Name: Imagerie Ca locale 2+ Signaux de cellules de mammifères cultivées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Découvrez l'imagerie des signaux calciques locaux IP3 dans des cellules de mammifères intactes par microscopie à fluorescence. Cette méthode utilise un algorithme automatisé pour identifier et analyser les événements calciques avec une résolution sous-pixel.

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Ce travail a été soutenu par les subventions des National Institutes of Health GM 100201 à I.F.S, et GM 048071 et GM 065830 à I.P.

Nous présentons des procédures détaillées pour l&#39;imagerie locales Ca 2+ événements dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome humain. Ces procédures peuvent être adaptées à l&#39;image de Ca 2+ intracellulaire des signaux dans de nombreux types cellulaires 10/08. 1. Préparation des cellules <ol><li> Culture des cellules à imager selon les instructions figurant sur le site Internet de leur fournisseur. </li><li> Quelques jours avant l&#39;imagerie, les cellules de récolte cultivées dans un flacon de culture tissulaire en utilisant 1 ml de 0,25% de trypsine / EDTA (2-3 min). À la suite de détachement, ajouter un volume égal de milieu de culture pour inactiver la trypsine. </li><li> Effectuer une numération cellulaire en utilisant un hémocytomètre et de semences cellules dans des boîtes d&#39;imagerie à fond de verre à une densité de 3-7 x 10 4 cellules par boîte. Sélectionnez les cellules pour des expériences d&#39;imagerie quand ils atteignent 60% de confluence (2-3 jours). </li></ol> 2. Préparation des solutions et réactifs <ol><li> Préparer un Ca 2+ contenant tamponnée HEPESsolution de sel (Ca 2+ -HBSS), composée de (mM): NaCl 135, KCl 5,4, CaCl 2 2, MgCl 2 1, HEPES 10, 10 et glucose; pH = 7,4 à la température ambiante (TA) avec NaOH. Préparer Ca 2+ -HBSS sans l&#39;ajout de glucose et conserver à 4 ° C; ajouter à la solution de glucose immédiatement avant l&#39;utilisation. </li><li> Solubiliser les formes de la Ca 2+ indicateur fluorescent Cal-520 (1 mM) infiltrant les membranes, ci-IP 3 (200 uM), et EGTA (100 mM) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) contenant 20% de Pluronic F-127. Aliquoter ces réactifs dans des tubes Eppendorf et magasin, à l&#39;abri de l&#39;humidité et de la lumière, à -20 ° C. </li></ol> 3. Les cellules de chargement avec infiltrant les membranes Cal-520, ci-IP 3 et EGTA <ol><li> Préparer le &quot;tampon de chargement&quot; par dilution de solutions mères de infiltrant les membranes Cal-520 et CI-IP 3 à une concentration finale de 5 uM et 1 uM, respectivement, dans -HBSS Ca2 +. </li><li> Aspirer cumédias LTURE et rincer les cellules en remplaçant médias Ca 2+ -HBSS trois fois. </li><li> Retirer Ca 2+ -HBSS et incuber les cellules dans un tampon de chargement pendant 60 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Éliminer le tampon de chargement et rincer les cellules en remplaçant médias Ca 2+ -HBSS trois fois. <ol><li> Si vous le souhaitez, à cette étape, les cellules de charge avec EGTA / AM en diluant la solution mère à une concentration finale de 5 uM dans Ca 2+ -HBSS et puis incuber les cellules pendant 30-60 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. Après cette incubation, rincer les cellules trois fois avec Ca 2+ -HBSS avant de procéder à l&#39;étape 3.5. </li></ol></li><li> Incuber les cellules à Ca 2+ -HBSS de 30 min pour permettre la désestérification de réactifs chargés. </li><li> Immédiatement avant l&#39;imagerie, remplacer le Ca2 + avec -HBSS &quot;frais&quot; Ca 2+ -HBSS afin d&#39;éliminer tout colorant qui aurait fui dans le bain au cours de l&#39;incubation finale. </li></ol> 4. Ca 2+ </sup&gt; Acquisition d&#39;image <ol><li> Placer une petite goutte d&#39;huile d&#39;immersion sur l&#39;objectif 100X APO FRBR (NA 1,49). </li><li> Monter le plat d&#39;imagerie sur la scène du microscope inversé et amener les cellules au point en utilisant la lumière transmise. Il est important de fixer la capsule d&#39;imagerie pour empêcher tout mouvement pendant l&#39;enregistrement. </li><li> Illuminer les cellules avec un laser 488 nm afin d&#39;exciter Cal-520 et collecter la fluorescence émise (λ&gt; 510 nm) en utilisant une caméra EMCCD à grande vitesse. REMARQUE: Le logiciel qui fonctionne le microscope permet à l&#39;utilisateur de traduire une lentille de focalisation permettant le faisceau laser à introduire soit à l&#39;extrême bord de l&#39;ouverture de retour objectif (de la FRBR excitation) ou plus au centre (pour l&#39;excitation &quot;WF&quot;). </li><li> Utilisation du logiciel EMCCD, réduire le champ d&#39;imagerie des pleins 512 x 512 pixels afin de recueillir des données à la résolution temporelle nécessaire pour capturer locales Ca 2+ événements. REMARQUE: Par exemple, quad centreacquisition de 256 x 256 pixels accélère la vitesse d&#39;acquisition à 66 fps. Il est également possible d&#39;augmenter encore la fréquence d&#39;images de la caméra EMCCD 500 fps en utilisant une fonction du mode de récolte isolé. </li><li> Configurer le logiciel pour enregistrer automatiquement quelques secondes de l&#39;activité de base, offrir un flash UV aux cellules et continuer à enregistrer pour un autre 10 à 30 sec. REMARQUE: Un flash UV est fourni en utilisant une source de lumière à arc au xénon introduit à travers un miroir réfléchissant les UV dichroïque dans l&#39;orifice arrière du microscope. La durée et l&#39;intensité du flash UV est ajusté empiriquement pour évoquer une fréquence souhaitée des locaux Ca 2+ événements. </li><li> Enregistrer les fichiers que l&#39;image des piles pour l&#39;analyse hors ligne. </li></ol> 5. Analyse automatisée Ca 2+ Image NOTE: Il est possible de visualiser, traiter et analyser les données capturées en utilisant de nombreux logiciels commerciaux. Cependant, nous avons développé un algorithme pour automatiser l&#39;identification rapide d&#39;uneanalyse de Ca2 + d de signaux locaux. Une description détaillée des filtres spatiales et temporelles utilisées dans cet algorithme, la génération des AF / F 0 et l&#39;identification / analyse des routines peut être trouvée dans 11. Cet algorithme a été développé pour fonctionner sur la plate-forme open-source du logiciel Python, et peut être obtenu, avec l&#39;échantillon de données expérimentales et les instructions d&#39;utilisation détaillées, en envoyant un courriel de l&#39;auteur correspondant (ismith@uci.edu). <ol><li> Convertir des fichiers à importer dans l&#39;algorithme écrite sur mesure pour le format de fichier de la multi-plan. </li><li> Localisez le dossier contenant l&#39;algorithme d&#39;analyse et double cliquez sur le run.exe. </li><li> Sélectionnez le fichier .tiff à analyser. </li><li> Choisissez les paramètres d&#39;analyse dans la boîte de dialogue ouverte. Voir la figure 2A pour les paramètres par défaut pour les données d&#39;échantillon. </li><li> Déterminer le niveau de noir à être décalée par rapport à la pile de l&#39;image en déplaçant le curseur sur une partie du champ de vue qui ne nOT contient une cellule (voir la figure 2B) ou en saisissant manuellement un niveau de noir à l&#39;aide de l&#39;invite «Black Level Set &#39;. </li><li> Observez quatre fenêtres sur l&#39;écran après analyse par le logiciel (figure 2C-F). C est une image monochrome de repos fluorescence à partir de cellules en cours d&#39;analyse. Les carrés blancs superposés sur cette image sont des lieux d&#39;événements déterminés, que les positions barycentre de fonctions gaussiennes deux dimensions montés sur les événements. </li><li> Cliquez sur chaque lieu de l&#39;événement ou appuyez sur les touches de curseur pour faire défiler les événements. En faisant ainsi l&#39;arrière-plan soustrait, gaussien lissée changements de rapport de fluorescence (AF / F) 0 à chaque mise à jour de ces sites dans la fenêtre D. REMARQUE: Rouge souligné les événements sont déterminés à provenir de ce site particulier et non pas de «purge-through &#39;de l&#39;activité localisée à des sites adjacents. La trace bleue inférieure indique l&#39;endroit où le signal de fluorescence sur le site choisi dépassé la détectionseuil, alors que la ligne noire identifie les événements provenant de ce site particulier (correspondant à la couleur rouge des événements mis en évidence). </li><li> Cliquer sur un événement en surbrillance rouge pour mettre à jour la fenêtre E qui affiche l&#39;évolution temporelle de l&#39;événement, et la fenêtre F qui présente le profil spatial de l&#39;événement en moyenne sur son évolution dans le temps, ainsi que le profil spatial de la fonction gaussienne équipée. </li><li> Examiner manuellement les événements qui ont été identifiés à ce que les artefacts peuvent être rejetés de l&#39;analyse. Supprimer ces événements en cliquant droit sur le rouge souligné événements. NOTE: Dans nos mains, flux de Ca2 + par des voies simples IP 3 R évoque des signaux avec AF / F 0 environ 0,11, sont donc susceptibles d&#39;être de faux positifs des «événements» détectés sensiblement plus petites que cela. </li><li> Exporter des données en sélectionnant «Enregistrer sur Excel» ou exporter des données sur une base par cellulaire en dessinant autour de la cellule d&#39;intérêt et en sélectionnant «Enregistrer CellR17 ;. Note: Les données sont enregistrées dans le même dossier que la pile de l&#39;image originale. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549(2011).</li>
<li>Hagenston, A. M., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+synapse-to-nucleus+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564(2011).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+and+global+aspects+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary and global aspects of calcium signalling.</a> J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).</li>
<li>Lipp, P., Niggli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchical+concept+of+cellular+and+subcellular+calcium+signalling%29%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling).</a> Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).</li>
<li>Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics+of+calcium+liberation+induced+in+Xenopus+oocytes+by+photoreleased+inositol+trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate.</a> Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).</li>
<li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li>
<li>Demuro, A., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+activity+and+localization+of+single+voltage-gated+Ca%282%2B%29+channels+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).</li>
<li>Smith, I. F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li>
<li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li>
<li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+algorithm+for+automated+detection%2C+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li>
<li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane%3A+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li>
<li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels%3A+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous décrivons ici les protocoles pour l&#39;imagerie locales Ca 2+ événements dans des cellules de mammifères cultivées en utilisant fluorescentes Ca 2+ indicateurs. En outre, nous décrivons un algorithme avec une interface utilisateur intuitive qui automatise l&#39;identification et l&#39;analyse des données acquises. La procédure décrite ici utilisent le Ca 2+ fluorescente indicateur Cal-520, mais beaucoup d&#39;autres colorants Ca 2+ sensibles comme Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 ...

Les ions calcium (Ca2 +) régulent ubiquitaire un large éventail de processus biologiques, y compris l&#39;expression des gènes, la sécrétion et des changements durables dans la plasticité synaptique 1. Un moyen par lequel Ca 2+ peut agir de manière diversifiée est à travers les différentes configurations spatiales et temporelles de Ca 2+ signale une cellule peut générer. Par exemple, les élévations mondiaux dans cytosolique [Ca 2+] déclenchement de la contraction dans le tissu musculaire lisse 2 alors plus petit, élévations transitoires localisées (locales Ca2 +) microdomaines stimuler l&#39;expression de gène essentiel pour l&#39;apprentissage et la mémoire 3. Cytosolique libre [Ca 2+] est maintenue à ~ 100 nM au repos, mais peut rapidement se élever à plusieurs micro-molaire suivante l&#39;afflux de Ca2 + dans le cytosol par Ca 2+ canaux ioniques -permeable situés dans la membrane plasmique et par la libération de Ca 2+ intracellulaire de stores. Notre laboratoire se concentre sur le récepteur de l&#39;inositol 1,4,5-triphosphate (IP 3 R), qui forme un canal de libération 2+ Ca situé dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE). Lors de la liaison à la fois de IP3 et Ca2 + cytosolique à l&#39;activation des sites du récepteur, le canal R IP 3 se ouvre pour libérer Ca2 + séquestré dans la lumière du RE. La libération de Ca 2+ peut rester dans l&#39;espace restreint à un petit groupe de IP 3 Rs pour générer un microdomaine cytosolique locale de Ca2 + (Ca 2+ feuilletée 4) ou, en fonction de la proximité des pôles voisins de IP 3 Rs, peut propager dans une cellule en recrutant plusieurs sites feuilletées par un processus de Ca 2+ induite par Ca 2+ -release (CICR) 5,6. L&#39;introduction d&#39;indicateurs les colorants de petite molécule fluorescente Ca développé par Roger Tsien 7, couplé avec la microscopie avancée Imaging techniques, a grandement facilité notre compréhension de Ca 2+ signalisation. Les progrès récents en caméras utilisées pour la microscopie permettent désormais pour l&#39;imagerie transitoires locales Ca 2+ événements tels que bouffées avec une résolution spatiale et temporelle sans précédent. Actuellement disponibles caméras EMCCD permettent imagerie avec 128 x 128 pixels à 500 images&gt; -1 sec (fps) et la nouvelle génération de semi-conducteur complémentaire à oxyde de métal (CMOS) caméras offrent une résolution de pixels, et la vitesse encore plus rapide au détriment de légèrement plus élevé des niveaux de bruit. En collaboration avec réflexion totale interne (FRBR) microscopie, il est maintenant possible d&#39;une seule image Ca 2+ Les événements de canaux 8,9. Cette approche permet l&#39;imagerie de centaines de canaux / événements simultanément, tout en générant de grands ensembles de données (environ 1 Go par min) qui rendent le traitement manuel, l&#39;identification visuelle et l&#39;analyse impraticable et placer un fardeau sur le développement d&#39;algorithmes automatisés. 2+ signaux dans les cellules de mammifères en utilisant intactes fluorescentes Ca 2+ indicateurs. Nous démontrons en outre un algorithme développé dans l&#39;environnement Python open-source qui automatise l&#39;identification et l&#39;analyse de Ca 2+ événements locaux imagés à la fois par la FRBR et large champ épi-fluorescence conventionnelle (WF) microscopie. Bien que nous décrivons ces approches dans le contexte de la PI 3 -generated signaux Ca2 +, ils sont facilement prête pour étudier les changements locaux dans cytosolique [Ca 2+] issues d&#39;une variété de Ca 2+ canaux ioniques -permeable situés soit dans la surface ou membrane d&#39;organites intracellulaires 10/08.

<table><tbody><tr><td>Neuroblastome humain SH-SY5Y cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520/AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidène-6-O-(2-nitro-4,5-diméthoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxyméthyl) Ester</td><td>SiChem</td><td>cag-iso-2-145-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO/20 % pluronic F127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>EGTA/AM</td><td>Invitrogen</td><td>E-1219</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes d’imagerie à fond de verre de 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie ca locale<sup&gt; 2+</sup&gt; signaux de cellules de mammifères cultivées

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolique ions Ca 2+ réglementer de nombreux aspects de l&#39;activité cellulaire dans presque tous les types de cellules, le contrôle des processus aussi variés que la transcription des gènes, excitabilité électrique et la prolifération cellulaire. La diversité et la spécificité de Ca 2+ signalisation dérive de mécanismes par lesquels Ca 2+ signaux sont générés pour agir sur des échelles de temps et d&#39;espace différentes, allant des oscillations et des vagues large cellulaires survenant au cours des périodes de minutes à transitoires Ca2 + microdomaines locales (Ca 2+) bouffées millisecondes durables. Les progrès récents dans électrons multipliés CCD (EMCCD) caméras permettent désormais pour l&#39;imagerie des signaux Ca 2+ locaux avec une résolution spatiale de 128 x 128 pixels à des taux de&gt; 500 cadres sec -1 (fps). Cette approche est très parallèle et permet la surveillance simultanée de centaines de chaînes ou d&#39;autres sites feuilletées dans une seule expérience. (1 pe Cependant, les grandes quantités de données générées ca. Gbr min) de rendre l&#39;identification visuelle et l&#39;analyse de Ca 2+ locale événements impraticable. Ici, nous décrire et démontrer les procédures pour l&#39;acquisition, la détection et l&#39;analyse des IP locale 3 médiée Ca 2+ signaux dans les cellules mammifères intactes chargés de Ca 2+ indicateurs utilisant à la fois grand champ épi-fluorescence (WF) et la réflexion interne totale fluorescence (FRBR) microscopie. En outre, nous décrivons un algorithme développé au sein de l&#39;open-source environnement logiciel Python qui automatise l&#39;identification et l&#39;analyse de ces signaux locaux Ca 2+. L&#39;algorithme localise les sites de Ca 2+ de presse avec une résolution sous-pixel; permet d&#39;avis utilisateur des données; et délivre séquences temporelles de signaux de rapport de fluorescence avec amplitude et données cinétiques dans un tableau Excel compatible.

Figure 1A montre une image WF de repos Cal-520 fluorescence dans les cellules de neuroblastome SH-SY5Y humains également chargé avec 3 ci-IP. L&#39;exposition de ces cellules à un flash 100 UV msec à la photo-presse i-IP 3 a suscité transitoires Ca2 + bouffées sur des sites discrets (relevées par les cercles blancs sur la figure 1A). traces de fluorescence mesurée à ces sites ont montré une phase de montée rapide en raison d&#39;ouvertures de passage de ...

Nous présentons ici des techniques d’imagerie des événements Ca2+ médiés par IP3 locaux à l’aide de la microscopie à fluorescence dans des cellules de mammifères intactes chargées d’indicateurs Ca2+ ainsi qu’un algorithme qui automatise l’identification et l’analyse de ces événements.

Imagerie Ca locale<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux de cellules de mammifères cultivées

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer l'acquisition, la détection et l'analyse de signaux calciques locaux médiés par l'IP trois dans des cellules mammaires intactes, à l'aide d'une imagerie basée sur une caméra. Cette approche est réalisée en cultivant d'abord les cellules sur des boîtiers de culture à fond en verre, puis en les chargeant avec les formes perméables à la membrane cellulaire d'un indicateur fluorescent du calcium, CAL cinq 20, ainsi qu'avec de l'IP trois piégé.La deuxième étape consiste à positionner la lame de verre sur la platine d'un microscope inversé et à éclairer l'échantillon avec une lumière de 488 nanomètres afin d'exciter le colorant fluorescent sensible au calcium Cal five 20. Ensuite, des signaux calciques locaux sont induits en exposant les cellules à une brève impulsion de lumière UV. Cette photoactivation libère l'IP three d'un précurseur piégé, permettant ainsi à cette molécule de se lier au récepteur de l'acétol trisphosphate et de provoquer la libération de calcium depuis le réticulum endoplasmique.La dernière étape consiste à importer la pile d'images dans l'algorithme spécialement conçu afin de lancer l'analyse automatisée des do

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Le réticulum endoplasmique joue un rôle clé dans la biogenèse des protéines et dans l'homéostasie calcique. Nous avons établi un système expérimental qui nous permet d'aborder le rôle des canaux Ca2 + de fuite et de caractériser leur putatifs mécanismes de régulation. Ce système implique gene silencing siRNA médiation et de cellules vivantes Ca2 + imagerie.

Direct imagerie calcique cellulaire Combiné avec Gene Silencing siARN Mediated Identifie Ca 2 + Canaux de fuite dans la membrane du RE et de leurs mécanismes de régulation

Les propriétés et les fonctions des signaux intracellulaires Ca2+ des astrocytes dans le striatum restent incomplètement explorées. Nous décrivons des méthodes pour exprimer des indicateurs calciques génétiquement codés dans les astrocytes striataux à l’aide de virus adéno-associés de sérotype 2/5 (AAV2/5), ainsi que des procédures pour imager de manière fiable les signaux Ca2+ dans les astrocytes striataux in situ.

Imagerie intracellulaire de Ca 2+ Signaux dans Striatale astrocytes de souris adultes utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés

Cet article décrit un protocole pour la détection d’un ou plusieurs plasma et/ou des protéines de la membrane intracellulaire Super-résolution par appauvrissement de l’état fondamental (GSD) microscopie en cellules mammifères. Ici, nous discutons des avantages et des considérations d’utiliser ces approches pour la visualisation et la quantification des protéines cellulaires.

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Ca2 + indicateurs génétiquement encodés (GECIs) ont radicalement changé comment in situ Ca2 + imagerie est réalisée. Pour optimiser la récupération de données de ces enregistrements, il faut une analyse appropriée des signaux de Ca2 + . Les protocoles dans le présent document facilitent la quantification de Ca2 + des signaux enregistrés sur place à l’aide de la cartographie spatio-temporelle et analyse axée sur les particules.

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Les méthodes actuelles décrivent une approche non ratiométrique pour l’imagerie calcique sous-compartimentale à haute résolution in vivo chez Caenorhabditis elegans à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés facilement disponibles.

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Ce protocole détaille la procédure d’imagerie des réponses calciques dans le colliculus supérieur (SC) des souris éveillées, y compris l’imagerie de l’activité d’un seul neurone avec la microscopie à deux photons tout en laissant le cortex intact chez les souris de type sauvage, et l’imagerie de l’ensemble du SC avec la microscopie à grand champ chez les souris mutantes à cortex partiel.

Imagerie calcique dans le colliculus supérieur de souris

Ici, nous fournissons un protocole complet pour résoudre les signaux locaux initiaux Ca2+ , connus sous le nom de microdomaines Ca2+ , dans les cellules T primaires murines et humaines à l’aide de la microscopie à fluorescence. Ce protocole constitue une ressource précieuse pour les chercheurs qui examinent les voies de signalisation Ca2+ au sein des cellules immunitaires et pour mieux comprendre leur fonction.

Imagerie des microdomaines Ca2+ initiaux dans les lymphocytes T primaires

Cet article présente une méthode de surveillance quantitative en temps réel des concentrations d’ions calcium (Ca2+) dans les cellules à l’aide de l’imagerie unicellulaire Ca2+ avec le colorant Fura-2/AM. Cette technique permet un chargement efficace du colorant et un calcul précis des niveaux de Ca2+ grâce aux rapports d’intensité de fluorescence, ce qui en fait une approche simple et rapide pour les applications de recherche.

Imagerie calcique unicellulaire pour l’étude de l’activation des canaux ioniques calciques

Découvrez l'imagerie des signaux calciques locaux IP3 dans des cellules de mammifères intactes par microscopie à fluorescence. Cette méthode utilise un algorithme automatisé pour identifier et analyser les événements calciques avec une résolution sous-pixel.

Imagerie Ca locale

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