Busulfan comme agent myélosuppressive pour générer de haut niveau stable de moelle osseuse chez des souris chimérisme

L'objectif général de cette procédure est de remplacer le compartiment de la moelle osseuse de souris receveuses par des cellules de moelle osseuse provenant de souris donneuses exprimant de manière ubiquitaire la protéine fluorescente verte, en l'absence d'irradiation. Ceci est réalisé en conditionnant d'abord la souris receveuse à l'aide d'injections intrapéritonéales répétées du composé myélosuppresseur busulfan.

Ensuite, les cellules de la moelle osseuse sont isolées à partir des fémurs et des tibias d'une souris donneuse exprimant de manière ubiquitaire la protéine fluorescente verte. Enfin, les cellules de la moelle osseuse du donneur sont transplantées dans la souris receveuse conditionnée par injection intraveineuse dans la queue. En définitive, le sang est prélevé chez la souris transplantée et analysé par cytométrie en flux afin d'estimer le degré de chimérisme de la moelle osseuse.

Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'irradiation corporelle totale sont qu'un degré élevé de chimérisme médullaire peut être obtenu sans les effets cytotoxiques de l'irradiation corporelle totale et sans nécessiter d'installations ni d'équipements spécialisés. Cette méthode permet non seulement d'étudier l'accumulation de cellules d'origine médullaire dans le système nerveux central, mais peut également être utilisée pour examiner des sujets de recherche tels que le développement des lignées hématopoïétiques, l'immunobiologie et la leucémie. Pour préparer les souris receveuses, préparez du busulfan dilué conformément au protocole décrit dans le texte et administrez par injection intrapéritonéale 20 milligrammes par kilogramme aux souris receveuses chaque jour.

Après avoir euthanasié les souris conformément aux directives institutionnelles, vaporisez de l’éthanol à 70 % sur une souris sous une hotte à flux laminaire. Soulevez la peau au niveau de l’abdomen et, à l’aide de ciseaux chirurgicaux, pratiquez une incision dans la peau depuis la cavité abdominale, en remontant le long de la jambe vers la cheville en tenant le pied. Tirez fermement la peau de la cheville vers la hanche afin d’exposer le tissu de la jambe.

Retirez les muscles et la graisse du fémur afin d'exposer l'articulation de la hanche tout en tirant doucement sur le pied. Pour étendre la jambe, appuyez les ciseaux contre les os du bassin et coupez juste au-dessus de la tête du fémur, en prenant soin de ne pas sectionner le fémur lui-même. Pour aider à maintenir l'asepsie, tenez la jambe par le pied et nettoyez les tissus résiduels sur le fémur à l'aide de ciseaux, puis utilisez des tissus stérilisés à l'autoclave pour frotter la surface de l'os.

Séparez le fémur et le tibia en coupant à travers l'articulation du genou, puis placez le fémur dans une boîte de culture contenant du PBS et incubez sur de la glace. Ensuite, retirez et jetez la fibula en coupant aux points où elle se relie au tibia. Puis nettoyez le tibia.

Retirez le pied en coupant le tibia là où la moelle rouge se termine, puis placez le tibia dans la boîte de culture avec le fémur et incubez sur de la glace. Utilisez une pince pour maintenir le fémur et, avec des ciseaux chirurgicaux, rasez soigneusement les extrémités distales de l’os. Retirez le moins de tissu osseux possible afin d’exposer la cavité médullaire avec trois millilitres de PBS stérile.

Remplissez une seringue et fixez une aiguille de calibre 23. Introduisez soigneusement l’aiguille dans la cavité médullaire et rincez la moelle osseuse dans une boîte de culture stérile. Utilisez la pointe de l’aiguille pour racler la cavité médullaire afin de garantir l’élimination de toutes les cellules souhaitées après l’extraction.

Veillez à ce que la moelle osseuse rouge ne soit plus visible et que l'os apparaisse désormais blanc. À l'aide de pinces, maintenez le tibia et, avec des ciseaux chirurgicaux, rasez soigneusement l'extrémité où le tibia était attaché au genou. Pour exposer la cavité médullaire, remplissez une seringue avec trois millilitres de PBS stérile et fixez-y une aiguille de calibre 25.

Introduisez soigneusement l'aiguille dans la cavité médullaire et rincez la moelle osseuse dans la boîte contenant la moelle osseuse prélevée des fémurs. À l'aide d'une pipette de 1 millilitre, dissociez délicatement la moelle osseuse pour séparer les cellules. Filtrez la suspension cellulaire à travers un filtre maille 40 micromètres dans un tube stérile de centrifugeuse de 50 millilitres.

Utilisez du PBS pour rincer la boîte afin de récupérer les cellules restantes et faites passer le tampon à travers le filtre dans le tube de centrifugation. Ajoutez du PBS dans le tube pour obtenir un volume final de 30 à 40 millilitres et centrifugez à 450 ×g et 4 °C pendant cinq minutes. Ensuite, retirez et jetez le surnageant.

Resuspendre le culot avec trois millilitres de tampon lysant des érythrocytes, puis incuber sur de la glace pendant 8,5 minutes. Ensuite, ajouter environ 30 millilitres de PBS stérile pour arrêter l'action du tampon lysant, centrifuger et jeter le surnageant. Utiliser un millilitre de PBS stérile pour resuspendre le culot et le maintenir sur de la glace.

Avec du PBS, diluez une petite quantité d'homogénat cellulaire et comptez les cellules à l'aide d'un hémocytomètre. Diluez la suspension cellulaire à huit fois 10 puissance six cellules par millilitre et incubez sur glace jusqu'à l'injection. Pour réaliser la transplantation de moelle osseuse, ajoutez 300 microlitres de la suspension cellulaire diluée dans une seringue de 0,5 millilitre.

Pour chaque souris à injecter, veillez à éliminer toutes les bulles d'air. Placez la cage de souris avec les souris réceptrices conditionnées sur un tapis chauffant et laissez les veines latérales de la queue se dilater. Placez une souris réceptrice dans un dispositif de contention de taille appropriée, essuyez la queue avec un tampon de gaze chirurgicale imbibé d'éthanol à 70 %, maintenez fermement la queue et insérez délicatement l'aiguille, avec la face biseautée vers le haut, dans l'une des veines latérales de la queue, puis injectez la suspension cellulaire.

Appliquez une compresse chirurgicale sur le site d'injection jusqu'à l'arrêt du saignement. Avant de placer la souris dans une nouvelle cage propre, environ deux à trois semaines après la greffe de moelle osseuse, placez la souris dans un tube de contention et rasez le poil de la patte postérieure afin d'exposer la veine saphène latérale. Ensuite, appliquez une fine couche de vaseline sur la patte et percez la veine saphène à l'aide d'une micropipette capillaire enduite d'héparine et d'une aiguille de calibre 25.

Prélvez environ 50 microlitres de sang, puis utilisez un pansement stérile pour arrêter l'hémorragie. Une fois l'hémorragie arrêtée, remettez la souris dans sa cage. Ajoutez le sang à un tube de microcentrifugeuse contenant un millilitre de tampon fax.

Mélangez le tube par retournement et placez-le sur de la glace. Centrifugez les échantillons de sang à 900 ×g pendant cinq minutes. Après avoir retiré et jeté le surnageant, utilisez 500 microlitres de tampon de lyse des érythrocytes pour resuspendre le culot et incubez sur de la glice pendant 8,5 minutes. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon fax pour bloquer l'action du tampon de lyse et centrifugez à 900 ×g pendant cinq minutes.

Après avoir lysé et centrifugé une deuxième fois, conformément au protocole décrit, vérifiez que le culot est désormais blanc. S'il est rouge, répétez l'étape de lyse une troisième fois en resuspendant. Suspendez le culot dans du tampon fax et utilisez la cytométrie en flux pour quantifier la proportion de cellules positives pour la GFP.

Ce graphique montre les niveaux de chimérisme quantifiés hebdomadairement dans le sang périphérique de souris conditionnées avec 100 milligrammes par kilogramme de busulfan recevant une greffe de moelle osseuse syngénique réussie, et de souris conditionnées avec 80 milligrammes par kilogramme de busulfan recevant une greffe de moelle osseuse allogénique infructueuse. Des niveaux de chimérisme supérieurs à 80 % sont généralement établis entre trois et quatre semaines après la greffe de moelle osseuse ; les données représentatives présentées ici proviennent d’analyses de sang périphérique montrant une greffe de moelle osseuse réussie et une greffe infructueuse trois semaines après la transplantation. Ces données de cytométrie en flux montrent qu’un degré élevé de chimérisme persiste pendant au moins un an dans la moelle osseuse, et que le conditionnement avec le véhicule n’est pas suffisant pour induire un chimérisme médullaire.

Bien qu'il n'existe aucune différence significative dans les niveaux de chimères de moelle osseuse obtenus avec des doses de busulfan comprises entre 60 et 100 milligrammes par kilogramme, les cellules positives pour la GFP s'accumulent au sein du système nerveux central de manière dépendante de la dose. Cette figure illustre l'accumulation de cellules dérivées de la moelle osseuse positives pour la GFP dans la région lombaire de la moelle épinière chez une souris de type sauvage, et dans une moindre mesure chez un modèle murin de la maladie neurodégénérative appelée sclérose latérale amyotrophique. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important d'utiliser des souris receveuses et donneuses syngéniques de même sexe afin de minimiser le risque de rejet de la greffe après cette procédure.

D'autres méthodes, telles que la cytométrie en flux et l'immunohistochimie, peuvent être utilisées afin d'étudier les mécanismes par lesquels les cellules issues de la moelle osseuse pénètrent dans le système nerveux central.