Name: Ex Utero Lélectroporation et organotypiques Slice culture de souris hippocampe Tissue (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Apprenez l'électroporation ex utero et la culture de tranches organotypiques pour étudier le développement du gyrus denté chez la souris. Cette méthode permet de marquer et modifier des cellules individuelles.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft à SB (BR-2215 ; SFB 497/A9).

NOTE: Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec la loi allemande et ont été approuvés par les bureaux du gouvernement à Tübingen. 1. Préparation de Micropipettes, Solutions et Membranes <ol><li> Préparation de Micropipettes <ol><li> Tirez micropipettes de verre à l&#39;aide d&#39;un extracteur micropipette avec le programme suivant: chaleur: 540, Pull: 125, vitesse: 20 et Delay: 140. Les montants de longueur d&#39;aiguille à 5,5 cm. </li><li> Aiguilles coniques en utilisant un micromoteur pour obtenir une taille de la pointe appropriée de 4 mm. Conserver les aiguilles dans une boîte ou 15 cm boîte de Petri à éviter d&#39;endommager des conseils. </li></ol></li><li> Préparation des solutions <ol><li> L&#39;ADN plasmidique Solution <ol><li> Préparer l&#39;ADN plasmidique contenant la construction d&#39;ADNc souhaité en utilisant un kit Maxi-prep exempt d&#39;endotoxine selon le protocole du fabricant. </li><li> Ajuster la solution de plasmide d&#39;ADN à une concentration finale de 3 ug / ul (sans vecteur de pointe de la GFP) ou de 4 ug /pi (avec 1 ug de vecteur de pic de la GFP) dans endotoxine tampon Tris-EDTA contenant vert rapide (concentration finale de 0,05%). </li></ol></li><li> Laminine Stock solution <ol><li> Dissoudre 1 mg de laminine dans de l&#39;eau stérile jusqu&#39;à un volume final de 1 ml. Préparer des aliquotes de 100 pi et conserver à -80 ° C. </li></ol></li><li> Poly-L-lysine Stock Solution <ol><li> Dissoudre 50 mg de poly-L-lysine dans 50 ml d&#39;eau stérile à une concentration finale de 1 mg / ml. Préparer aliquotes de 1 ml et en magasin -20 ° C. </li></ol></li><li> Remplissez solution saline équilibrée de Hank (HBSS complet) <ol><li> Préparer HBSS complètes en combinant 100 ml de HBSS 10x, 2,5 ml de tampon HEPES 1 M (pH 7,4), 30 ml de 1 M de D-glucose, 10 ml de 100 mM de CaCl2, 10 ml de 100 mM de MgSO 4, et 4 ml de 1 M de NaHCO 3. Ajouter de l&#39;eau stérile jusqu&#39;à 1 L et conserver à 4 ° C. REMARQUE: Autoclave toutes les solutions attendre tampon HEPES 1 M et 1 M D-glucose, qui sont filter stérilisée. </li></ol></li><li> Slice milieu de culture <ol><li> Préparer un milieu de culture de tranche en ajoutant 35 ml de milieu de base de Eagle, 12,9 ml de HBSS complet (1.2.4), 1,35 ml de 1 M de D-glucose, 250 ul de 200 mM de L-glutamine et 500 ul de pénicilline-streptomycine à obtenir un volume final de 50 ml. Ajouter du sérum de cheval à une concentration finale de 5% et stocker à 4 ° C. </li></ol></li><li> Bas point de fusion (LMP) Agarose <ol><li> Préparer une solution à 4% d&#39;agarose LMP par addition de 2 g d&#39;agarose LMP à 50 ml de HBSS complet (1.2.4), suivi par un chauffage dans un micro-ondes pendant 1 à 2 min à puissance élevée. Conserver cette solution dans un bain d&#39;eau à 37-39 ° C. Conserver la solution à 4 ° C et la réutilisation. </li></ol></li><li> Solution Paraformaldéhyde <ol><li> Dans une hotte préparer une 4% de paraformaldehyde (PFA) solution par addition de 4 g de paraformaldehyde dans 100 ml de 1 x PBS. Chauffer la solution à 60 ° C et ajouter quelques gouttes de NaOH 1 N jusqu&#39;à ce que la solution devienne cLear. </li></ol></li><li> Perméabilisation Solution <ol><li> Dissoudre 9 g de BSA dans 300 ml de PBS 1x contenant 0,3% Triton X-100 et conserver à 4 ° C. Ajouter de l&#39;azide de sodium à 10% pour stockage à long terme. </li></ol></li></ol></li><li> Revêtement de la membrane Inserts <ol><li> Diluer une aliquote de solution laminine de stock (1.2.2) et une aliquote de solution stock poly-L-lysine (1.2.3) dans de l&#39;eau stérile pour un volume final de 12 ml. </li><li> Placez des pièces de membrane en plaques de 6 puits par puits contenant 2 ml d&#39;eau stérile. Ajouter 1 ml de solution de revêtement sur ​​le dessus de la membrane et laisser incuber O / N à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Après incubation laver la membrane insère trois fois avec 1 ml d&#39;eau stérile et sec. Utiliser des inserts de membrane revêtue le même jour ou conserver à 4 ° C pendant jusqu&#39;à quatre semaines dans une plaque à 6 sec. </li></ol></li></ol> 2. ADN injection et l&#39;électroporation d&#39;embryons E15.5 et a 18,5 <ol><li&gt; Anesthetize une fois accouplés souris femelle en le plaçant dans une chambre d&#39;anesthésiant saturé avec 5% d&#39;isoflurane et relié à un évaporateur. Faire circuler l&#39;isoflurane et de l&#39;oxygène à un taux de 1 L / min. Gardez l&#39;animal dans la boîte pour 2-4 min ou jusqu&#39;à ce que l&#39;inconscient qui est testé par pincement entre les pattes de la souris. </li><li> Euthanasier la souris inconsciente par dislocation cervicale au jour embryonnaire (E) 15,5 18,5. Disséquer l&#39;utérus contenant les embryons 13 et le placer dans une boîte de Pétri contenant de 15 à 20 ml de froid HBSS complet. NOTE: A partir de là, de garder les embryons et les tissus sur la glace. </li><li> Utilisez une paire de ciseaux pour séparer chaque embryon de la corne de l&#39;utérus et le lieu dans une seconde boîte de Pétri contenant froide HBSS complet. </li><li> Sous un microscope de dissection, rompre le mur du muscle utérin et le placenta en utilisant une paire de pinces fines (N ° 55) et des ciseaux. Relâcher doucement l&#39;embryon de la vésicule ombilicale. </li><li> Utilisez une paire de ciseaux à Bonn decapitate les embryons juste au-dessus des pattes avant à un angle de 60 °. Si l&#39;expérience nécessite le génotypage des embryons, recueillir un échantillon de tissu pour l&#39;isolement d&#39;ADN génomique (un petit morceau de la queue). </li><li> Transférer la tête pour une boîte de Petri propre et sec. Parce que la tête avait été décapité dans un angle de 60 °, la tête doit se incliner d&#39;un côté lorsqu&#39;il est placé dorsale vers le haut. </li><li> Placer une aiguille avec précaution dans le milieu de l&#39;hémisphère à proximité du bregma (figure 1A, B). Injecter environ 3/2 pl (à 3 ou 4 ug / ul) de solution d&#39;ADN en appuyant sur la pédale de l&#39;Picospritzer III en utilisant 30 livres de pression pour la durée de 10 à 15 ms par impulsion, en appliquant des impulsions 5-8. La durée et le nombre des impulsions est fonction du diamètre de l&#39;ouverture de l&#39;aiguille avec des ouvertures plus petites qui nécessitent plus de temps. L&#39;intervalle entre chaque impulsion se élève à une seconde. </li><li> Avant de placer les électrodes, appliquer quelques gouttes de HBSS complet sur la tête de la Bryo. Placer les électrodes de manière à ce que la borne &quot;négative&quot; est sur ​​le même côté que le ventricule injecté et l&#39;électrode «positive» sur la face opposée du ventricule injecté au-dessous de l&#39;oreille de la tête de l&#39;embryon (figure 1C, D). Appliquer cinq impulsions de 50 V. <ol><li> Utilisez trois électrodes mm pour E 15,5 et 5 électrodes mm E 18,5. </li></ol></li></ol> 3. Dissection du cerveau <ol><li> Après l&#39;électroporation, décoller la peau de la tête à l&#39;aide d&#39;une paire de pinces fines. En utilisant une paire de ciseaux à ressort effectuer une petite incision dans le milieu du cervelet sur la ligne médiane du crâne. </li><li> Insérer les ciseaux à ressort dans l&#39;incision et couper longitudinalement le long de la suture sagittale. Décoller le crâne et le cerveau se détacher du crâne à l&#39;aide de pinces fines. Transférer l&#39;ensemble du cerveau dans 15-20 ml solution froide HBSS complet. </li><li> Pendant ce temps, versez 4% agarose LMP,maintenue à 37-39 ° C dans un bain d&#39;eau, dans un moule de pelage. </li><li> Prenez le cerveau de la HBSS complète par une petite spatule de scoops et drainer l&#39;excès de HBSS en utilisant du papier de soie amende ou Kimwipes. </li><li> Placez l&#39;ensemble du cerveau doucement dans l&#39;agarose et ajuster sa position avec une aiguille fine. Conserver sur de la glace du moule jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose est solidifiée et le bloc est sectionné (pour les coupes coronales bulbes olfactifs pointent vers le haut). </li></ol> 4. Vibratome coupe et tranche Culture <ol><li> Couper les blocs d&#39;agarose LMP et les coller sur la platine à l&#39;aide &#39;super glue. Après la colle est sèche transfert la platine sur le plateau de tampon du vibratome et remplir avec de la glace froid HBSS complet jusqu&#39;à ce que le bloc est immergé dans la solution. NOTE: Stériliser toutes les surfaces de l&#39;instrument et l&#39;équipement avec 70% d&#39;éthanol avant la coupe. </li><li> Préparer 250 um sections vibratome épais en utilisant une nouvelle lame comme suit. <ol><li> Coupez le bloc wie les paramètres suivants; fréquence - 60 Hz, amplitude - 0,7 um, la vitesse de 16 à 18 mm / sec. Couper les sections contenant le tissu désiré avec les paramètres ci-dessus à vitesse lente (9 mm / sec). Démarrage du sectionnement du cerveau postérieur, recueillir 5-7 sections de cerveau. </li><li> Transférez les sections à une boîte de culture à 6 puits propre contenant 5 ml de glace froid compléter HBSS avec l&#39;aide d&#39;une spatule coudée et garder sur la glace jusqu&#39;à ce que toutes les sections sont collectées (figure 1E). </li></ol></li><li> Humidifier la membrane d&#39;une manière croisée avec 100 pi de HBSS complet avant de placer les articles sur la membrane, afin de faciliter l&#39;orientation des sections. </li><li> Transférez les sections à l&#39;aide d&#39;une spatule coudée sur la membrane (ramasser un coin de la section avec une pince et tirez sur la spatule et ensuite utiliser la pince pour pousser la section sur la membrane). Placez jusqu&#39;à cinq sections sur une membrane et d&#39;organiser en utilisant une pince (figure 1F). Ne chevauchent pas les uns avec les autres sections. <ol><li> Prenez l&#39;excès de HBSS au large de la membrane à l&#39;aide d&#39;une pipette. Les membranes spécifiques utilisées ici sont fixés à un cadre et insérés dans la plaque de culture de tissu, ce qui permet au tissu d&#39;être en contact mais ne sont pas couverts par le milieu. </li></ol></li><li> Placer les inserts de membrane dans une plaque de 6 puits contenant 1,8 ml de milieu de culture de tranche (1.2.5) (figure 1G, H). Incuber la boîte de culture à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 11 ou 14 DIV DIV. Changer la moitié du milieu (0,9 ml) tous les deux jours. NOTE: A ce stade, ajouter des réactifs comme Bromodeoxyuridine (BrdU; 10 uM concentration finale) pour l&#39;étiquetage des cellules proliférantes aux médias pour les 20 premières heures de la durée de la culture. </li></ol> 5. Fixation des sections Suivi par immunofluorescence <ol><li> Utilisez une lame de scalpel propre et tranchant pour couper et tailler les membranes en fonction de l&#39;orientation deles sections. </li><li> Transférer les sections le long de la membrane à une plaque de 24 puits contenant 1 ml de 4% PFA (1.2.7). Incuber les sections pendant 1 heure à la température ambiante suivie par trois lavages avec 1 x PBS pendant 15 min chacun. Incuber les sections O / N avec une solution de perméabilisation à 4 ° C avec agitation douce. </li><li> Le jour suivant, incuber les sections avec des anticorps primaires appropriées, dilués dans une solution de perméabilisation, O / N ou pendant 48 heures à 4 ° C avec agitation douce. </li><li> Laver les sections 3 fois pendant 15 min avec 1x PBS et incuber O / N à 4 ° C avec les anticorps secondaires appropriées dilué dans une solution de perméabilisation. </li><li> Après l&#39;incubation avec des anticorps secondaires, laver une fois avec les sections 1x PBS pendant 15 min suivi par coloration DAPI pendant 10 min. </li><li> Laver les sections 3 fois avec 1x PBS pendant 15 min chacun et transfert à lames de microscope. Ajouter ImmunoMount et placer délicatement une lamelle sur le dessus des sections. Sécher les lames O / N à 4 ° C et soial vernis à ongles. NOTE: Gardez les diapositives toujours à 4 ° C. <ol><li> Analyser les cultures tranche par microscopie confocale (figure 1I). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

L&#39;hippocampe joue un rôle important dans l&#39;apprentissage et la mémoire. Le gyrus denté est aussi l&#39;une des deux régions du cerveau où se produit la neurogenèse non seulement au cours du développement, mais aussi à l&#39;âge adulte. Postnatale et adultes produit neurogenèse hippocampique d&#39;une manière similaire impliquant de nombreux facteurs communs. Définir les mécanismes de régulation de ces facteurs sera très utile dans la compréhension des maladies neurodégénératives qui à son tour conduire à de nouv...

L&#39;hippocampe joue un rôle important dans la mémoire et l&#39;apprentissage ainsi que le comportement émotionnel. Une fonction principale consiste en la consolidation de la mémoire à court terme en mémoire à long terme, qui exige une forte plasticité du système nerveux. Le gyrus denté de l&#39;hippocampe joue le rôle de passerelle principale pour obtenir des informations d&#39;entrée et est également l&#39;une des deux régions du cerveau avec la neurogenèse continue à l&#39;âge adulte 1,2. Le développement de la structure de l&#39;hippocampe se produit à la fin de l&#39;embryogenèse et en particulier pendant la première 3 à 4 semaines après la naissance 3. Au début du développement de la gyrus denté un pool de cellules souches est établi nécessaire pour postnatale ainsi que la neurogenèse adulte 4. Les neurones en développement passent par différentes étapes, à partir de la cellule souche à travers plusieurs stades de cellules progénitrices immatures au neurone et enfin la maturité pendant postnatal ainsi que la neurogenèse adulte. À différentes étapes de la neurogenèse l&#39;expression degènes spécifiques est nécessaire pour permettre la maturation et l&#39;intégration de nouveaux neurones dans les circuits de l&#39;hippocampe 5,6. En utilisant la génétique de souris et analyse phénotypique par immunohistochimie ainsi que des méthodes moléculaires a permis de définir le profil d&#39;expression et la fonction d&#39;un grand nombre de ces gènes. Dans l&#39;analyse des microréseaux d&#39;addition ainsi que immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) fourni des informations sur les gènes cibles potentiels directs et indirects 7,8. Cependant, il ya encore beaucoup de questions ouvertes concernant les mécanismes de régulation de développement de l&#39;hippocampe, en particulier le développement du gyrus denté. Pour mieux comprendre comment les gènes spécifiques sont réglementés un système est nécessaire permettant la manipulation d&#39;un petit nombre de cellules par le bas ou vers le haut-régulation du gène d&#39;intérêt et / ou de ses gènes cibles et suivre leur sort au cours du développement. In utero électroporation des shRNA, ADNc de gènes d&#39;intérêt ou Cre recombinaSE fournit un tel outil. Pour garantir la présence de l&#39;ADN désiré ou petits ARN des plasmides d&#39;expression doit être utilisée pour l&#39;électroporation. Cette approche est mise en œuvre avec succès dans l&#39;étude du développement cortical 9,10, mais est une approche plus difficile l&#39;examen de l&#39;évolution de la gyrus denté en raison de la position des structures de l&#39;hippocampe dans les couches plus profondes du cerveau. Électroporation in utero Ex suivie par la culture organotypique est une approche pour contourner ce problème 11,12. Contrairement à électroporation in utero pas l&#39;embryon entier, mais seule la tête est utilisée permet donc de placer les électrodes d&#39;une manière plus favorable pour diriger le shRNA / ADN vers l&#39;hippocampe et le gyrus denté. Notre groupe a utilisé avec succès l&#39;électroporation ex utero pour étudier le rôle de facteur de transcription Bcl11b cours du développement du gyrus denté 8. Bcl11b a un double rôle dans le développement de gyrus denté par regulating prolifération de cellules souches ainsi que la différenciation comme cela a été démontré par immunohistochimie. Pour définir plus précisément un mécanisme d&#39;engagement Bcl11b dans ces procédés, les protocoles du groupe Polleux 11,12 ont été ajustés pour étudier le gyrus denté comme décrit ci-dessous dans la section de protocole. Dans une première approche de la question a été posée de savoir si Bcl11b réglemente neuronale cellule de la différenciation cellulaire autonome. Une deuxième approche a examiné si Desmoplakine, un gène cible directe de Bcl11b, est suffisante pour sauver le phénotype Bcl11b.

<table><tbody><tr><td>Extracteur de micropipettes flamboyantes/brunes</td><td>Sutter Instruments Company (États-Unis)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes en verre fin</td><td>Warner Instruments</td><td>G100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige, Japon</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Unité de support anesthésique</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0412</td><td></td></tr><tr><td>Vaporisateur Halovet</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PY2 34-0398</td><td></td></tr><tr><td>Système Fluovac</td><td>Appareil Harvard</td><td>PY2 34-0387</td><td></td></tr><tr><td>IMS Fluosorber</td><td>Appareil Harvard</td><td>PY2 34-0415</td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’anesthésie</td><td>Appareil Harvard</td><td>PY2 34-0460</td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>BEX Company</td><td>CUY21 EDIT</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler avec électrodes à disque</td><td>BEX Company</td><td>LF650P3</td><td>électrodes de 3 mm pour E15.5</td></tr><tr><td>Pince à épiler avec électrodes à disque</td><td>BEX Company</td><td>LF650P5</td><td>électrodes de 5 mm pour E18.5</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>P/N 052-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>HM 650 V Microtome à lame vibrante, 230 V</td><td>Thermo Scientific</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection</td><td>Carl Zeiss Microscopy Gmbh</td><td>Stemi SV8</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Leica</td><td>Leica DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Confocal</td><td>Leica</td><td>Sp5II</td><td></td></tr><tr><td>Plat 6 puits</td><td>BD Falcon</td><td>#353502</td><td></td></tr><tr><td>Plat 6 puits</td><td>CELLSTAR</td><td>#657160</td><td></td></tr><tr><td>Inserts de culture tissulaire</td><td>BD Falcon</td><td>#353090</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>#L2020</tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>#P5899</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Bonn extra fins</td><td>Outils scientifiques</td><td>fins 14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Dumont #55</td><td>11255-20 Inox</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Technologie de vie</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Technologie de vie BME</td><td></td><td>Référence 41010-26</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero l&#39;électroporation et organotypiques slice culture de souris hippocampe tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

La génétique de la souris offre un outil puissant pour déterminer le rôle de gènes spécifiques au cours du développement. L’analyse des phénotypes résultants par des méthodes immunohistochimiques et moléculaires fournit des informations sur les gènes cibles potentiels et les voies de signalisation. Pour élucider davantage les mécanismes de régulation spécifiques, il faut un système permettant de manipuler seulement un petit nombre de cellules d’un tissu spécifique par surexpression, ablation ou réintroduction de gènes spécifiques et de suivre leur destin au cours du développement. Pour réaliser cette électroporation ex utero des structures de l’hippocampe, en particulier du gyrus denté, suivie d’une culture en coupe organotypique, fournit un tel outil. L’utilisation de ce système pour générer des délétions en mosaïque permet de déterminer si le gène d’intérêt régule les processus de développement autonome des cellules, tels que la prolifération des cellules progénitrices ou la différenciation neuronale. De plus, il facilite le sauvetage des phénotypes en réintroduisant le gène supprimé ou ses gènes cibles. Contrairement à l’électroporation in utero, l’approche ex utero améliore le taux de ciblage réussi des couches plus profondes du cerveau, comme le gyrus denté. Dans l’ensemble, l’électroporation ex utero et la culture en tranches organotypiques constituent un outil puissant pour étudier les mécanismes de régulation dans un environnement semi-natif reflétant des conditions endogènes.

L&#39;ablation du facteur de transcription Bcl11b provoque l&#39;altération de la prolifération de cellules progénitrices et de la différenciation neuronale résultant en une taille de corps godronné et réduit le nombre de cellules. En outre neurones mutants ne parviennent pas à se intégrer dans les circuits de l&#39;hippocampe provoquant apprentissage et troubles de la mémoire 8. Pour répondre aux questions concernant le mécanisme (s) de réglementation des Bcl11b dans ces processus ex utero électropo...

Nous présentons ici un protocole fournissant un outil pour examiner les mécanismes de régulation de gènes spécifiques au cours du développement de l’hippocampe. L’utilisation de l’électroporation ex utero et de la culture de coupes organotypiques permet la régulation à la hausse et à la baisse de l’expression des gènes d’intérêt dans les cellules individuelles et suit leur destin au cours du développement.

Ex Utero L&#39;électroporation et organotypiques Slice culture de souris hippocampe Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

L'objectif général de cette procédure est de marquer et de modifier des cellules individuelles du gyrus denté et de suivre leur développement. Cela est réalisé en injectant d'abord de l'ADN dans un hémisphère cérébral au jour embryonnaire 15,5 ou 18,5. La deuxième étape consiste à électroporater l'ADN injecté dans la région en développement du gyrus denté.Des sections cérébrales suivantes sont préparées à l’aide d’un vibrotome, et les tranches de cerveau sont conservées en culture jusqu’à 14 jours. La dernière étape consiste en la coloration immunofluorescente des tranches cérébrales à l’aide d’anticorps appropriés. Enfin, une microscopie immunofluorescente confocale est utilisée pour mettre en évidence les modifications des cellules granuleuses modifiées du gyrus denté en développement.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la neurobiologie, comme le rôle de gènes spécifiques dans le développement de cellules neuronales particulières dans différentes régions cérébrales. Dans notre cas, le facteur de transcription BC 11 B dans le développement du gyrus. Commencez la procédure par la dissection de l'utérus d'une souris euthanasiée, contenant le

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous présentons une méthode pour préparer les tranches organotypiques d'embryons de souris mi-gestation pour la culture et de l'imagerie time-lapse d'excroissance des nerfs périphériques.

Culture organotypique d&#39;exprimant la GFP embryons de souris pour les images en temps réel d&#39;excroissance des nerfs périphériques

Pour procéder à une évaluation rapide de la fonction des gènes dans le développement du cortex cérébral, nous décrivons des procédés impliquant...

Méthodes pour l&#39;étude de la morphogenèse neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Électroporation ARNi dans embryonnaire cortex cérébral murin

Source : Keener, D. G., et al. Électroporation unicellulaire à travers différentes cultures de coupes organotypiques de neurones excitateurs et inhibiteurs spécifiques à la classe de souris. J. Vis. Exp. (2020).Cette vidéo démontre le processus d’électroporation d’une cellule unique pour introduire de l’ADN plasmidique dans les neurones des cultures de tranches d’hippocampe de souris. La procédure implique un positionnement précis de la pipette, des ajustements de pression et des impulsions...

Expression génique par électroporation de cellule unique dans des cultures de tranches d’hippocampe de souris

Cette vidéo démontre le protocole d’électroporation unicellulaire de gènes dans les neurones excitateurs et inhibiteurs à travers une gamme de cultures de coupes d’hippocampe in vitro. Cette technique est utile pour examiner les fonctions moléculaires et physiologiques spécifiques des neurones, y compris les mécanismes d’autonomie cellulaire et les interactions transsynaptiques entre les protéines.

Électroporation de cellules uniques dans des cultures de tranches de cerveau organotypiques : une technique in vitro pour délivrer des plasmides à l’intérieur de neurones ciblés dans des coupes d’hippocampe cérébral

Ce protocole décrit une procédure d'explantation amélioré qui...

Ex utero électroporation et explants hémisphère: Une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce

Nous décrivons ici une technique pour étudier la neurogenèse postnatale hippocampe en utilisant la technique de culture organotypique. Cette méthode permet la manipulation in vitro de la neurogenèse adulte et permet l'application directe d'agents pharmacologiques à l'hippocampe en culture.

Trancher les cultures organotypiques d&#39;études de neurogenèse postnatale

Ce manuscrit fournit des protocoles qui utilisent électroporation in utero (IUE) pour décrire la connectivité structurelle des neurones au niveau d'une seule cellule et l'excitabilité des neurones marqués par fluorescence. L'histologie est utilisé pour caractériser dendritique et projections axonales. enregistrement cellules entières en tranches aiguës est utilisée pour étudier l'excitabilité.

In Utero électroporation approches pour étudier l&#39;excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire

Ce protocole fournit des instructions pour l'observation directe des neurones corticaux migrant radialement. L' électroporation in utero , la culture de tranche organotypique et l'imagerie confocale temporelle sont combinés pour étudier directement et dynamiquement les effets de la surexpression ou la régulation négative des gènes d'intérêt dans les neurones migrateurs et d'analyser leur différenciation au cours du développement.

L&#39;imagerie confocale temporelle des neurones migrateurs dans la culture de tranches organotypiques du cerveau embryonnaire de souris en utilisant<em&gt; Dans Utero</em&gt; Electroporation

Ici, nous fournissons une méthode fiable et peu coûteuse pour générer organotypiques électroporation cerveau d’embryons de souris appropriés pour la microscopie confocale et techniques d’imagerie en direct.

Ex Utero Électroporation et culture organotypique tranche de cerveaux de souris embryonnaires pour vivre-imagerie de la migration des interneurones GABAergiques

Présenté ici est un protocole pour l’électroporation unicellulaire qui peut livrer des gènes dans les neurones excitateurs et inhibiteurs à travers une gamme d’âges in vitro de culture de tranche hippocampique. Notre approche fournit une expression précise et efficace des gènes dans des cellules individuelles, qui peuvent être utilisées pour examiner les fonctions cellulaires autonomes et intercellulaires.

Électroporation unicellulaire à travers différentes cultures de tranches organotypiques de neurones excitateurs excitateurs de l’hippocampe de souris et de neurones inhibiteurs spécifiques à une classe

Ce protocole démontre une méthode simple et robuste pour étudier la croissance in situ des axones et la dynamique des cônes de croissance. Il décrit comment préparer ex vivo des tranches de cerveau aiguës physiologiquement pertinentes et fournit un pipeline d’analyse convivial.

In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës

Apprenez l'électroporation ex utero et la culture de tranches organotypiques pour étudier le développement du gyrus denté chez la souris. Cette méthode permet de marquer et modifier des cellules individuelles.

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