Name: Forward Génétique écrans à laide pour identifier les macrophages Toxoplasma gondii gènes importants pour la résistance à lIFN-γ-cellulaire dépendant immunité autonome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Découvrez la génétique directe pour identifier les gènes de Toxoplasma gondii impliqués dans l'évasion immunitaire dans les macrophages. Cette méthode révèle les mécanismes de l'immunité cellulaire autonome.

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Un merci spécial au Dr Peter Bradley pour l’anticorps permettant de détecter les mitochondries de T. gondii. Le travail a été soutenu par des subventions du National Institute of Health AI072028 et AI107431 à D.G.M et un don généreux au New York Medical College pour l’étude de la médecine tropicale.

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le protocole décrit fournit une approche non biaisée qui utilise l&#39;activation des macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris et de la génétique à terme pour isoler T. gondii mutants avec un défaut dans leur capacité à survivre activation des macrophages infectés. Le phénotype des mutants activation des macrophages suivante tombe généralement dans l&#39;une des deux grandes catégories: 1) Les parasites apparaissent intacts mais ne parviennent pas à reproduire au-delà de 1 parasite par PV; 2) Les para...

Toxoplasma gondii (T. gondii) est un intracellulaire obligatoire, pathogène protozoaire. Il est l&#39;agent causal de la toxoplasmose, un danger pour la santé chez les personnes immunodéprimées. Ce est aussi le système de modèle pour d&#39;autres agents pathogènes qui infectent les humains apicomplexes y compris Cryptosporidium et Cyclospora. La toxoplasmose est le plus souvent acquise par l&#39;ingestion d&#39;aliments ou d&#39;eau contaminés par le stade du parasite bradyzoïte ou oocystes. Lors de l&#39;ingestion, ces étapes se convertir à l&#39;étape de tachyzoïtes du parasite qui se réplique à l&#39;intérieur des cellules hôtes et diffuse de manière systémique. Lymphocytes T, l&#39;IFN-γ et, dans une moindre mesure, de l&#39;oxyde nitrique 4/1, sont importants pour le contrôle de l&#39;infection mais ne sont pas capables d&#39;éliminer la maladie, dans une proportion de tachyzoïtes convertir à l&#39;étape de bradyzoite qui sont protégés à l&#39;intérieur de kystes tissulaires résultant en une infection chronique à long terme. En fait, il ne existe pas de thérapies efficaces contre le kyste chronique stage de la maladie. Toxoplasmose sévère est le plus souvent due à la réactivation d&#39;une infection persistante, avec le stade de bradyzoïte du parasite reconversion à la caractéristique de scène tachyzoïte répliquer rapidement de l&#39;infection primaire et aiguë. La survie au début de la face de la réponse immunitaire innée est important de permettre au parasite à atteindre nombre de parasites suffisantes, ainsi que pour atteindre les sites distales, pour permettre l&#39;établissement d&#39;une infection chronique. T. gondii a développé des stratégies pour lutter contre les mécanismes de défense de l&#39;hôte qui contribuent probablement sa capacité à reproduire et diffuser au début de l&#39;infection. Premièrement, T. gondii constitue un PV unique lors de l&#39;invasion parasitaire qui est en grande partie séparé des processus d&#39;endocytose et d&#39;exocytose de la cellule hôte par rapport à d&#39;autres agents pathogènes intracellulaires 5-9. En outre, comme tous les succès intracellulaire pathogènes T. gondii modifie sa cellule hôte pour créer un environnement permissif fou la croissance. Cela comprend la reprogrammation hôte d&#39;expression génique des cellules en modifiant les facteurs de transcription de la cellule hôte, y compris ceux qui sont importants pour la régulation de l&#39;activation des cellules 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, 21 et GRA16 GRA24 22 ont tous été montré pour être importante dans la régulation de la réponse transcriptionnelle de signalisation cellulaire et des cascades de cellules hôtes infectées avec T. gondii. Des études récentes utilisant des croisements génétiques entre les souches de parasites avec des phénotypes distincts ont été très productif dans l&#39;identification des gènes parasitaires qui sous-tendent traits parasites génotype dépendant notamment de fraude liées à l&#39;immunité GTPases (IRGS) 16,19,23-26. Chez la souris, l&#39;immunité liée GTPases (IRGS) sont essentiels pour le contrôle de type II et III génotypes du parasite tandis que le type très virulente je génotypes ont développé des mécanismes pour échapper aux IRGS murins. Cependant, il est également clair que le parasite a développé des mécanismes pour échapper médias antimicrobienteurs, en plus des IRGS et que certains de ces mécanismes peuvent être conservées à travers les génotypes de parasites 27,28. En outre, on sait très peu sur les médiateurs critiques de l&#39;immunité cellulaire contre autonome T. gondii pendant la toxoplasmose humaine. Parasite gènes importants pour la résistance aux médiateurs de l&#39;immunité cellulaire autonome peuvent également être importantes pour la survie au cours tachyzoïte à bradyzoïte conversion qui peut également être déclenché par les réponses immunitaires de l&#39;hôte. Par exemple, l&#39;oxyde nitrique à des niveaux élevés peut supprimer la réplication du parasite dans les macrophages infectés, mais il peut aussi stimuler tachyzoïte à bradyzoïte conversion résultant de la production de kystes 30-32. ToxoDB est une base de données de génomique fonctionnelle pour T. gondii qui fonctionne comme une ressource essentielle pour le domaine en termes de fournir des informations de séquence du génome du parasite et l&#39;accès à des données publiées et non publiées de l&#39;échelle du génome, y compris les annotations de la communauté, le gène exp<html> écrêtages et protéomique données 33. Comme pour de nombreux agents pathogènes protozoaires, la majorité du génome est constitué de gènes hypothétiques avec aucune information disponible sur la base d&#39;homologie de gène de donner un aperçu de leurs fonctions potentielles. Ainsi, la génétique à terme est un outil puissant pour identifier de nouveaux gènes importants pour échapper au système immunitaire, la conversion de kyste et d&#39;autres fonctions critiques pour la pathogenèse du parasite ainsi que pour la conversion entre les stades de développement distincts parasites. Une force supplémentaire vers l&#39;avant de la génétique est qu&#39;il peut être utilisé comme une approche relativement non biaisé pour interroger le parasite à des gènes qui sont importants pour des tâches spécifiques, y compris dans la pathogenèse évasion immunitaire et la formation de kystes. De récentes améliorations dans le séquençage de prochaine génération pour le profilage mutationnel ont fait une méthode de choix pour l&#39;identification des gènes responsables de parasites avant les études de génétique par mutagenèse chimique et insertion 34-37. MÉNAGEMENT &quot;&gt; Il est important d&#39;identifier les vulnérabilités dans T. gondii qui peuvent être exploitées pour améliorer l&#39;efficacité des mécanismes immunitaires autonomes cellulaires contre le parasite en particulier ceux qui peuvent également être actif contre le stade de kyste résistant. Vers ce but, in vitro murin l&#39;infection des macrophages et le modèle d&#39;activation a été développé pour identifier des mutations dans le parasite qui altère spécifiquement T. gondii remise en forme suite à l&#39;activation des macrophages infectés, mais pas dans les macrophages naïfs. Cet écran de macrophages a été utilisé pour interroger une bibliothèque de T. gondii mutants d&#39;insertion pour finalement identifier les gènes de T. gondii importants pour la résistance à l&#39;oxyde nitrique 27,28. L&#39;isolement d&#39;un panel de mutants de T. gondii avec facultés affaiblies résistance à l&#39;activation des macrophages infectés, en particulier une sensibilité marquée à l&#39;oxyde nitrique, prouvé l&#39;utilité de l&#39;écran pour identifier des gènes pour la résistance parasites importantsde médiateurs de l&#39;immunité cellulaire autonome autre que les mécanismes de résistance décrites pour les IRGS 28 murins. Mutagenèse insertionnelle a des avantages sur mutagenèse chimique en termes de génération d&#39;un nombre limité de mutations aléatoires dans chaque clone parasitaire et, en théorie, une identification plus facile du site de mutation. Toutefois, l&#39;identification du site d&#39;insertion du génome du plasmide en T. mutants d&#39;insertion gondii, dans la pratique, a été étonnamment difficile dans de nombreux cas 37. L&#39;insertion d&#39;un gène dans un plasmide est également susceptible de perturber la fonction d&#39;un gène, contrairement à une mutagenèse chimique qui se traduit généralement par des changements d&#39;un seul nucleotide. Cependant, une mutagenèse chimique avec soit la N-éthyl-N-nitrosourée (ENU) ou un sulfonate d&#39;éthylméthane (EMS) peut offrir une plus grande capacité d&#39;analyser une plus grande portion du génome du parasite, par rapport à une mutagenèse insertionnelle, car il crée plusieurs polymorphismes nucléotidiques simples ( estimé à 10 -100) par mutant 34, 38. En outre, les progrès récents dans le profilage du génome entier a permis d&#39;utiliser le séquençage de prochaine génération pour identifier les gènes candidats les plus probables responsables du phénotype identifié d&#39;un parasite muté 34,38. Indépendamment de l&#39;approche de mutagenèse, la confirmation du rôle du gène parasite dans la résistance à l&#39;activation des macrophages nécessite finalement délétion du gène et la complémentation de remplir les postulats de Koch moléculaire. La capacité de disséquer la fonction d&#39;un gène par manipulation génétique à la fois du parasite et le macrophage est important car un grand nombre des gènes identifiés par l&#39;avant génétique dans T. gondii, ainsi que d&#39;autres agents pathogènes, se caractérisent encore en tant que gènes hypothétiques avec peu ou pas d&#39;homologie de séquence avec d&#39;autres protéines ayant des fonctions connues. Le présent document décrit une méthode générale qui peut être utilisée pour déterminer si le gène disrupté dans un mutant est important pour la résistance à un connue ouinconnue médiateur de l&#39;immunité cellulaire autonome. L&#39;analyse initiale des hôtes facteurs antimicrobiens est effectué en évaluant la survie de type sauvage et les parasites mutants dans les macrophages de souris de type sauvage par rapport à celles présentant des délétions de gènes spécifiques dans synthase inductible de l&#39;oxyde nitrique (iNOS), GP-91 phox (NADPH oxydase), et liées à l&#39;immunité GTPases spécifiques (IRGS). Cela permettra de déterminer si les gènes parasites identifiés sont importants pour la résistance à l&#39;oxyde nitrique, intermédiaires réactifs de l&#39;oxygène ou de l&#39;immunité liée GTPases 28 respectivement ou si un mécanisme immunitaire inconnu est impliqué. Activation des macrophages infectés à la fois avec l&#39;IFN-γ et LPS, décrites dans le protocole actuel, résulte principalement de l&#39;isolement de gènes importants pour la résistance du parasite à l&#39;oxyde nitrique 28. L&#39;utilisation d&#39;agents pharmacologiques qui induisent l&#39;oxyde nitrique en l&#39;absence d&#39;activation des macrophages (donneurs d&#39;oxyde nitrique) a confirmé que la majorité des gènes identifiés étaient importantes pour rerésistance à l&#39;oxyde nitrique plutôt que l&#39;oxyde nitrique de concert avec des médiateurs supplémentaires associés à l&#39;activation des macrophages 28. Étape un et deux décrivent un écran de génétique avant conçu pour isoler des mutants parasites avec un défaut de remise en forme suite à l&#39;activation des macrophages dérivés de la moelle osseuse infectée in vitro. Première étape décrit une analyse de titrage de dose pour déterminer empiriquement une dose de γ et LPS IFN à utiliser pour l&#39;activation des macrophages qui réduit la réplication du parasite mais ne inhibe pas complètement la réplication du type sauvage T. gondii souche parentale qui est utilisé pour la création de la banque de mutants de parasites. Deuxième étape décrit l&#39;écran vers l&#39;avant génétique des clones mutants dans des macrophages dans les plaques à 96 puits. Étape trois présente une approche pour confirmer le phénotype de chaque mutant identifié dans l&#39;écran des plaques à 96 puits et d&#39;évaluer si le défaut de chaque mutant affecte la survie du parasite, la réplication,ou la production de kyste en réponse à l&#39;activation des macrophages. Etape quatre décrit l&#39;utilisation de macrophages dérivés de la moelle osseuse provenant de souris avec des deletions dans les voies d&#39;antimicrobiens pour identifier les médiateurs immunitaires à laquelle le mutant est particulièrement sensible parasite. Cinquième étape décrit une méthode pour déterminer si un mutant de parasite est également compromise par pathogenèse in vivo tel qu&#39;évalué par la production de kystes dans les cerveaux de souris infectées.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH3008101</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29101& productId=3255471& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>Thermo</td><td>SH3091003</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=11737973& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone DPBS</td><td>Thermo</td><td>SH3002802&nbsp ;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2434305& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType =PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamine</td><td>Thermo</td><td>SH3003401&nbsp ;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3311957& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType =PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone Pen streptocoque</td><td>Thermo</td><td>SV30010&nbsp ;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668 6& catalogId=29104& matchedCat Non=SV30010& fromSearch=1& searchKey=SV30010& highlightPro ductsItemsFlag=Y& endecaSearch Query= %23store %3DRE_SC %23nav %3D0%23rpp %3D25%23offSet %3D0%23keyWord %3DSV30010%2B %23searchType %3DPROD %23SWKeyList %3D %5B %5D& xrefPartType=De& économies = 0,0 et xrefEvent=1407777949003_0 et searchType=PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Hyclone Hanks BSS</td><td>Thermo</td><td>SH3003002</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3064595& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>LPS</td><td>LIST biologicals</td><td>201</td><td>http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords =LPS_from_ %3Cem %3EEscherichia_coli %3C/em %3E_O111 :B4</td></tr><tr><td>IFN-&#947 ;</td><td>Pepro Tech Inc</td><td>50-813-664</td><td>https ://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail ?itemdetail='item'&storeId=10652& productId=2988494& catalogId=29 104& matchedCatNo=50813664& fromSearch=1& searchKey=murine+ifn+pepro+tech& highlightProductsItemsFlag =Y& endecaSearchQuery= %23store %3DRE_SC %23nav %3D0%23rpp %3D25%23offSet %3D0%23keyWord %3Dmurine %2Bifn %2Bpepro %2Btech %23searchType %3DPROD %23SWKeyList %3D %5B %5D& xrefPartType=De& économies =0,0 xrefEvent=1407778210608_ 12& searchType=PROD& hasPromo =0</td></tr><tr><td>Lames de chambre</td><td>Thermo</td><td>177402</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2164545& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Plaques optiques à 96 puits</td><td>Thermo</td><td>165306</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3010670& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 96 puits</td><td>Fisher</td><td>353072</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3158736& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Culture tissulaire flast T25</td><td>Fisher</td><td>156367</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039 67& catalogId=29104& matchedCat Non=12565351& fromSearch=1& searchKey=156367& highlightProdu ctsItemsFlag=Y& endecaSearchQu ery= %23store %3DRE_SC %23nav %3D0%23rpp %3D25%23offSet %3D0%23keyWord %3D156367%23searchType %3DPROD %23SWKeyList %3D %5B %5D& xrefPartType=De& économies =0,0 xrefEvent=1407778974800_ 0& searchType=PROD& hasPromo =0</td></tr><tr><td>Ted Pella grade EM formaldéhyde</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td>http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=3425922& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=1</td></tr><tr><td>Alexa 488 - kit de conjugaison des protéines</td><td>Life Technologies</td><td>A20181</td><td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235</td></tr><tr><td>sérum de chèvre</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19135680</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2133236& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& crossRefData =ICN19135680=2& searchType =PROD& hasPromo=0</td></tr><tr><td>Média de montage Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H1200</td><td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428</td></tr><tr><td>Dolichos conjugués FITC</td><td>Vector Labs</td><td>FL-1031</td><td>https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188</td></tr><tr><td>Anticorps contre LAMP1</td><td>Études de développement Hybridoma Bank</td><td>http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker</td><td>Life Technologies</td><td>L-7526</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product</td></tr><tr><td>souris C57BL6</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html</td></tr><tr><td>gp91 phox knock out souris</td><td>Jackson Labaoratories</td><td>2365</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html</td></tr><tr><td>souris iNOS knock out</td><td>Jackson Laboratories</td><td>2609</td><td>http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html</td></tr><tr><td>nitroprussiate de sodium ACROS</td><td>Organics</td><td>AC21164-0250&nbsp ;</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2627727& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=1</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>ACROS Organics</td><td>AC32865-0250</td><td>https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog Id=29104& productId=2252389& dis type=0& highlightProductsItemsFlag =Y& fromSearch=1& searchType= PROD& hasPromo=1</td></tr><tr><td>Souris monoclonale anti-Toxoplasma gondii Ab</td><td>Fitzgerald Industries International</td><td>10T19A</td><td>http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947</td></tr></tbody></table>

forward génétique écrans à l&#39;aide pour identifier les macrophages<em&gt; toxoplasma gondii</em&gt; gènes importants pour la résistance à l&#39;ifn-γ-cellulaire dépendant immunité autonome

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, l’agent causal de la toxoplasmose, est un protozoaire pathogène intracellulaire obligatoire. Le parasite envahit et se réplique dans pratiquement tous les types de cellules de vertébrés à sang chaud. Lors de l’invasion d’une cellule hôte, le parasite crée une vacuole parasitophore (PV) qui provient de la membrane de la cellule hôte, indépendamment de la phagocytose dans laquelle le parasite se réplique. Bien que l’immunité innée dépendante de l’IFN et à médiation cellulaire soit importante pour le contrôle éventuel de l’infection, les cellules immunitaires innées, y compris les neutrophiles, les monocytes et les cellules dendritiques, peuvent également servir de véhicules pour la dissémination systémique du parasite au début de l’infection. Une approche est décrite qui utilise la réponse immunitaire innée de l’hôte, dans ce cas les macrophages, dans un criblage génétique avancé pour identifier les mutants parasites présentant un défaut de fitness dans les macrophages infectés après activation, mais l’invasion et la réplication normales dans les macrophages naïfs. Ainsi, le crible isole les mutants parasites qui ont un défaut spécifique dans leur capacité à résister aux effets de l’activation des macrophages. L’article décrit deux grands phénotypes de parasites mutants suite à l’activation de macrophages infectés : la stase parasitaire par rapport à la dégradation du parasite, souvent dans des vacuoles amorphes. Les mutants du parasite sont ensuite analysés pour identifier les gènes parasitaires responsables spécifiquement importants pour la résistance aux médiateurs induits de l’immunité autonome cellulaire. L’article présente une approche générale pour le criblage génétique avancé qui, en théorie, peut être modifiée pour cibler les gènes du parasite importants pour la résistance à des médiateurs antimicrobiens spécifiques. Il décrit également une approche visant à évaluer les médiateurs antimicrobiens spécifiques des macrophages auxquels le mutant du parasite est sensible. L’activation des macrophages infectés peut également favoriser la différenciation du parasite du stade tachyzoïte au stade bradyzoïte qui maintient l’infection chronique. Par conséquent, une méthodologie est présentée pour évaluer l’importance du gène du parasite identifié dans l’établissement de l’infection chronique.

Toxoplasma gondii reproduit librement dans les macrophages naïfs et a un temps de doublement entre 6-12 h en fonction de la souche du parasite. La figure 1 montre parasites représentatifs de naïf par rapport macrophages dérivés de la moelle osseuse activées. La figure 2 montre la morphologie générale de parasites dans HFF des cellules hôtes à 2, 4, 8, 16 et 32 ​​parasites / PV. Dans le protocole actuel, le parasite est autorisé à envahir macrophages naïfs et d&#39;établir une v...

La génétique avancée est une approche puissante pour identifier les gènes des pathogènes intracellulaires importants pour la résistance à l’immunité autonome cellulaire. L’approche actuelle utilise des cellules immunitaires innées, en particulier des macrophages, pour identifier de nouveaux gènes de Toxoplasma gondii importants pour l’évasion immunitaire.

Forward Génétique écrans à l&#39;aide pour identifier les macrophages<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; gènes importants pour la résistance à l&#39;IFN-γ-cellulaire dépendant immunité autonome

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

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