Name: Évaluation de lencéphalopathie spongiforme transmissible barrières despèces avec une In Vitro Test Prion de conversion des protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Apprenez à évaluer les barrières d'espèces des encéphalopathies spongiformes transmissibles avec un test de conversion des protéines prion in vitro. Cette méthode remplace les challenges sur animaux vivants.

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Nous remercions John Olsen (Département des ressources naturelles du Wisconsin), Tom Cooley, Daniel O’Brien et Steve Schmitt (Département des ressources naturelles du Michigan) et le Dr Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) pour leur aide dans l’acquisition de tissus. Nous remercions également le Laboratoire d’hygiène de l’État du Wisconsin pour les services de tests de diagnostic, ainsi que la Dre Tonie Rocke et son personnel (USGS National Wildlife Health Center) pour l’utilisation de l’équipement. Toute utilisation de noms commerciaux, de produits ou d’entreprises est uniquement à des fins descriptives et n’implique pas l’approbation du gouvernement américain.

travaux animale menée à la National Wildlife Health Center USGS a été réalisée en conformité avec l&#39;Office de lignes directrices NIH Laboratoire bien-être animal et sous protection des animaux et le comité de l&#39;utilisation protocole # EP080716. Tissus d&#39;animaux de chasseurs-récoltés étaient des cadeaux du Wisconsin ou du Michigan ministères des Ressources naturelles. 1. Solution Préparation REMARQUE: Les solutions énumérées ci-dessous sont nécessaires pour la préparation du substrat de dosage de CER dans la section 2 ci-dessous. Préparer chacune de ces solutions de concentration des solutions d&#39;achat d&#39;actions plus élevés; concentrations recommandées pour les solutions d&#39;achat d&#39;actions seront indiqués entre parenthèses après chaque nom chimique respective énumérés. Préparer toutes les solutions fraîches lors de la préparation du substrat et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. <ol><li> Pour tampon de lyse, préparer une solution de la suivante dans Tris 10 mM, pH 7,5 (Tris 1 M, pH 7,5 solution stock recommandé): 100 mm schlorure de odium (NaCl, 1 M solution mère), l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique 10 mM (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8,0 solution mère), 0,5% de NP-40 (solution à 10% d&#39;actions), 0,5% de désoxycholate (DOC, 10% solution stock ). </li><li> Pour mémoire tampon de conversion, préparer une solution de dodécylsulfate de sodium à 0,05% (SDS, solution à 10% d&#39;actions) et 0,5% de Triton X-100 (10% de solution de stock) dans une solution saline tamponnée phosphate (PBS, 10, pH 7,4 solution mère). </li><li> Pour les solutions chaotropiques, préparer deux solutions 3 M de chlorhydrate de guanidine (GdnHCl, 8 M stock) en 1x PBS (solution 10x de stock). Ajuster le pH de l&#39;une des solutions à 3,5 ± 0,05 avec de l&#39;acide chlorhydrique concentré (HCl). Vérifier que le pH de la deuxième solution se maintient à un pH de 7,4 ± 0,05 et ajuster en utilisant du HCl concentré ou d&#39;hydroxyde de sodium (NaOH), si nécessaire. </li></ol> 2. Préparer Paires CER Assay Substrate <ol><li> Obtenir le tissu cérébral sain, non-TSE-infecté à partir d&#39;espèces d&#39;intérêt et de préparer un volume poids par 10%(P / v) dans du tampon d&#39;homogénat de lyse en utilisant l&#39;une des méthodes suivantes: Dounce, broyeur à billes, ou homogénéisation mortier et un pilon. Affiner plus loin homogénats résultant en les soumettant à seringue-aiguille et l&#39;homogénéisation à l&#39;aide d&#39;aiguilles de calibre croissant jusqu&#39;à ce que le substrat peut être aspiré et expulsé avec facilité par une aiguille G 27 de la seringue. <ol><li> Pour les substrats préparés à partir de rongeurs et autres petits mammifères, homogénéiser cerveau (s) ensemble; pour les substrats préparés à partir de grands mammifères, utiliser obex (tronc cérébral) tissus pour préparer homogénats. Lors de la sélection de la quantité d&#39;homogénat de cerveau, la préparation ne dépassant pas 50% de la capacité de la centrifugeuse utilisée pour la précipitation des protéines à l&#39;étape 2.6. </li><li> Si la qualité du tissu cérébral acquis est discutable, évaluer les niveaux PrP C par SDS-PAGE 16 et 17 immunoblot avant substrat préparation. </li></ol></li><li> Divisez homogénat de cerveau en deux volumes égaux dans des tubes coniques distincts étiquetés plastique. Ajouter GdnHCl (3 M dans une solution PBS) à pH 3,5, soit 7,4 ou de chaque tube dans un rapport 1: 1 en volume d&#39;homogénat de cerveau. </li><li> Vérifiez les valeurs de pH des deux solutions. Ajuster le pH du substrat pH 3,5 à pH 0,05 ± utilisant du HCl concentré. Se assurer que le pH de l&#39;autre substrat reste à un pH de 7,4 ± 0,05 et ajuster le pH si nécessaire avec de l&#39;HCl ou de NaOH selon les besoins. Évitez dépassement des valeurs de pH par addition judicieuse d&#39;acide ou de base. </li><li> Tournez solutions sur un mélangeur à tambour-end à la température ambiante (RT) pendant 5 heures. </li><li> Précipiter la protéine en ajoutant quatre volumes de méthanol à la solution de substrat dans chaque tube conique, vortex pour bien mélanger et incuber à 20 ° C pendant 16-18 h. </li><li> Les échantillons de sédiments par centrifugation à 13 000 g pendant 30 min à 4 ° C. Décanter avec soin et jeter le surnageant et laisser se évaporer le methanol à partir des pastilles. Utilisation des applicateurs en coton-tige pour aider à l&#39;absorption du methanol est attachée à l&#39;intérieur du tube. Ne pas permettre à plus de pellets-dry methanol et une fois ne est plus visible, passer à l&#39;étape suivante. </li><li> Pastilles de protéines remettre en suspension dans un tampon de conversion. Utilisation d&#39;une quantité de tampon de conversion égal à la quantité de matériau de départ d&#39;homogénat cérébral distribué dans chaque tube à l&#39;étape 2.2. NOTE: Il est essentiel que le tampon de conversion utilisé pour remettre en suspension les granulés de protéines à la fois un pH de 3,5 et de préparations de substrat 7,4-traités est la solution définie à l&#39;étape 1.2 ci-dessus (qui contient de faibles niveaux de détergents et un pH physiologique). </li><li> Brièvement soniquées solutions de substrat dans un sonicateur à cuphorn (10 sec à ~ 30% puissance maximale), portion dans 0,5 à 1,0 ml par étiquetés 1,5 ml microtubes. Effectuer un immunoblot de contrôle de qualité (étape 2.9) sur une partie aliquote de chaque substrat. Stocker d&#39;autres aliquotes à -80 ° C jusqu&#39;au moment d&#39;effectuer dosage de CER (section 4). </li><li> Effectuer un contrôle de qualité sur les paires de substrat de CER avant de les utiliser (figure 2). Ces étapes se assurer que les substrats de CER seront provide des résultats optimaux dans les études de conversion. <ol><li> Assurer des quantités comparables de PrP C dans les deux substrats. Comparer les niveaux de PrP en 10-25 ul de chaque substrat par 16 SDS-PAGE et immunotransfert 17. Si les niveaux de protéine dans le pH 7,4 et 3,5 substrats sont dans ~ 10% de l&#39;autre, les paires de substrat sont appropriés pour une utilisation dans des études de CER. REMARQUE: Les immunoblots PrP ne devraient pas montrer des preuves de la dégradation importante PrP C. L&#39;immunoréactivité PrP devrait être essentiellement&gt; 20 kDa. Bandes moins de cette masse moléculaire peuvent être produits de dégradation. Modèles baguage devraient être à peu près équivalente entre les paires de substrat. </li><li> Comme la PrP C dans les deux substrats devrait être PK sensibles, traiter 10-25 ul de chaque substrat avec PK à une concentration finale de 100 pg / ml et digérer des échantillons à 1000 rpm à 37 ° C pendant 1 heure dans le thermo-agitateur. Évaluer tout signal PrP reste par SDS-PAGE 16 et 17 immunotransfert.Substrats avec PrP res ne sont pas appropriés pour une utilisation dans les études de CER. </li></ol></li></ol> 3. Préparer agent de l&#39;EST Seeds <ol><li> Obtenir tissu cérébral TSE-infectés par des espèces d&#39;intérêt et de préparer un 10% (p / v) dans homogénat 1x PBS pH 7,4 en utilisant les méthodes énumérées à l&#39;étape 2.1 ci-dessus. NOTE: Semences pourraient également être produits à partir d&#39;autres tissus TSE-infectés en dehors du système nerveux central, cependant, l&#39;efficacité de la conversion de substrats dérivé du cerveau par des graines provenant de tissus périphériques TSE-infectées n&#39;a pas encore été évalué expérimentalement dans la littérature publiée. </li><li> Aliquote homogénat (s) en 100 résultant - 300 volumes ul dans 0,5 ml microtubes et conserver à -80 ° C jusqu&#39;au moment d&#39;effectuer le test de CER. </li></ol> 4. CER Assay NOTE: Le test de CER implique plus d&#39;une quantité relativement faible de PrP TSE (fourni dans la «semence») d&#39;une espècedans un excès relatif de PrP C (fourni dans le cerveau non infecté &quot;substrat&quot;) d&#39;une autre espèce qui a été partiellement dénaturées soit à pH 3,5 ou 7,4. Après une période d&#39;incubation secouant étendu, la conversion du modèle mécanique de PrP C par PrP EST dans chaque réaction est évaluée par le signal densitométrique de la PrP res restant après digestion avec PK et la détection de immunoblot. La comparaison des niveaux de PrPres dans les substrats précédemment dénaturés à un pH de 3,5 par rapport à 7,4 donne une mesure de la barrière des espèces. Une vue d&#39;ensemble expérimental de cette procédure de test est fourni à la figure 1. <ol><li> Décongeler lentement non infectées paires de substrat de CER (dosage nécessite des volumes égaux de substrats préalablement dénaturé à la fois à 3,5 pH et 7,4) et des solutions de semences TSE-infectés en les plaçant sur le dessus d&#39;un lit de glace (environ 1 heure de temps de dégel). </li><li> Une fois complètement décongelé, aspirer puis expulser chaque solution de substrat à travers une27 G aiguille de la seringue à plusieurs reprises pour re-homogénéiser. Brièvement soniquer chaque solution de semences TSE-infectées pendant 10 secondes à ~ 30% de la puissance maximale. Gardez toutes les solutions sur la glace lors de la préparation des réactions de conversion. </li><li> Label 5 tubes individuels faibles contraignantes, à paroi mince PCR par agent de l&#39;EST à l&#39;essai. </li><li> Préparer les réactions de conversion dans ces tubes en ajoutant 5 ul de solution de semences infectés par l&#39;EST 10% à 95 ul de (a) substrat CER préparés à pH 7,4 et (b) de substrat CER préparé à pH 3,5. <ol><li> Pour chaque échantillon expérimental, préparer réactions parallèles en paires de substrat CER préalablement dénaturé à la fois à pH 3,5 et 7,4. </li><li> Optimiser ratios de TSE semences d&#39;agent pour substrat de cerveau infecté par la détermination empirique. Semences communes: ratios de substrat employé de maintenir un volume de réaction total de 100 pi et pi comprennent 1:99, 2:98 et 5:95 ul ul. Pour la plupart des applications, la graine 5:95 ul: rapport de volume de substrat est approprié et ce qui est est présenté dans eest le protocole. </li></ol></li><li> Préparer trois échantillons de contrôle par agent de l&#39;EST à l&#39;essai comme suit: (a) ajouter 5 pi de solution de semences TSE-infecté 10% à tampon de conversion de 95 pi de contrôle pour entrée PrPres; ajouter un tampon de conversion de 5 ul à 95 ul de substrat préparé en (b) pH 3,5 et (c) à pH 7,4 en tant que témoins pour la conversion non-basé sur un modèle non spécifique. </li><li> Vortex brièvement chaque échantillon dans son tube de PCR fermé de mélanger les semences et le substrat ainsi. Suivi par une impulsion momentanée d&#39;une faible vitesse de paillasse mini-centrifugeuse pour éliminer tout le volume du mélange réactionnel piégé dans le couvercle de tube de PCR. </li><li> Charger les échantillons dans des tubes PCR individuellement marqués dans une paillasse thermo-agitateur équipé d&#39;accepter tubes PCR. Secouez échantillons à 1000 rpm à 37 ° C pendant 24 heures. </li><li> Suite à agitation, ajouter Sarkosyl à une concentration finale de 2% (p / v) et PK à une concentration finale de 100 ug / ml. Échantillons Digest à 1000 rpm à 37 ° C pendant 1 heure dans le thermo-agitateur. NOTE: Ajout de sarkosyl à des échantillons d&#39;aides post-conversion en PK digestion de PrP C. Signaux faux positifs dans des échantillons non ensemencés (étape 4.5) sont pratiquement éliminés par addition de sarkosyl. </li><li> Ajouter du tampon d&#39;échantillon SDS-PAGE, les échantillons de chaleur à 95 ° C pendant 5 minutes et résoudre PrP res restants dans chaque échantillon par SDS-PAGE suivie d&#39;un immunotransfert 16 17. REMARQUE: Après addition de tampon d&#39;échantillon et le chauffage, les échantillons peuvent être traités immédiatement ou les échantillons peuvent être stockés à -20 ° C ou -80 ° C avant l&#39;immunotransfert. Toutes les données présentées ici ont été générés en utilisant du gel et des systèmes d&#39;échange Novex NuPAGE. Des échantillons individuels de l&#39;essai de RGC ont été traitées avec un tampon d&#39;échantillon et l&#39;agent réducteur selon les instructions du fabricant. Les échantillons ont été ensuite chauffés à 95 ° C pendant 5 min et 30 ul de chaque échantillon ont été chargés dans un 12% de Bis-Tris gels préfabriqués. </li><li> Calculer le rapport de rendement de conversion (CER) comme une mesurede barrière des espèces. Mesurer les niveaux de PrPres par densitométrie 17 et divisent la densité totale de l&#39;échantillon pH 7,4 par celle du pH 3,5 échantillon. Multiplier par 100 pour produire un pourcentage. </li><li> Compiler les données de répétitions expérimentales indépendantes pour générer une moyenne ± écart-type CER pour une espèce avec un agent de l&#39;EST donné. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour la réussite de ce protocole, l&#39;attention devrait être accordée aux niveaux PrP C dans le tissu cérébral infecté utilisé pour la préparation du substrat (étape 2.1.2) et la semence au substrat ratio pour les réactions de conversion (étape 4.4.2). Dans notre expérience, le cerveau peuvent être extraites pour une utilisation comme substrat de CER après un post-mortem de longue période, aussi longtemps que la PrP C est présent par immunoblot (Figure 4). En fait, certains autol...

Encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST, maladies à prions) sont un groupe de maladies neurodégénératives fatales avec des périodes d&#39;incubation prolongées qui touchent une variété d&#39;animaux et les humains. L&#39;agent étiologique présumé des EST est constitué d&#39;un isomère mal repliée de la protéine prion hôte (PrP), qui est capable d&#39;auto-propagation par conversion du modèle mécanique de la forme cellulaire normale de la PrP (PrPc) en un infectieuse, associée aux maladies forme (PrP EST) qui se accumule dans les tissus du système nerveux central de l&#39;hôte infecté 1. Prions de mammifères infectieuses transmettent généralement de l&#39;hôte à hôte d&#39;une manière spécifique à l&#39;espèce, qui a donné naissance au concept de la «TSE espèces barrière» limitant événements de transmission inter-espèces 2. Les déterminants biologiques de la barrière des espèces de prion ne sont pas bien comprises. similarité de séquence d&#39;acides aminés entre la PrP infectieux des EST et l&#39;hôte PrP C cUne influence fortement si la conversion a lieu 3-5, mais reste insuffisante pour expliquer tous les événements de transmission du prion observés in vivo 6,7. Ainsi, la caractérisation des barrières d&#39;espèces TSE se est largement appuyée sur des études de provocation des animaux: exposer les animaux naïfs d&#39;une espèce donnée aux prions de l&#39;autre et la mesure du temps d&#39;incubation résultant d&#39;apparition de la maladie et le taux d&#39;attaque comme indicateurs de l&#39;efficacité de la transmission. Souris exprimant la PrP C à partir d&#39;espèces hétérologues sont également utilisés pour ce type d&#39;étude 8. Les coûts associés à la production de souris transgéniques et des essais biologiques à prions prolongées, ainsi que des considérations éthiques de l&#39;utilisation des animaux, sont des obstacles à une enquête expérimentale de TSE barrières d&#39;espèces. Évaluation de la barrière d&#39;espèce humaine aux EST se appuie sur des souris modifiées pour exprimer humaine PrP C. Ces souris exigent longues périodes d&#39;incubation de succomber aux EST ou des modifications à T humainsil molécule humaine PrP C pour la maladie rapide apparition 9. La période d&#39;incubation des EST non humain chez ces souris peuvent se étendre au-delà de la durée de vie de souris normale rend l&#39;interprétation des résultats négatifs difficiles. Les primates non humains ont également été utilisés comme procurations pour étudier les barrières d&#39;espèces humaines, mais ces études souffrent avec les mêmes défis que les autres types de l&#39;expérimentation animale et les primates non humains ne peut pas résumer précisément la maladie car elle procède de l&#39;hôte humain. essais biologiques des animaux restent la méthode «étalon-or» pour mesurer la sensibilité d&#39;une espèce à une EST, mais les obstacles, les coûts et l&#39;éthique de ces études d&#39;animaux vivants ont contraint enquête sur des solutions de rechange. Un certain nombre d&#39;essais in vitro, fondées sur l&#39;évaluation de la conversion de l&#39;hôte PrP C à une protéinase K (PK) de l&#39;Etat, résistante (de PrPres) lorsque ensemencée par PrP TSE, ont été développées et utilisées pour étudier TSE spECIES barrières 10-12. Des exemples de tests in vitro comprennent analyses sans cellules conversion, mauvais repliement des protéines amplification cyclique (PMCA), et le taux de rendement de conversion (CER) de dosage 10-14. Bien qu&#39;aucun de ces tests prennent en compte des facteurs périphériques impliqués dans les barrières d&#39;espèces après l&#39;infection naturelle, tout le monde peut être utile pour identifier les hôtes potentiellement sensibles pour les EST. Ici, nous présentons le protocole pour l&#39;essai de CER, dans lequel deux substrats dénaturées PrP C dérivés de homogénats de cerveau normales sont utilisées dans paillasse réactions de conversion du prion (figure 1) 13. PrP C dans le substrat dénaturée à pH 7,4 ne peut être converti en PrPres par PrP EST ensemencées dans la réaction en l&#39;absence d&#39;une barrière de 14 espèces. En revanche, la dénaturation de la PrP C dans l&#39;autre substrat à pH 3,5 permet d&#39;être converti en une incubation de PrP suivantavec PrP EST provenant de toute espèce et sert de contrôle pour la conversion. Le rapport de conversion de la PrPc en PrPres à pH 7,4 substrat par rapport à celui du substrat pH 3,5 donne une mesure de la barrière des espèces. Nous avons trouvé que le dosage de CER prédit connu barrières d&#39;espèces de souris de laboratoire à divers EST et ont utilisé le test dans les efforts pour prédire la barrière des espèces de nombreuses espèces de mammifères, y compris le mouflon d&#39;Amérique, à la maladie du dépérissement chronique (MDC) et autres EST 14, 15. Les enquêteurs se intéressent à un outil permettant le dépistage rapide des EST barrières d&#39;espèces ou de l&#39;évaluation de la conversion de PrP C de-PrP trouveront cette méthodologie utile.

<table><tbody><tr><td>12 % Bis-Tris SDS-PAGE gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm billes d’oxyde de zirconium</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td>D’autres variétés de billes sont également efficaces</td></tr><tr><td>Anticorps</td><td>divers fournisseurs</td><td></td><td>Sélectionnez les anticorps primaires et secondaires appropriés pour la détection par immunoblot de PrPres à partir d’espèces d’intérêt</td></tr><tr><td>Homogénéisateur</td> <td>de billesProchaine Advance</td><td>BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td>Haute vitesse avec contrôle de la température</td></tr><tr><td>Tubes coniques</td><td>n’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applicateur à pointe de coton</td><td>Uline</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Cuphorn sonicator</td><td>Heat Systems-Ultrasonics</td><td>W-380</td><td>Heat Systems-Ultrasonics, Inc. est maintenant Qsonica, LLC</td></tr><tr><td>Densitométrie logiciel</td><td>UVP</td><td>Vision Works LS Logiciel d’acquisition et d’analyse d’images</td><td>D’autres programmes, tels que NIH ImageJ, fonctionneront également</td></tr><tr><td>Homogénéisateur Dounce</td><td>Kimble Chase</td><td>885300</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur bout à bout</td><td>Labnet International</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-770</td><td>Produit chimique dangereux : irritation oculaire</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de guanidine, 8 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24115</td><td>Produit chimique dangereux : toxicité aiguë, irritation cutanée, irritation oculaire</td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435570</td><td>Produit chimique dangereux : acide fort</td></tr><tr><td>Tampon d’échantillon de dodécylsulfate de lithium, 4x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td>Produits chimiques dangereux : peau & irritation respiratoire, lésions oculaires graves, solide inflammable</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Produit chimique dangereux : toxicité aiguë, liquide inflammable</td></tr><tr><td>Tubes à microcentrifuger</td><td>n’importe quelle marque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifugeuse</td><td>Labnet International</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>L-5125</td><td>Produit chimique dangereux : toxicité aiguë, irritation cutanée, lésions oculaires</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Amresco</td><td>M158</td><td>Produit chimique dangereux : irritation cutanée, lésions oculaires</td></tr><tr><td>Système de gel SDS-PAGE Life</td><td>Technologies</td><td>Système d’électrophorèse NuPAGE</td><td>D’autres systèmes SDS-PAGE fonctionnent également avec</td></tr> des <tr><td>tubes PCR (à faible liaison)</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur</td> <td>de pilonsFisher Scientific</td><td>03-392-106</td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>Sentron</td><td>SI600</td><td></td></tr><tr><td>Membrane en polydifluorure de vinyle</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>V3021</td><td>Produit chimique dangereux : irritation de la peau et des yeux, sensibilisation respiratoire, toxicité pour les organes</td></tr><tr><td>Agent réducteur pour échantillons SDS-PAGE, 10x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>D6750</td><td>Produit chimique dangereux : toxicité aiguë</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28364</td><td>Produit chimique dangereux : toxicité aiguë, irritation cutanée, lésions oculaires, solide inflammable</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Produit chimique dangereux ; seringue à base forte</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>divers</td><td>Utiliser une taille de seringue adaptée aux volumes de substrat à homogénéiser</td></tr><tr><td>Aiguilles de seringue</td><td>BD Biosciences</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker (secoueur de tube PCR)</td><td>Hangzhou All Sheng Instruments</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1</td><td>Produit chimique dangereux : irritation de la peau, des yeux, des voies respiratoires</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Integra Chemical Company</td><td>T756.30.30</td><td>Produit chimique dangereux : toxicité aiguë, irritation oculaire</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de l&#39;encéphalopathie spongiforme transmissible barrières d&#39;espèces avec une<em&gt; in vitro</em&gt; test prion de conversion des protéines

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Les études visant à comprendre la transmission interspécifique des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST, maladies à prions) sont difficiles en ce sens qu’elles reposent généralement sur des études de provocation in vivo longues et coûteuses chez l’animal. Un certain nombre d’essais in vitro ont été mis au point pour aider à mesurer les barrières entre les espèces de prions, réduisant ainsi l’utilisation d’animaux et fournissant des résultats plus rapides que les essais biologiques sur les animaux. Nous présentons ici le protocole d’un test de conversion rapide in vitro des prions appelé test du coefficient d’efficacité de conversion (CER). Dans ce test, la protéine prion cellulaire (PrPC) d’un cerveau hôte non infecté est dénaturée à des pH de 7,4 et 3,5 pour produire deux substrats. Lorsque le substrat de pH 7,4 est incubé avec un agent TSE, la quantité de PrPC qui se convertit en un état résistant à la protéinase K (PK) est modulée par la barrière d’espèce de l’hôte d’origine à l’agent TSE. En revanche, la PrPC dans le substrat de pH 3,5 est mal repliée par tout agent TSE. En comparant la quantité de protéine prion résistante à la PK dans les deux substrats, il est possible d’évaluer la barrière d’espèce de l’hôte. Nous montrons que le test CER prédit correctement les barrières d’espèces de prions connues chez les souris de laboratoire et, à titre d’exemple, nous montrons quelques résultats préliminaires suggérant que les lynx roux (Lynx rufus) peuvent être sensibles à l’agent de la maladie débilitante chronique du cerf de Virginie (Odocoileus virginianus).

L&#39;utilisation réussie de l&#39;essai de CER dépend en grande partie la qualité de la paire de substrats utilisés dans les réactions de conversion. Pour cette raison, les procédures pour préparer paires de substrat CER suivant, un immunoblot de contrôle de la qualité doit être effectuée (Figure 2). Pour les deux substrats, un dosage de 10 à 25 ul par immunotransfert. PrP C doit être facilement détectable dans chaque substrat et les niveaux de PrP C doit être approximativement la...

La mesure de la barrière à la transmission interespèces des maladies à prions est difficile et implique généralement des défis sur les animaux ou des tests biochimiques. Ici, nous présentons un test de conversion de protéines prions in vitro avec la capacité de prédire les barrières d’espèces.

Évaluation de l&#39;encéphalopathie spongiforme transmissible barrières d&#39;espèces avec une<em&gt; In Vitro</em&gt; Test Prion de conversion des protéines

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer le barrage spécifique des encéphalopathies spongiformes transmissibles, appelées EST, vis-à-vis d'une espèce donnée, sans avoir à exposer des animaux vivants. Cela est réalisé en préparant tout d'abord deux substrats pour le test de conversion destinés à être utilisés dans un essai in vitro. La deuxième étape consiste à incuber ces substrats avec les agents EST que vous souhaitez tester ensuite.Après digestion par la protéase K, les échantillons sont soumis à une électrophorèse SDS-PAGE et à un immunoblotting. La dernière étape consiste à mesurer la quantité de protéine PreOn résistante à la protéinase K dans chaque substrat à l'aide de la cytométrie D et à comparer ces quantités par le calcul d'un ratio d'efficacité de conversion, ou CER. En définitive, le CER fournit une mesure du barrage d'espèce pour l'ESB testé par rapport à l'espèce hôte à partir de laquelle le substrat a été préparé.Les avantages de ce test incluent son faible coût, sa courte durée expérimentale et le remplacement d'animaux vivants par des échantillons tissulaires. Bien que cette méthode soit particulièrement adaptée pour fournir des informations sur les barrières d'espèces des maladies à prions sauvages, elle peut être appliquée à toute autre espèce d'intérêt. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés avec la préparation du substrat, le contrôle de qualité et la standardisation.Après avoir obtenu un tissu cérébral sain non infecté de l'espèce d'intérêt, préparez un homogénat à 10 % poids par volume dans un tampon de lyse en utilisant un broyeur à billes ou un mortier et un pilon. Procédez ensuite à l'homogénéisation. Affinez davantage les homogénats en les soumettant à une homogénéisation à l'aide d'une seringue et d'une aiguille, en utilisant des aiguilles de calibre croissant jusqu'à ce que le substrat puisse être aspiré et expulsé facilement à travers une aiguille de seringue de calibre 27. Ensuite, divisez l'homogénat cérébral en deux volumes égaux dans deux tubes coniques en plastique distincts et étiquetés, puis ajoutez dans l'un d'eux trois molarités de chlorure de guanidine dans du XPBS à un pH soit de 3,5 soit de 7,4, selon un rapport volumétrique de un pour un par rapport à l'homogénat cérébral.Maintenant, vérifiez les valeurs de pH des solutions de substrat et utilisez de l'acide chlorhydrique concentré ou de l'hydroxyde de sodium selon les besoins afin de garantir que le pH de chaque substrat reste compris dans une marge de ± 0,05 unité par rapport au pH cible. Agitez les solutions sur un mélangeur rotatif tête-bêche à température ambiante pendant cinq heures. Ensuite, précipitez les protéines en ajoutant quatre volumes de méthanol aux solutions de substrat dans chaque tube conique, tourbillonnez pour bien mélanger, puis incubez à −20 °C pendant 16 à 18 heures.Après l'incubation, sédimenter les échantillons par centrifugation à 13 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, décantez soigneusement et jetez les surnageants S, puis laissez le méthanol s'évaporer des culots. Utilisez des applicateurs en coton pour aider à absorber le méthanol adhérent à l'intérieur du tube.Ne pas laisser les culots trop sécher. Passer à l'étape suivante lorsque le méthanol n'est plus visible, en utilisant une quantité de tampon de conversion égale au volume du matériau initial d'homogénat cérébral pour resuspendre les culots protéiques. Après la resuspension, soniquer brièvement les solutions de substrat pendant 10 secondes.Dans un entonnoir à cuve, soniquer à environ 30 % de la puissance maximale. Ensuite, aliquoter les solutions en volumes de 0,5 à un millilitre dans des tubes microcentrifugeurs de 1,5 millilitre étiquetés, car la protéine du prion cellulaire dans les deux substrats doit être sensible à la protéinase K. Traiter 10 à 25 microlitres de chaque substrat avec de la protéinase K à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre et digérer les échantillons à 1000 tr/min à 37 degrés Celsius pendant une heure dans l'agitateurs thermorégulé. Charger les substrats digérés par la protéinase K, ainsi que 10 à 25 microlitres de chaque substrat non digéré.Effectuez une électrophorèse SDS-PAGE, puis une transfert sur membrane et une immunodétection avec un anticorps spécifique de la protéine prionique afin d'évaluer la protéine prionique de l'hôte, la résistance à la protéinase K et les niveaux de protéine non digérée. Cette image montre les résultats du blot immunologique. Les deux premières pistes contiennent les substrats non digérés, et les deux pistes situées à droite contiennent le substrat digéré par la protéinase K.Si les niveaux protéiques dans les substrats à pH 7,4 et 3,5 diffèrent d’environ 10 % au maximum et ne sont pas résistants à la protéinase K, les paires de substrats sont adaptées pour être utilisées dans des études CER ; conserver les autres aliquots à moins 80 degrés Celsius jusqu’au moment d’effectuer le dosage CER. Les agents EST doivent être manipulés en respectant les précautions appropriées de biosécurité et conformément aux directives institutionnelles. Après avoir obtenu un tissu cérébral infecté par un EST à partir de l’espèce d’intérêt, préparer un homogénat à 10 % poids/volume dans un PBS à pH 7,4 en utilisant la méthode d’homogénéisation précédemment employée pour la préparation des paires de substrats.Transférez les homogénats obtenus dans des tubes microcentrifuge de 0,5 mL, en volumes de 100 à 300 microlitres, et conservez-les à −80 °C jusqu’au moment de réaliser le test CER. Pour commencer, décongelez lentement des quantités égales des substrats CER non infectés à pH 3,5 et 7,4, ainsi que des paires et des solutions de semence infectées par le TSE, en les plaçant sur un lit de glace pendant environ une heure. Après décongélation, maintenez les solutions sur glace, puis re-homogénéisez-les en aspirant et en expulsant chaque solution de substrat à travers une aiguille de seringue de calibre 27.Ensuite, soniquez brièvement chaque solution infectée par le TSE pendant 10 secondes à environ 30 % de la puissance maximale. Préparez ensuite les réactions de conversion dans des tubes PCR à paroi mince et faible rétention, étiquetés, en pipetant 95 microlitres de substrat CER préparé à pH 7,4 en double exemplaire dans deux des tubes, et 95 microlitres de substrat CER préparé à pH 3,5 en double exemplaire dans deux autres tubes.Ensuite, ajoutez cinq microlitres de solution de semence infectée TSE à 10 % dans un tube de chaque substrat à pH 7,4 et 3,5. Parallèlement, ajoutez cinq microlitres de tampon de conversion dans l'autre tube de chaque substrat à pH 7,4 et 3,5 afin de contrôler la conversion non spécifique et non matricée. Préparez également un témoin pour la protéine prion résistante à la protéinase K d'entrée.Pour chaque agent TSE testé, ajouter cinq microlitres de solution de semence infectée à 10 % TSE à 95 microlitres de tampon de conversion comme témoin. Vortexer brièvement chaque échantillon dans son tube PCR fermé, avec doigt et substrat. Suivre immédiatement par une courte impulsion dans une mini-centrifugeuse de banc à faible vitesse afin d'éliminer tout volume du mélange réactionnel piégé dans le couvercle du tube PCR.Le lendemain, chargez les tubes dans un agitateur thermique de banc équipé pour accueillir des tubes PCR et agitez les échantillons à 1000 tr/min à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Ajoutez du sarcosyl à une concentration finale de 2 % poids par volume et de la protéinase K à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre. Incubez les échantillons à 1000 tr/min à 37 degrés Celsius pendant une heure dans l'agitateur thermique. Ajoutez du tampon d'échantillonnage SDS-PAGE, chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis séparez la protéine PrPres résistante à la protéinase K restante dans chaque échantillon par électrophorèse SDS-PAGE, suivie d'un immunoblotting comme précédemment. Enfin, calculez le rapport d'efficacité de conversion comme mesure de la barrière entre espèces.Suivant les instructions du protocole écrit, le substrat de l'essai CER préparé à un pH de 7,4 ou de 3,5 a été incubé avec du scrapie adapté à la souris RML, du scrapie ovins domestiques, du scrapie classique, de la maladie débilitante chronique du cerf à queue blanche, ou de la souche 263K de scrapie adapté au hamster. Dans l'essai CER, les échantillons témoins étiquetés « aucun » contenaient une quantité équivalente d'agent infectieux et aucun échantillon de substrat de souris n'a été analysé pour la présence de protéine prion résistante à la protéinase K par immunotransfert avec l'anticorps monoclonal SAF 83.Les valeurs brutes de tric pour chaque échantillon sont affichées sous chaque voie correspondant à la protéinase. Les concentrations de la protéine prion résistante à la protéinase K variaient selon les substrats murins, dénaturés à pH 7,4 et inoculés avec divers agents EET. Bien que la protéine prion résistante à la protéinase K ait été détectée dans tous les substrats dénaturés à pH 3,5 et inoculés avec un agent EET, ce graphique en barres montre les rapports moyens ± l’écart type entre les substrats murins à pH 7,4 et pH 3,5 pour chaque agent infectieux, basés sur au moins trois essais indépendants.Les lettres minuscules indiquent des sous-ensembles statistiquement homogènes déterminés par une valeur p inférieure à 0,05 à l’aide d’une analyse de la variance. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 48 heures si elle est effectuée correctement. Le test CER peut servir d’évaluation initiale de l’existence d’une barrière d’espèces TSE qui pourrait justifier ou rendre inutile des études supplémentaires sur des animaux vivants.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer les substrats, mettre en place les réactions de conversion et calculer les rapports d'efficacité de conversion afin d'évaluer les barrières entre espèces.

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