et laver trois fois avec un tampon Tyrode. Préparer des cellules non stimulées en ajoutant un tampon Tyrode 200 pi aux puits témoins. </li><li> Préparez 10 ul / puits de réactif d&#39;activation concentré 20X [(par exemple, 1000 ng / ml DNP-BSA ou DNP-HSA (Ag), 200 uM de Ca 2+ ionophore (A23187 par exemple), et une combinaison de 20 uM ionophore Ca2 + et 1 000 nM 12-O- tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA)]. Si les réactifs sont conservés dans du DMSO, diluer les réactifs en concentration 20x dans le tampon de Tyrode contenant 1% de DMSO. Incuber à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Retirez les surnageants de chaque puits avec soin pour une plaque de 96 puits, placer sur la glace et éviter de la lumière. (Les surnageants contiennent le peptide chimérique NPY-mRFP qui a été libéré par les cellules). </li><li> Ajouter tampon Tyrode 200 pi contenant 0,5% de Triton X-100 à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 10 min. (Cette étape est importante pour la préparation de lysats de cellules qui contiennent le restant de NPY-mRFP qui n&#39;a pas été libéré par les cellules). Recueillir les lysats cellulaires et les transférer sur une plaque de 96 puits, placer sur la glace et éviter de la lumière. </li><li> Mesurer la fluorescence des surnageants cellulaires et des lysats cellulaires en utilisant un Déessrence lecteur de plaque, en utilisant un 590-, 20 nm de bande passante excitation filtre et 635-, 35 nm filtre bande passante d&#39;émission. </li><li> Calculer le pourcentage de NPY-mRFP publié: NOTE: La mesure de lecteur de fluorescence unités de fluorescence arbitraires (AFU). AFU valeurs dépendent de la machine et de sa sensibilité et de l&#39;efficacité de transfection. <ol><li> Réglez le autofluorescence des cellules RBL non transfectées comme vierges. Divisez la AFU de chaque surnageant à la fluorescence totale (AFU des surnageants + AFU du lysat correspondant) et multiplier par 100. </li></ol></li></ol> 6. Time-lapse microscopie d&#39;exocytose <ol><li> Graine 7,5 × 10 4 cellules de la / chambre transfectée dans un système de lamelle chambre borosilicate 8 puits. Après 18 à 24 h, éliminer le milieu de culture des chambres et laver trois fois avec un tampon Tyrode </li><li> Ajouter 72 pi de tampon Tyrode à chaque chambre. Diluer les réactifs d&#39;activation dans un tampon Tyrode à la concentration 10x. </li> &lt;li&gt; utiliser un microscope à fluorescence confocal équipé d&#39;une chambre chauffée (37 ° C) et CO 2 de commande (4,8%) et un objectif 40X ou 63X. Activer les systèmes de microscope: lampe au mercure, un ordinateur, et des lasers. Assurez-vous que la chambre est chauffée à la bonne température avant de commencer l&#39;expérience. </li><li> Placez la chambre dans la chambre chauffée et assurez-vous que la chambre est correctement installé et stable. </li><li> Allumez la lumière de fluorescence selon le fluorophore pertinentes et visualiser les cellules transfectées. Éteignez fluorescence fois une cellule d&#39;intérêt est dans le domaine afin de minimiser le blanchiment et la cytotoxicité. Il est important que ce champ contiendra environ 3.2 cellules transfectées. Les cellules transfectées doivent être bien répartis mais ne se touchant pas les uns les autres. </li><li> Réglez la puissance du laser (selon le microscope) pour minimiser le bruit et sursaturation ainsi que la toxicité, et régler le gain et le décalage de modifier le rapport signal sur bruit. Balayage rapide ouder à minimiser la durée d&#39;exposition au laser (moyenne de 2). </li><li> Ajuster la taille sténopé à un maximum, cela permet de diminuer la puissance du laser et de maintenir images porté pendant une longue période de temps. Si vous le souhaitez, définir les paramètres de la pile de Z à reconstruire l&#39;image en trois dimensions, ajuster la taille sténopé à 1 unité aérée (UA) qui donne le meilleur rapport signal sur bruit et acquérir balayage successives de tranches optique confocal à deux dimensions dans le z -axes avec des tranches optiques ≤0.7 um. </li><li> Réglez l&#39;intervalle de temps entre chaque acquisition de 15 à 30 secondes et la durée d&#39;acquisition totale de 15 min et commencer à acquérir des images. Après 5 minutes de pause acquisition de la série chronologique. Ajouter 8 pi de la gâchette 10x et continuer immédiatement l&#39;acquisition. </li><li> Enregistrer les images, effectuez déconvolution en utilisant un logiciel de déconvolution et de reconstruire les piles à images en trois dimensions et d&#39;un film en utilisant un logiciel Imaris. </li></ol><ol><li> Importer les données à partir des images de séries chronologiques déconvolués qui ont été obtenues par le microscope à fluorescence confocale à Imaris logiciel. Ce logiciel lit plus de 40 fichiers microscopie. Si le logiciel ne peut pas lire les fichiers; convertir les fichiers au format TIF et l&#39;importation. </li><li> Pour ajouter des points de temps à la fin d&#39;un ensemble de données ouverte appuyez sur Modifier -&gt; Ajouter des points de temps et d&#39;importer les nouveaux ensembles de données. </li><li> Créer surface du canal mRFP utilisant l&#39;option de l&#39;assistant de surface. Choisissez l&#39;algorithme par défaut. Choisissez le canal de NPY-mRFP. Marquez l&#39;option de lissage pour réduire le bruit. Pour éviter la perte de petits détails de réduire le niveau de détail de la zone à 0,05 um. </li><li> Réglez le seuil d&#39;intensité. Nouvelle surface grise se affiche. Allez dans &quot;Paramètres&quot; et changer le style de &quot;point central&quot; à &quot;Surface&quot;. </li><li> Allez à l&#39;onglet statistique dans les propriétés de l&#39;objet sélectionné, sélectionnez l&#39;onglet détaillée et la CUS de valeur spécifiqueh que l&#39;intensité de fluorescence, volume, etc. </li><li> Examiner les données et de confirmer que les valeurs sont compatibles avec les images. Par exemple, deux ou plus de granules adjacents peuvent être mesurés comme une plus grande granule. Pour quantifier la taille moyenne des granules diviser la taille des granules ont fusionné pour le nombre réel de granules. </li><li> Exporter les ensembles de données désirées vers des fichiers Excel et analyser les données. </li></ol> fa

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financier.

Nous décrivons une stratégie innovante qui combine la quantification des MCs exocytose et quatre (x, y, z, t) quantifications de dimension par imagerie de temps écoulé en trois dimensions des SG dans les cellules vivantes en utilisant un gène rapporteur pour l&#39;exocytose. Cette technique permet le dépistage des familles de protéines pour leur impact sur la fonction MC tels que SGS de surveillance à partir dès leur sortie de l&#39;appareil de Golgi travers leur maturation, l&#39;acquisition de la compétence de l&#39;e...

Mastocytes (MC) sont des cellules immunitaires qui sont les mieux connus pour leur implication dans des réactions allergiques et inflammatoires telles que l&#39;arthrite, l&#39;asthme, l&#39;oesophagite à éosinophiles, la dermatite chronique et choc anaphylactique 1,2 ainsi que d&#39;autres pathologies dont la maladie coronarienne et 3,5 le cancer 3,4. En outre, MCs jouent un rôle important dans l&#39;immunité innée et adaptative, tant en défense de l&#39;hôte contre les bactéries et les parasites et par la suppression de la réponse immunitaire, par exemple induire la tolérance 5,6 allogreffe. MC proviennent de la moelle osseuse, le développement du CD34 + / CD117 + cellules progénitrices pluripotentes 7. Engagé moelle osseuse MC progéniteurs sont libérés dans la circulation sanguine et migrent dans les tissus périphériques de localisation principalement dans les tissus conjonctifs et les surfaces épithéliales 8. Maturation et différenciation terminale sont finalement atteints sous l&#39;influence of cytokines au sein du milieu environnant de 8,9. MCs peuvent être activés par un allergène (antigène, Ag), dont la rencontre entraîné la production d&#39;immunoglobuline E (IgE) de type anticorps. La liaison d&#39;une telle IgE aux récepteurs FceRI de la MC, suivie par une reticulation de cellule IgE liée à une nouvelle exposition à la même Ag, conduit à l&#39;agrégation FceRI et l&#39;initiation d&#39;une cascade de signalisation qui aboutit à la dégranulation cellulaire [commentaire à 10,11] . MCs sont également activés, indépendamment des IgE, par neuropeptides 5,12, les toxines 13, bactérienne et antigènes viraux 14,15, un certain nombre de peptides chargés positivement collectivement dénommées sécrétagogues de base, cellules immunitaires et de cytokines 5,13,12,16 , 17. MCs sont également activés par beaucoup de leurs propres médiateurs libérés, qui amplifient encore la réponse inflammatoire. MCs sont emballés avec des granules sécrétoires (SGS) qui contiennent immunomédiateurs réglementaires, y compris des amines vasoactives telles que l&#39;histamine et de la sérotonine (chez les rongeurs), des protéoglycanes, des proteases telles que la tryptase et la chymase, facteur de croissance vasculaire endothéliale et de plusieurs cytokines et de chimiokines 8,9. Ces médiateurs sont &quot;prêt à aller&quot; et une fois MCs sont activées par un stimulus approprié, ces médiateurs sont libérés des cellules par exocytose régulée (de dégranulation) dans une affaire de secondes à quelques minutes 18,19. Cet événement initial est suivi de la synthèse de novo et la libération d&#39;un large éventail de substances biologiquement puissants, y compris les metabolites de l&#39;acide arachidonique, de multiples cytokines et de chimiokines 20,21,22. Libération de produits nouvellement synthétisés se produit indépendamment de presse SG. Collectivement, ces médiateurs initient précoce et la phase tardive réponses inflammatoires et allergiques. Par conséquent, la compréhension des mécanismes responsables de l&#39;activation et de la dégranulation MC sont deux imp théorique et cliniqueOrtance. La difficulté de manipuler génétiquement MCs primaires et de culture a entravé les tentatives pour élucider les mécanismes sous-jacents MC dégranulation qui sont encore mal résolus. Pour surmonter ce problème, nous avons développé un dosage à base rapporteur par co-transfection de la lignée cellulaire de la muqueuse de mât, rat leucémie basophiles (RBL) -2H3 (ci-après dénommé RBL) ou de moelle osseuse dérivés MCs (BMMCs) 30 avec un gène d&#39;intérêt et neuropeptide Y (NPY) fusionné à DP monomère (mRFP), en tant que journaliste de SG. NPY a déjà été démontré de récapituler le comportement des marqueurs de SG endogènes dans d&#39;autres systèmes. En outre, parce que mRFP fluorescence est insensible au pH, l&#39;expression de NPY-mRFP permet la visualisation des acides SG ainsi que l&#39;évaluation quantitative de l&#39;exocytose en utilisant des plaques à 96 puits et un lecteur de plaque à fluorescence. Nous avons montré que NPY-mRFP est livré à SGS acides de cellules RBL et BMMCs et est libérée par les cellulesd&#39;une manière réglementée aux côtés de la cargaison de SG endogène (ce est à dire, β-hexosaminidase et la sérotonine) 30, 32. Ce protocole fournit une méthodologie basée imagerie à haute résolution qui permet de criblage de gènes d&#39;intérêt pour leur phénotypique et fonctionnel incidence sur les caractéristiques de SG et la dégranulation dans des cellules RBL 32. Plus précisément, ce protocole permet un suivi en temps réel de MC SG et la quantification de leur zone de volume ou la taille, le nombre, la cinétique de l&#39;assemblage, leur mouvement le long du cytosquelette de la cellule et leur fusion ultime avec la membrane plasmatique dans des conditions différentes. Par exemple, la sensibilisation des cellules avec DNP-IgE spécifique et déclencher les cellules avec un Ag multivalent (DNP de l&#39;albumine de sérum conjugué) sous différentes perturbations (c.-à-knockdown de gènes d&#39;intérêt, sur l&#39;expression de gènes wt ou mutants, ou des manipulations pharmacologiques) et la comparaison aux cellules témoins.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046-500ML</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Soins de santé GE Sciences de la vie</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Technologies</td><td></td><td></td>de la vie</tr><tr><td>Membrane en acétate de cellulose, taille des pores 0,22&nbsp ; &mu ; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture traitées pour culture tissulaire Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA Solution (TE)</td><td>Life technologies</td><td>R001100</td><td>Warm in 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>TUYAUX sel dipotassique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de calcium hydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de magnésium tétrahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Sel de potassium de l’acide L-glutamique monohydraté (glutamate de potassium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes d’électroporation de 4 mm</td><td>projets de cellules</td><td>EP-104</td><td></td></tr><tr><td>GENE PULSER AVEC CONTRÔLEUR D’IMPULSIONS & CAPACITANCE</td><td>Bio rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verre de protection à chambre</td><td>Thermo scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>24 puits, fond plat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 plaques</td><td>de puits Sigma-Aldrich</td><td>CLS3367 ou CLS390</td><td></td>Lecteur</tr> de <tr><td>fluorescence de plaque à 96 puits - Infinite 200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionophore de calcium A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522</td><td>Eviter de l’exposition directe à</td></tr><tr><td>la lumière 12-O-tétradécanoyl-13-acétate (TPA)</td><td>Calbiochem</td><td>P3766</td><td></td></tr><tr><td>anti-DNP monoclonal Igma-Aldrich</td><td></td><td>D8406&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>DNP-BSA/ DNP-HAS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661</td><td>Epreuve de l’exposition directe à la lumière</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal fluorescent :</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Zeiss LSM 510</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 inversé</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Imaris</td><td>BITLANE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft exel ou Prism ou autres logiciels</td><td></td><td></td><td></td>d’analyse</tr><tr><td>Autre réactif :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>MERK</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>MERK</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium&nbsp ;</td><td>MERK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BDH Laboratories</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate monosodique&nbsp ;</td><td>MERK</td><td>5345</td><td></td></tr><tr><td>Eau</td><td></td><td></td><td></td> stérile</tr></tbody></table>

enquête mât cellules sécrétoires granulés; de biosynthèse d&#39;exocytose

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mastocytes (MC) sont des cellules sécrétoires du système immunitaire qui accomplissent leurs fonctions physiologiques et pathologiques en libérant des médiateurs allergiques, inflammatoires et immunorégulateurs préformés et nouvellement synthétisés. Les médiateurs de MCs affectent plusieurs tissus et organes aboutissant à des réactions allergiques et immunitaires. La synthèse, le stockage et la libération des médiateurs MC sont très réglementés. Les médiateurs préformés sont emballés dans des granules sécrétoires cytoplasmiques (SG) qui fusionnent avec la membrane plasmique et libèrent leur contenu par exocytose régulée. Nous présentons un protocole basé sur la co-expression d&#39;un gène d&#39;intérêt avec un gène rapporteur qui est ciblée pour la GV et est libéré de manière régulée à côté des médiateurs endogènes SG. Le protocole permet haute résolution confocale quatre dimensions analyses de la MC SG et le suivi de leur calendrier de biogenèse d&#39;exocytose déclenché. Ainsi, en utilisant ce protocole pour le dépistage de gènes entreEST pour leur impact phénotypique et fonctionnelle permet de déchiffrer les mécanismes moléculaires qui régissent la biogenèse et l&#39;exocytose de la MC SG et l&#39;identification des organismes de réglementation concernés. Ainsi, de nouvelles informations sur les mécanismes cellulaires qui représentent fonction MCs en matière de santé et de la maladie devraient être fournis.

En raison de la faible efficacité de transfection des MCs, les manipulations génétiques sont peu susceptibles de laisser un impact sur les lectures de la sécrétion moyenne mesurée par SGS médiateurs endogènes. Néanmoins, en établissant la co-expression complète du gène rapporteur NPY-mRFP et le plasmide co-transfecté dans les mêmes cellules, suivi des résultats NPY-RGRF exclusivement dans le suivi de la population de cellules qui exprime le gène d&#39;intérêt. Par conséquent, l&#39;avantage de ce dosage par rapport aux ...

L&#39;objectif du présent Protocole est de développer une méthode qui permettra aux analyses de génomique fonctionnelle de la sécrétion des mastocytes. Le protocole est basé sur l&#39;évaluation quantitative de la libération d&#39;un gène rapporteur fluorescent cotrasfected avec le gène d&#39;intérêt et des analyses en temps réel de la morphologie du granule sécrétoire.

Enquête mât cellules sécrétoires granulés; de biosynthèse d&#39;exocytose

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les mécanismes régulant le développement des granules sécréteurs et la cytose des mastocytes. Cela est réalisé en transfectant d'abord les mastocytes avec un gène rapporteur pour l'exocytose, ainsi qu'avec un gène d'intérêt. La deuxième étape consiste à évaluer l'effet du gène testé sur l'exocytose en stimulant les cellules et en surveillant le signal fluorescent du gène rapporteur pendant l'exocytose.Ensuite, l'effet du gène testé sur la génération et le développement des granules sécréteurs des mastocytes est évalué par imagerie confocale du gène rapporteur localisé dans les granules sécréteurs. La dernière étape consiste à effectuer une analyse morphométrique des granules sécréteurs. En définitive, le marquage fluorescent des granules sécréteurs des mastocytes à l'aide d'un gène rapporteur est utilisé pour mettre en évidence des modifications au niveau des mastocytes, du développement de leurs granules sécréteurs et de leur exocytose.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la mesure du relâchement de médiateurs endogènes, la béta-hexosaminidase ou l'histamine, est qu'elle repose sur la co-expression du gène d'intérêt avec un mutant de type ou un S-H-R-N-A, ainsi que d'un marqueur rapporteur de l'exocytose. Cette co-expression permet ensuite de surveiller la sécrétion exclusivement à partir des cellules génétiquement modifiées, contournant ainsi le problème d'un rapport bruit/signal élevé qui se pose lors de la mesure du relâchement des médiateurs endogènes en raison de la faible efficacité de transfection des mastocytes, ce qui complique l'interprétation des résultats. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie cellulaire des mastocytes, telles que l'identification des mécanismes moléculaires contrôlant la formation des granules sécrétoires, notamment la sélection des cargos, l'empaquetage des granules et leur compétence en exocytose.Cette méthode aide également à identifier les mécanismes moléculaires qui contrôlent le processus d'exocytose régulée des cellules de masse en évaluant l'implication des kinases, des phosphatases et d'autres familles de protéines dans ce processus. Pour commencer, préparez des cellules de leucémie basophile du rat et le milieu selon le protocole décrit dans le texte afin d'effectuer la transfection. Premièrement, retirez le milieu de culture de la plaque à l’aide d’une pipette Pasteur stérile reliée à un vide.Rincer la monocouche cellulaire avec de la trypsine préchauffée, un DTA qui recouvre l'ensemble de la monocouche. Placer la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une durée n'excédant pas 10 minutes. Vérifier ensuite au microscope optique si les cellules se sont détachées.Une fois détachées, ajouter du milieu dans la plaque de culture pour suspendre les cellules à un volume d'au moins deux fois le volume de la solution de trypsine. Après avoir déterminé le nombre de cellules à l’aide d’un hémo-cytomètre, centrifuger 15 millions de cellules pendant trois minutes à 200 ×g et à 25 degrés Celsius. Éliminer le surnageant et ajouter 280 microlitres de milieu de transfection.Transférez ensuite le mélange réactionnel dans un vial de quatre millimètres. Ajoutez 20 microgrammes de plasmide contenant le neuropeptide Y-M-R-F-P, également connu sous son nom abrégé N-P-Y-M-R-F-P, ainsi que 30 microgrammes de plasmide contrôle vide ou un plasmide testé. Le volume final du mélange réactionnel doit être de 300 microlitres.Après l'avoir placé sur de la glace pendant 10 minutes, essuyez le tube pour éliminer l'eau résiduelle. Procédez ensuite à l'électroporation à 300 volts pendant neuf millisecondes. Pour les mesures de l'exocytose, remettez immédiatement les cellules en suspension dans des boîtes de culture tissulaire de 24 puits contenant chacune 300 microlitres de milieu.Ajoutez huit microlitres du mélange réactionnel à chacun. Ensuite, ajoutez des cellules non transfectées à des puits supplémentaires pour le témoin. Préparez suffisamment de puits pour disposer de puits dupliqués pour chaque traitement, pour chaque transfection ; pour la microscopie en temps réel, remettez immédiatement les cellules en suspension dans un système de chambre à huit puits avec couverture en verre de silicate contenant 80 microlitres de milieu.Ajoutez 1,5 microlitres du mélange réactionnel dans chaque chambre pour sensibiliser les cellules à l'activation médiée par le FC epsilon R un. Ajoutez un microgramme par millilitre d'IgE monoclonale spécifique du DNP de souris dans le milieu. Incubez les cellules avec l'IgE pendant au moins deux heures.Après 18 à 24 heures, utilisez un microscope à fluorescence pour confirmer que les cellules expriment les plasmides. Le MRFP possède une longueur d'onde d'excitation de 584 nanomètres et une longueur d'onde d'émission de 607 nanomètres. Le N-P-Y-M-R-F-P devrait apparaître dans des structures vésiculaires correspondant aux granules sécréteurs.Pour mesurer l'exocytose de N-P-Y-M-R-F-P, retirez le milieu de culture. Depuis la plaque de 24 puits, lavez trois fois avec du tampon tyro. Préparez les cellules non stimulées en ajoutant 200 microlitres de tampon tyro aux puits témoins.Ensuite, ajoutez les réactifs activateurs et le tampon tyro dilué avant d'incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Transférez soigneusement les surnageants S de chaque puits dans une plaque de 96 puits. Placez la plaque sur de la glace et protégez-la de la lumière.Les surnageants S contiennent le peptide chimérique N-P-Y-M-R-F-P libéré des cellules. Ensuite, ajouter 200 microlitres de tampon tyro contenant 0,5 % de Triton X-100 dans chaque puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Cette étape est importante pour la préparation des lysats cellulaires contenant le peptide N-P-Y-M-R-F-P restant qui n’a pas été libéré des cellules.Recueillir les lysats cellulaires et les transférer dans une plaque de 96 puits avant de les placer sur de la glace. En l'absence de lumière, mesurer la fluorescence des surnageants cellulaires et des lysats cellulaires à l'aide d'un lecteur de plaque à fluorescence équipé d'un filtre d'excitation de 590 nanomètres à bande passante de 20 nanomètres et d'un filtre d'émission de 635 nanomètres à bande passante de 35 nanomètres. Ensemencer 1,5 microlitre de cellules transfectées dans un système de culture à huit chambres en verre couvre-objet en silicate de bore.Incuber les cellules pendant 18 à 24 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Retirer le milieu de culture des chambres et rincer trois fois avec du tampon tyroïdien. Ensuite, ajouter 72 microlitres de tampon tyroïdien dans chaque chambre.Utilisez un microscope à fluorescence confocale équipé d'une chambre chauffée, d'un contrôleur de dioxyde de carbone et d'un objectif 40 x ou 63 x. Allumez les systèmes du microscope, y compris la lampe au mercure, l'ordinateur et les lasers. Assurez-vous que la température de la chambre chauffée est correcte.Avant de commencer l'expérience, placez le système de lamelle en verre de borosilicate à huit puits dans la chambre chauffée et assurez-vous que la chambre est correctement installée et stable. Allumez la lumière de fluorescence conformément au niveau quatre pertinent et visualisez les cellules transfectées ; éteignez la fluorescence une fois qu'une cellule d'intérêt est dans le champ. Afin de minimiser le photoblanchiment et la cytotoxicité, ce champ doit contenir environ deux à trois cellules transfectées, suffisamment espacées mais ne se touchant pas.Dans ce cas, les cellules sont cotransfectées avec le gène rapporteur N-P-Y-M-R-F-P et un mutant de RAB5 marqué par GFP et constitutivement actif. Ajustez la puissance du laser pour minimiser le bruit, la sur saturation ainsi que la toxicité, et réglez le gain et le décalage afin de modifier le rapport signal/bruit. Effectuez une numérisation rapide afin de réduire la durée d'exposition au laser.Ensuite, définissez les paramètres du Zack pour reconstruire l'image en trois dimensions. Réglez la taille du diaphragme à une unité de surface afin d'obtenir le meilleur rapport signal sur bruit, et effectuez des balayages successifs de tranches optiques confocales bidimensionnelles selon l'axe Z, avec des tranches optiques inférieures ou égales à 0,7 micromètre. Réglez maintenant l'intervalle de temps entre chaque acquisition à 30 secondes et la durée totale d'acquisition à 15 minutes, puis commencez l'acquisition d'images après cinq minutes d'acquisition.Interrompez la série temporelle, ajoutez huit microlitres du déclencheur 10 x et poursuivez immédiatement l'acquisition. Enfin, enregistrez les images. Effectuez une déconvolution à l'aide d'un logiciel de déconvolution et reconstruisez les piles en images tridimensionnelles et en une vidéo afin d'effectuer l'analyse d'image.Importer les données provenant des images de séries temporelles déconvoluées obtenues par microscopie à fluorescence confocale dans un logiciel d'analyse d'images scientifiques tel que MRS. Ce logiciel lit plus de 40 types de fichiers de microscopie. Pour ajouter des points temporels à la fin d'un jeu de données ouvert, sélectionner « Éditer » puis « Ajouter des points temporels » et importer le nouveau jeu de données.Ajustez le contraste et la teinte de couleur pour obtenir une vue d'image optimale. Les fichiers téléchargés créent la surface du canal MRFP. À l'aide de l'option assistant de surface.Choisissez l'algorithme par défaut et le canal N-P-Y-M-R-F-P, puis activez l'option de lissage pour réduire le bruit. Pour éviter la perte de petits détails, réduisez le niveau de détail de la zone entre 0,05 et 0,1 micromètre. Ensuite, définissez le seuil d'intensité.Une nouvelle surface grise s'affiche. Ensuite, accédez aux paramètres et modifiez le style du point central à la surface. Allez dans l'onglet statistiques dans les propriétés de l'objet sélectionné.Ensuite, sélectionnez l'onglet détaillé et la valeur spécifique telle que la fluorescence, l'intensité ou le volume. Examinez les données et vérifiez que les valeurs sont compatibles avec les images. Par exemple, deux granules ou plus adjacents peuvent être mesurés comme un seul granule plus grand afin de quantifier la taille moyenne des granules.Divisez la taille des granules sécréteurs par le nombre réel de granules. Dans la dernière étape, exportez les jeux de données souhaités vers des fichiers Excel et analysez les données. Sont montrées ici des images représentatives en enregistrement temporel de granules sécréteurs géants des mastocytes, formés par l'expression de RAB5 constitutivement actif, ainsi que la cinétique de l'exocytose et la résolution d'un granule sécréteur unique.Après stimulation. Lors de l'exocytose des mastocytes, les granules sécrétoires migrent vers la membrane plasmique et y fusionnent. Les granules sont entourés de RAB5, présent activement en permanence, représenté en vert.Le cargo sécrétoire, qui est N-P-Y-M-R-F-P dans cette expérience et est coloré en magenta, est ensuite libéré des cellules vers l'espace extracellulaire. Les granules qui ont été fusionnés par le mutant activé de façon constitutive de RAB5, indiqué en vert, libèrent leur cargo N-P-Y-M-R-F-P, qui dans cette expérience est coloré en magenta, des cellules vers l'espace extracellulaire.La libération de N-P-Y-M-R-F-P lors de l'exocytose entraîne une augmentation spectaculaire de l'intensité de fluorescence de N-P-Y-M-R-F-P et une réduction des granules sécréteurs contenant N-P-Y-M-R-F-P, suivie de leur disparition, ainsi que des intensités de fluorescence des granules sécréteurs. Après stimulation des cellules par un ionophore du calcium, on observe que les granules sécréteurs subissent l'exocytose à différents moments. Alors qu'un granule sécréteur n'a pas fusionné avec la membrane plasmique et que son intensité de fluorescence est restée constante.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment surveiller les granules sécréteurs des mastocytes au cours du développement et de l’exocytose, à l’aide d’un gène rapporteur fluorescent qui est acheminé vers les granules sécréteurs et libéré par des cellules stimulées. Conjointement avec les médiateurs endogènes, les mécanismes sous-jacents au développement des granules sécréteurs des mastocytes et à leur exocytose peuvent être identifiés grâce à cette procédure, en faisant co-migrer des cellules exprimant un gène rapporteur et un gène test. Le rôle du gène test dans le développement des granules sécréteurs des mastocytes peut être évalué en réalisant une analyse morphométrique des granules sécréteurs de cellules co-transfectées avec le gène d’intérêt, comparées à des cellules témoins.En outre, le rôle du gène testé dans l’exocytose régulée peut être identifié en surveillant la libération du gène rapporteur.

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