Les ganglions rachidiens neurones et les cellules souches différenciées dérivées de tissu adipeux: Un In Vitro Co-culture modèle pour étudier la régénération des nerfs périphériques

L’objectif global de cette procédure est de mettre en place des cellules souches dérivées du tissu adipeux et des co-cultures de neurones DRG pour étudier la régénération nerveuse in vitro. Ceci est accompli en obtenant d’abord des cellules souches indifférenciées dérivées du tissu adipeux du rat. Dans la deuxième étape, les cellules sont différenciées en cellules de type Schwan à l’aide d’un cocktail de facteurs de croissance.

Ensuite, les neurones DRG sont prélevés à partir d’une moelle épinière de rat et associés à l’étape finale, les neurones sont assis sur les cellules souches différenciées pour générer le système de co-culture in vitro. En fin de compte, les cellules sont colorées pour les marqueurs neuronaux et gliaux afin de faciliter la croissance des neurites, la quantification et l’imagerie par microscopie électronique à balayage pour l’évaluation morphologique. Cette méthode peut aider à répondre à différentes questions dans le domaine de la médecine régénérative, par exemple comment la cellule souche adipeuse droite interagit avec les neurones organiques sur différents biomatériaux ?

La raison pour laquelle la démonstration de cette méthode est essentielle car elle implique des étapes difficiles à apprendre en raison de la faible accessibilité et de la petite taille des tissus dans une armoire biologique. Commencez par utiliser une paire de ciseaux et une lame de rasoir stérile pour hacher finement la graisse viscérale et inguinale récoltée sur des rats spro dolly mâles adultes en une consistance fine. Ensuite, transférez la boue de graisse résultante dans un tube contenant 15 millilitres de filtre fraîchement préparé, une solution de collagène stérilisée de type 1 et placez un tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius sous agitation continue pendant 30 à 60 minutes.

Surveillez de près la digestion en vous arrêtant avant que le tissu ne soit complètement dissocié pour améliorer la viabilité et le rendement cellulaires. Lorsque le tissu est prêt, filtrez-le à travers une passoire de cellules de 100 microns. Une bonne digestion se traduira par une consistance de graisse homogène qui apparaît beige avec un léger tourbillonnage.

Neutralisez les enzymes digestives avec 15 millilitres de milieu de croissance de cellules souches à 37 degrés Celsius complété par FBS. Ensuite, faites tourner les cellules pour collecter la fraction vasculaire stromale. Aspirez le supinate en commençant par la couche supérieure de graisse.

Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de globules rouges ISIS avec pipetage. Après une minute, arrêtez la lyse en ajoutant à nouveau 10 millilitres de frais, de moyen et de centrifugeuse aux cellules. Maintenant, aspirez soigneusement le surnageant S.

Remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu et ensemencez les cellules dans 75 centimètres carrés. Flacons à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Maintenez les cellules à des niveaux sub-confluents jusqu’au premier ou au deuxième passage où les cellules sont prêtes pour la différenciation en cellules de type schwan par traitement avec de l’éthanol bêta-plus de capsule et de l’acide rétinoïque pour obtenir les neurones DRG après le prélèvement de la moelle épinière.

Commencez par retirer toutes les parties dorsales, puis utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles et tranchants pour diviser la colonne vertébrale en deux le long de l’axe longitudinal, exposant le tissu du cordon. Coupez la colonne vertébrale en deux segments plus petits sous le niveau de la cage thoracique, puis utilisez des pinces fines pour retirer délicatement tout le tissu du cordon. En prenant soin de ne pas arracher et enlever les racines DRG, qui apparaissent comme des filaments blancs sortant directement des canaux.

Une fois que tout le tissu central a été retiré, utilisez des pinces très fines pour tirer toute la racine DRG, en atteignant profondément dans les canaux vertibles et en prenant soin de ne pas endommager les racines des ganglions. Placez le DRG dans un plat d’arbre pour animaux de compagnie de 60 millimètres carrés contenant trois à quatre millilitres de jambons F 12 moyens complétés par des antibiotiques. Ensuite, sous un microscope à dissection, utilisez une pince stérile et un scalpel pour éliminer tout excès de racines nerveuses entourant les ganglions afin de réduire la contamination des cellules satellites.

Ensuite, transférez le DRG dans une boîte de Pétri de 35 millimètres carrés contenant 1,8 millilitre de milieu F12 frais et ajoutez 200 microlitres de collagénase. Solution mère de type quatre. Incuber le DRG pendant une heure, puis aspirer soigneusement le milieu à l’aide d’une pipette en verre.

En prenant soin de ne pas aspirer ou endommager le DRG. Répétez l’étape de collagénase et lavez le DRG avec un milieu F 12. Après le deuxième lavage, ajoutez 1,8 millilitre de milieu F 12 et 200 microlitres de trypsine aux cellules.

Retirer la trypsine et ajouter un millilitre de milieu complété par 500 microlitres de FBS pour arrêter la réaction enzymatique. Ensuite, aspirez le milieu et lavez doucement le DRG avec le milieu F 12 trois fois pour éliminer toute trace de sérum. Nourrissez maintenant les cellules avec deux millilitres de fluide F12 frais et utilisez une pipette en verre pour transférer soigneusement la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres.

Pipette de haut en bas huit à 10 fois pour dissocier doucement les neurones, puis laisser le palais s’accumuler au fond du tube lorsque le palais s’est stabilisé. Transférez le supinate dans un nouveau tube et ajoutez deux millilitres de F12 medium frais au palais. La répétition de la dissociation mécanique et le transfert du fluide dans la suspension deviennent homogènes.

Ensuite, réévaluez la suspension cellulaire trois à quatre fois, suivie d’une filtration de la suspension homogénéisée résultante à travers une crépine cellulaire de 100 microns dans un nouveau tube de 50 millilitres. Centrifugez les cellules dans un tube de 15 millilitres pendant qu’elles tournent lentement pour pipette fraîchement préparée. 15 % d’albumine sérique bovine à l’intérieur d’un tube de 15 millilitres, maintenu à un angle de 45 degrés pour créer une traînée protéique progressive.

En utilisant les numéros sur le tube comme référence pour la piste de formage, aspirez ensuite le snat des cellules, en économisant les 500 derniers microlitres pour le réusus, en suspendant la pastille et distribuez lentement les cellules le long de la piste protéique dans le nouveau tube. Après avoir fait tourner les cellules, encore une fois, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu BS modifié et ensemencez les cellules dans un petit volume de milieu. Dans une plaque à 24 puits pendant deux heures, lorsque les cellules se sont fixées, ajoutez du milieu BS frais complété par 15 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance nerveuse après dissociation.

Les cellules DRG peuvent également être utilisées pour la co-culture avec les cellules souches adipeuses de type cygne en les ensemencant sur les cellules de pré-ensemencement. Ces images démontrent l’importance des cellules souches adipeuses de type cellule de Schwan pour la germination des neurites DRG dans un modèle de co-culture utilisant des films de polycaprolactone comme substrats. Aucun neurite n’a été observé sur les surfaces non traitées en l’absence de cellules souches adipeuses ressemblant à des cellules de cygne, alors que la formation des neurites a été nettement améliorée dans le système de co-culture.

En moyenne, le nombre de neurites par corps cellulaire augmente considérablement en présence de cellules souches. En effet, comme l’illustrent ces images, la capacité des neurones DRG à faire germer des neurones se produit préférentiellement en conjonction avec des cellules souches différenciées, comme l’indiquent les flèches jaunes en rose. Donc, après avoir regardé cette vidéo, devrait maintenant être en mesure d’obtenir des cellules souches lib derive et de dissocier les neurones DGen.

Mais vous devriez également être capable de mettre en place un modèle à étudier dans la dégénérescence moyenne périphérique.