Name: Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et Ex Vivo Culture cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Apprenez à isoler les lymphocytes T résidents de la peau humaine pour analyse phénotypique et culture ex vivo. Cette méthode combine dissociation mécanique et enzymatique pour obtenir des cellules viables en quantité suffisante.

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Les biopsies cutanées de patients atteints de psoriasis ont été aimablement fournies par le Dr Andreas Koerber (département de dermatologie à l&#39;Université d&#39;Essen, Allemagne) après accord oral ou écrit éclairé à usage scientifique. XH est également soutenu par NSFC 61263039 et 11101321 NSFC.

NOTE: Les biopsies cutanées provenant d&#39;individus sains ont été obtenus à partir des restes de l&#39;abdomen de la peau des individus subissant une chirurgie plastique facultative après accord oral ou écrit éclairé à usage scientifique. L&#39;utilisation de la peau humaine a été approuvé et en conformité avec les règlements établis par les comités d&#39;éthique médicale pour la recherche humaine du centre médical universitaire Radboud, Nijmegen, aux Pays-Bas et de l&#39;Université d&#39;Essen, en Allemagne. 1. Préparation de la cellule unique Suspensions de la peau humaine (travail stérile dans un flux d&#39;armoire si la suite Culture cellulaire est requis) <ol><li> Préparer un milieu de culture cellulaire: RPMI 1640 + pénicilline / streptomycine (concentrations finales de 100 unités / ml et 100 pg / ml, respectivement) + pyruvate (0,02 mM) et du glutamax (0,02 mM), sans sérum ajouté. </li><li> Préparer le milieu de culture complet: milieu de culture préparé à l&#39;étape 1.1 + 10% de sérum humain rassemblé (HPS); stocker à 4 ° C. Apportez moyenne à 20 ° C ± 2 devant nousing. </li><li> Obtenir la biopsie de la peau à l&#39;aide d&#39;un instrument de biopsie de poinçon rond 4mm et le garder dans RPMI1640 milieu de culture complet à 20 ° C ± 2 pour un maximum de 4 heures ou à 4 ° C ON. Traiter la biopsie dès que possible après leur arrivée au laboratoire. REMARQUE: un stockage prolongé de la peau aura une influence sur le rendement de la cellule et la viabilité des cellules. </li><li> Etiqueter un tube de dissociation bleu-capped et ajoutez 5 ml de milieu de culture complet dans le tube étiqueté. </li><li> Ajouter 2 ml de milieu de culture complet dans chaque puits (au total 3 puits) d&#39;un 6 puits plaque de culture stérile. Utiliser des outils stériles pour placer la biopsie dans un seul puits, rincer, le déplacer vers un second puits et répétez cette étape une fois de plus, réalisant ainsi un total de trois rinçages. </li><li> Transférez la biopsie bien rincés de la peau à une boîte de Petri stérile, ajouter 100 ul de milieu de culture complet sur le dessus de la biopsie, et soigneusement gratter le tissu adipeux sous-cutané à l&#39;aide d&#39;un scalpel stérile jetable en acier inoxydable. NOTE: Thest est une étape critique. </li><li> Couper chaque biopsie de la peau en 4 morceaux plus petits sur une boîte de Pétri stérile. Des échantillons de transfert (jusqu&#39;à quatre biopsies de 4 mm par tube) dans le tube de dissociation préparée contenant 5 ml de milieu de culture complet. </li><li> Bien refermer les tubes avec le bouchon, et fixer la tête en bas sur le manchon du dissociateur de tissu automatisé. Assurez-vous que tout le matériau d&#39;échantillon est situé dans la zone du rotor. </li><li> Démarrer le processus de dissociation en exécutant le &quot;_01 programme m_spleen&quot; (un programme prédéfini fourni par la mémoire interne de l&#39;instrument ou par la carte de programme accompagné) de dissocier la biopsie à la vitesse de rotation appropriée pour 56 sec. </li><li> Après le traitement, détacher le tube de dissociation de la dissociateur et assurez-vous que tout le matériel dissocié est recueilli au fond du tube. </li><li> Ajouter 150 ul collagénase IA (80 mg / ml) dans le tube de dissociation et incuber l&#39;échantillon dans un bain d&#39;eau agité à 37° C pendant 60 min. Ajouter 100 ul de DNase I (5 MU / ml) dans le tube de thedissociation, bien mélanger. Remarque: Une plus forte concentration de la collagénase ou de plus longue durée d&#39;incubation va modifier la viabilité cellulaire. </li><li> Fixez le tube de dissociation au manchon du dissociateur de tissu automatisé et exécuter le programme &quot;m_ rate _01&quot; de dissocier la biopsie une fois de plus. </li><li> Placer une cellule de nylon tamis de 70 pm sur la partie supérieure d&#39;un tube Falcon de 50 ml. Appliquer des matériaux d&#39;échantillons dissociées à ce tamis cellulaire pour éliminer les amas de cellules / débris de tissu. </li><li> Laver tamis cellulaire une fois avec 5 ml de milieu de culture complet. Centrifuger à 20 ° C ± 2 450 g pendant 10 min et le surnageant aspiré. </li><li> Répétez l&#39;étape de lavage une fois de plus. Remettre en suspension les culots de cellules dans 300 ul de milieu de culture complet. Les suspensions de cellules uniques sont prêts pour une analyse plus approfondie; poursuivre avec les protocoles de culture ex vivo de cellules ou une analyse par cytométrie en flux. </li><li> En cas de nouvelle intracellular coloration des cytokines, stimulent les cellules avec du PMA (12,5 ng / ml), de l&#39; ionomycine (500 ng / ml) et Brefeldine A (5 ug / ml) pendant 4 heures à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant 4 heures avant de procéder à l&#39; écoulement analyse cytométrie. </li></ol> 2. polyclonaux Activation des cellules T de la peau-résident (Ex Vivo culture cellulaire) <ol><li> Aliquote de 100 ul suspensions unicellulaires (préparé à l&#39;étape 1.15) dans une plaque à fond rond de 96 puits. NOTE: Pour chacun de 4 mm biopsie de la peau, les suspensions monocellulaires acquises peuvent être divisées en au moins deux puits d&#39;une plaque de 96 puits. </li><li> Ajouter des microbilles anti-CD28 anti-CD3 / Acm revêtues (25.000 billes par puits), une cytokine recombinante humaine rIL-2 (concentration finale de 25 U / ml) et de la rIL-1 ß (concentration finale de 50 ng / ml). </li><li> Couvrir la plaque de culture avec un couvercle de plaque bien marqué, incuber dans 5% de CO 2, 100% d&#39; humidité, 37 ° C incubateur. Changer le milieu lorsque la couleur moyenne devient jaune. <br/&gt; NOTE: Une colonie de cellules claires peut être observée à partir du jour 8 de culture cellulaire. </li></ol> 3. Analyse de cytométrie en flux de primaire / Cultured cellules de la peau-résident T <ol><li> Préparer un tampon FACS: PBS + 0,2% de BSA. </li><li> Transfert des cellules d&#39;intérêt dans une plaque à 96 puits à fond en V. Centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot dans 100 pl de PBS. Centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant. </li><li> cellules Stain avec 100 pi de eFluorescence780 préparés conjugués colorant de viabilité fixable (1: 1000 dilution en utilisant PBS) à 4 ° C pendant 30 min. Ajouter 100 pi de tampon FACS, centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant. </li><li> Sélectionner requises mAb marqueurs de surface cellulaire, par exemple: CD45-BV421 (HI30, 01:20), CD3-DJE (UCHT1, 01:50), CD4 PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01h50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-1191:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01h50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), et CD1c-APC (AD5-8E7, 01:10), préparer le mélange en utilisant des mAb-tampon FACS en fonction de chaque facteur de dilution du mAb testés. Définir les paramètres de grille en utilisant le contrôle d&#39;isotype d&#39;anticorps avec l&#39;échantillon non-tache. </li><li> Ajouter 25 ul de prêt mAb-mélange dans chaque puits. Incuber 20 min à 20 ° C ± 2, protéger de la lumière. </li><li> Ajouter 100 pi de tampon FACS, centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant. </li><li> Pour les échantillons qui ne nécessitent que la surface cellulaire coloration, passez à l&#39;étape 3.16. </li><li> En cas de coloration intra-cellulaire de Foxp3: <ol><li> Préparer un tampon de fixation et de perméabilisation en mélangeant une partie de concentré avec 3 parties de diluants. </li><li> Préparer le tampon de perméabilisation 1x: 1 partie de 10x perméabilisation tampon + 9 parties de H 2 O. stérilisée </li></ol></li><li> Granulés Remettre en suspension dans 100 pi de fixation et permeabilitampon portant, bien mélanger, et incuber à 4 ° C pendant 30 min. </li><li> Ajouter 100 tampon de perméabilisation ul à chaque puits, centrifuger à 450 xg à température ambiante pendant 2 min, et aspirer le surnageant. </li><li> Laver les cellules avec perméabilisation tampon une fois de plus. </li><li> Sélectionnez mAb intracellulaires nécessaires, par exemple, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 1h50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) et IFNy PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Préparer le mélange mAb en utilisant un tampon de perméabilisation contenant 2% de sérum de rat normal en fonction de chaque facteur de dilution du mAb testés. Définir les paramètres de grille en utilisant le contrôle d&#39;isotype d&#39;anticorps avec l&#39;échantillon non-tache. </li><li> Ajouter 20 pi de prêt mAb-mélange dans chaque puits. Incuber à 4 ° C pendant 30 min, protéger de la lumière. </li><li> Au bout de 30 minutes d&#39;incubation, ajouter 100 ul de tampon de perméabilisation dans chaque puits. Centrifuger à 20 ° C ± 2, 450 g pendant 2 min, et aspirer le surnageant. </li><li> Laver les cellules avec perméabilisation buffer une fois de plus. Remettre en suspension le culot dans 110 pl de tampon FACS, et des suspensions de cellules de transfert dans microFACS tube. NOTE: L&#39;échantillon est prêt pour la mesure en utilisant 10 couleurs cytométrie en flux. </li><li> Dans le cas du nombre de cellules exacte nécessaire, ajouter 10 pl de suspension uniforme bien mélangée de fluorosphères dans chaque échantillon immédiatement avant d&#39;effectuer des mesures par cytométrie en flux. </li></ol>

<ol><li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vast+majority+of+CLA%2B+T+cells+are+resident+in+normal+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin.</a> J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).</li>
<li>Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+dermis+contains+distinct+populations+of+CD11c%2BBDCA-1%2B+dendritic+cells+and+CD163%2BFXIIIA%2B+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages.</a> J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).</li>
<li>Gebhardt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+in+nonlymphoid+tissue+that+provide+enhanced+local+immunity+during+infection+with+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus.</a> Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).</li>
<li>Boyman, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+psoriasis+in+a+new+animal+model+shows+an+essential+role+for+resident+T+cells+and+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha.</a> J Exp Med. 199, 731-736 (2004).</li>
<li>Christophers, E., Mrowietz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+infiltrate+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The inflammatory infiltrate in psoriasis.</a> Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infection+generates+non-migratory+memory+CD8%2B+T%28RM%29+cells+providing+global+skin+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity.</a> Nature. 483, 227-231 (2012).</li>
<li>Havran, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+diversity+of+T-cell+receptor+gamma-chain+expression+of+murine+Thy-1%2B+dendritic+epidermal+cells+revealed+by+V+gamma+3-specific+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).</li>
<li>Campbell, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+expression+and+memory+T+cell+diversity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CCR7 expression and memory T cell diversity in humans.</a> J Immunol. 166, 877-884 (2001).</li>
<li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+PKC+in+human+T+cells+using+sotrastaurin+%28AEB071%29+preserves+regulatory+T+cells+and+prevents+IL-17+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production.</a> J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).</li>
<li>Clark, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+isolation+of+skin+resident+T+cells+from+normal+and+diseased+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin.</a> J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).</li>
<li>Clark, R. A., Kupper, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+and+dermal+fibroblasts+induce+proliferation+of+natural+regulatory+T+cells+isolated+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin.</a> Blood. 109, 194-202 (2007).</li>
<li>Keijsers, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+induction+of+cutaneous+inflammation+results+in+the+accumulation+of+extracellular+trap-forming+neutrophils+expressing+RORgammat+and+IL-17%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17.</a> J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).</li>
<li>Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).</li>
<li>Hennino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-infiltrating+CD8%2B+T+cells+initiate+atopic+dermatitis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions.</a> J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous présentons un protocole pour isoler efficacement les cellules T résidentes de la peau à partir de biopsies de peau humaine. L&#39;avantage de ce protocole est l&#39;isolement d&#39;un nombre relativement élevé de lymphocytes viables, et l&#39;expression des marqueurs de surface appropriés. Les sous - ensembles de cellules identifiées sont:, les cellules CD11c + PED CD4 + et CD8 + et Foxp3 + CD25 +. Surtout, culture ex vivo des lymphocytes T isolés...

La peau, comme la principale interface entre le corps et l&#39;environnement, fournit la première ligne de défense contre physique externe, chimiques et biologiques des insultes telles que la blessure, le rayonnement ultraviolet et les micro-organismes. La peau se compose de deux compartiments, l&#39;épiderme et le derme, et contient une variété de cellules immunitaires , y compris les cellules de Langerhans, les macrophages, les cellules dendritiques (DCs), et environ 20 milliards de cellules T mémoire, près de deux fois le nombre présent dans l&#39;ensemble du volume sanguin 1 , 2. Un nombre croissant de données soutient l&#39;idée que la peau a des fonctions immunologiques essentielles, à la fois lors de l&#39;homéostasie tissulaire et dans diverses conditions pathologiques. Les cellules immunitaires résidentes dans la peau normale sont pensés pour mener immunosurveillance 3 et ont été montré à jouer un rôle dans le développement de troubles inflammatoires tels que le psoriasis 4. Dans la peau lésionnelle psoriasique, CD4 + et CD8 + infiltrés cellules T étaient obsdé- laissées , et on a montré que le rapport entre le CD4 et CD8 varie en fonction de l&#39;état de la maladie 5. Cependant, ces populations de cellules sont difficiles à étudier parce que les techniques existantes permettent l&#39;isolement des seules cellules rares. Les techniques actuellement largement utilisées pour l&#39;isolement de la peau humaine des cellules T combinent mécanique dissociation de la peau avec un traitement enzymatique. Les biopsies de peau humaine sont largement émincées et incubées avec des enzymes comme la trypsine, la collagénase et / ou EDTA 6-8. Considérant que la peau est un tissu de la barrière qui est très résistant aux efforts de traction et de désagrégation mécanique, les méthodes établies d&#39;isolement des cellules T produisent très peu de cellules, et même un nombre plus faible de cellules viables, ce qui rend culture ex vivo de cellules de ces populations cellulaires difficile et difficile. Nous rapportons ici une méthode modifiée pour isoler les lymphocytes de la peau humaine psoriasique sain et impliqué en combinant mechanla dissociation ique de la peau en utilisant un dissociateur tissulaire automatisé au lieu de la méthode établie de hachage largement, avec une digestion enzymatique à l&#39;aide de la collagénase. Divers sous-ensembles de cellules immunitaires viables, y compris les DC et les lymphocytes T ont été observées après la préparation d&#39;une suspension à cellule unique. Il est important de l&#39;expression des marqueurs de surface CD3, CD4 et CD8 a été bien conservée. Les cellules ainsi préparées sont prêts à être utilisés ex vivo dans des cultures cellulaires ou par cytométrie de flux. Ce protocole a été utilisé avec succès pour l&#39;analyse de biopsies cutanées unique (4 mm) dérivées de la peau lésionnelle des patients atteints de psoriasis. Les résultats ont montré que les cellules T du patient de la peau résidente produites cytokines plus inflammatoires comme l&#39; IL-17 et d&#39; IFNy par rapport aux volontaires sains 9.

<table><tbody><tr><td>Poinçon de biopsie jetable</td><td>Kai Europe</td><td>BP-40F</td><td>4 mm</td></tr><tr><td>Scalpels stériles jetables</td><td>Dalhausen</td><td>1100000510</td><td></td></tr><tr><td>douxTube MACS C</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-237</td><td>Capuchon bleu, utilisé comme tube de dissociation.</td></tr><tr><td>gentleDissociateur MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-235</td><td>Dissociateur tissulaire automatisé. Utilisation du « programme spleen_01 » pour la dissociation de la biopsie cutanée.</td></tr><tr><td>Passoire à cellules&nbsp ;</td><td>BD</td><td>352350</td><td>70 et micro ; m nylon</td></tr><tr><td>96 puits Plaque à fond en U</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>22409-015</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humain Sérum regroupé (HPS)</td><td></td>Collagénase <td></td><td></td></tr><tr><td>I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2674</td><td>Type 1-A, adapté à la culture cellulaire</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>B Braun</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-18</td><td>Stader les cellules mortes avant la fixation cellulaire ; diluer avec du PBS à 1:1 000</td></tr><tr><td>Concentré de fixation/perméabilisation</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td></td></tr><tr><td>Diluant de fixation/perméabilisation</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de perméabilisation (10x)</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Clone de 563879 CD45 BD anti-humain</td><td></td><td></td><td>: HI30 ; facteur de dilution 1:50</td></tr><tr><td>FITC Souris anti-humaine CD14</td><td>Dako</td><td>T0844</td><td>Clone : TUK4 ; facteur de dilution 1:50</td></tr><tr><td>PE Souris anti-humaine CD56</td><td>Dako</td><td>R7127</td><td>Clone : MOC-1 ; facteur de dilution 1:50</td></tr><tr><td>ECD Souris anti-humaine CD3</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A07748</td><td>Clone : UCHT1 ; facteur de dilution 1:50 pour la coloration de surface ; facteur de dilution 1:25 pour la coloration intracellulaire.</td></tr><tr><td>PC5.5 Souris anti-humaine CD4</td><td>Beckman - Coulter</td><td>B16491</td><td>Clone : 13B8.2 ; facteur de dilution 1:200</td></tr><tr><td>PeCy7 Souris anti-humaine CD11c</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A80249</td><td>Clone : BU15 ; facteur de dilution 1:50</td></tr><tr><td>APC Souris anti-humaine CD1c</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-903</td><td>Clone : AD5-8E7 ; facteur de dilution 1:10</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo700 Souris anti-humaine CD8</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A66332</td><td>Clone : B9.11 ; facteur de dilution 1:400</td></tr><tr><td>APC-AlexFluo750 Souris anti-humaine CD19</td><td>Beckman - Coulter</td><td>A94681</td><td>Clone : J3-119 ; facteur de dilution 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Souris anti-humaine CD25</td><td>eBioscience</td><td>AD5-8E7</td><td>Clone : BC96 ; facteur de dilution 1:50</td></tr><tr><td> PE Rat anti-humain CLA</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-635</td><td>clone : HECA-452 ; facteur de dilution 1 :</td></tr><tr><td>eFluo450 Rat anti-humain Foxp3</td><td>eBIoscience</td><td>48-4776-42</td><td>Clone : PCH101 ; coloration intracellulaire ; facteur de dilution 1:50</td></tr><tr><td>AlexFluo488 Souris anti-human IL-17A</td><td>eBioscience</td><td>53-7179-42</td><td>Clone : eBio64DEC17 ; coloration intracellulaire ; facteur de dilution 1:50</td></tr><tr><td>PeCy7 Souris anti-humaine IFNg</td><td>eBioscience</td><td>25-7319-41</td><td>Clone : 4S. B3 ; coloration intracellulaire ; facteur de dilution 1:400</td></tr><tr><td>Flow-Count Fluorospheres</td><td>Beckman - Coulter</td><td>7547053</td><td>Billes de comptage, pour cytométrie en flux</td></tr></tbody></table>

lymphocytes isolation de la peau humaine pour analyse phénotypique et<em&gt; ex vivo</em&gt; culture cellulaire

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

La peau humaine a une fonction de barrière importante et contient diverses cellules du système immunitaire qui contribuent à l&#39;homéostasie tissulaire et la protection contre les agents pathogènes. Comme la peau est relativement facile d&#39;accès, il offre une plateforme idéale pour étudier les mécanismes de régulation immunitaire périphériques. cellules résidentes immunitaire en bonne santé conduite de la peau immunosurveillance, mais aussi jouer un rôle important dans le développement des troubles inflammatoires de la peau, comme le psoriasis. En dépit des idées émergentes, notre compréhension de la biologie sous-jacente diverses maladies de peau inflammatoire est encore limitée. Il est nécessaire pour les populations (unique) de cellules isolées de bonne qualité à partir d&#39;échantillons de biopsie de la peau. Jusqu&#39;à présent, les procédures d&#39;isolement ont été gravement entravées par l&#39;absence d&#39;obtention d&#39;un nombre suffisant de cellules viables. L&#39;isolement et l&#39;analyse subséquente ont également été affectés par la perte des marqueurs de la lignée de cellules immunitaires, en raison de la contrainte mécanique et chimique provoquée par les procédés actuels de dissociation pour obtenirsuspension cellulaire unique. Ici, nous décrivons une méthode modifiée pour isoler les cellules de la peau humaine saine et psoriatique impliquée T en combinant la dissociation mécanique de la peau en utilisant un dissociateur tissulaire automatisé et le traitement par la collagénase. Cette méthode conserve l&#39;expression de la plupart des marqueurs de la lignée immunes telles que CD4, CD8, et Foxp3 CD11c lors de la préparation des suspensions de cellules isolées. Des exemples d&#39;isolement réussi CD4 + des lymphocytes T et phénotypiques ultérieure et analyse fonctionnelle sont montrées.

Le protocole présenté ici donnera entre 2.200 ± 615 (moyenne ± SEM, la peau des volontaires en bonne santé) jusqu&#39;à 178.000 ± 760 (moyenne ± SEM, la peau lésionnelle de patients atteints de psoriasis) lymphocytes viables de la peau humaine lors de l&#39;utilisation d&#39;un seul 4 mm biopsie de la peau. Différents types de CD45 + cellules ont été identifiées dans une seule cellule suspensions dérivées de la peau des individus en bonne santé , y compris les lymphocytes T CD4 <s...

Nous décrivons un protocole permettant d’isoler efficacement les lymphocytes T résidents de la peau à partir de biopsies de peau humaine. Ce protocole produit un nombre suffisant de lymphocytes résidents de la peau humaine viables pour l’analyse cytométrique en flux et la culture ex vivo.

Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture cellulaire

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler efficacement les lymphocytes T résidents de la peau à partir de biopsies cutanées humaines. Cette isolation est réalisée en premier lieu en prélevant des biopsies cutanées humaines à l'aide d'un punch circulaire. Ensuite, chaque biopsy cutanée est divisée en quatre morceaux plus petits dans une boîte de Pétri.Ensuite, le tissu cutané est dissocié mécaniquement et enzymatiquement afin d'obtenir une suspension monocellulaire. Enfin, les lymphocytes résidents de la peau sont analysés par cytométrie en flux et cultivés ex vivo. En définitive, un nombre suffisant de lymphocytes résidents viables humains peut être isolé et analysé par immunomarquage et analyse FACS.Cette méthode aidera à répondre à des questions clés en dermatologie et en immunologie des tumeurs cutanées. Par exemple, comment les lymphocytes T résidents de la peau contribuent à la maladie. La procédure sera démontrée par Xuehui He, un étudiant en doctorat de notre laboratoire.Après avoir préparé le milieu de culture selon le protocole indiqué, ajoutez deux millilitres de milieu complet à trois puits d'une plaque de culture stérile à six puits. Ensuite, utilisez un punch à biopsie circulaire de quatre millimètres pour prélever une biopsie cutanée. Placez-la dans du milieu de culture complet RPMI 1640 et laissez-la à température ambiante jusqu'à quatre heures, ou à quatre degrés Celsius toute la nuit.Pendant l'incubation de la biopsie, étiquetez un tube de dissociation à bouchon bleu et ajoutez cinq millilitres de milieu de culture complet. Ensuite, utilisez des outils stériles pour placer la biopsie dans le premier puits afin de la rincer. Transférez le tissu dans le deuxième puits, rincez, puis répétez le processus une fois de plus dans le troisième puits.Transférez la biopsie cutanée bien rincée dans une boîte de Pétri stérile et ajoutez 100 microlitres de milieu de culture complet au-dessus de l'échantillon. Ensuite, utilisez un scalpel stérile jetable en acier inoxydable pour prélever soigneusement le tissu adipeux sous-cutané. Dans une nouvelle boîte de Pétri stérile, découpez chaque biopsie cutanée en quatre morceaux plus petits.Transférez ensuite les échantillons dans le tube de dissociation préparé contenant cinq millilitres de milieu complet. Fermez hermétiquement le tube et fixez-le à l'envers sur le manchon du dissociateur tissulaire automatisé. Veillez à ce que tout le matériel échantillon se trouve dans la zone du rotor.Ensuite, démarrez le processus de dissociation en exécutant le programme M spleen zero one. Dissociez la biopsie à la vitesse de rotation appropriée pendant 56 secondes. Après le traitement, détachez le tube de dissociation du dissociateur et assurez-vous que tout le matériau dissocié est recueilli au fond du tube.Ajouter 150 µL de collagénase I A dans le tube de dissociation et incuber l'échantillon dans un bain-marie agité à 37 °C pendant 60 minutes. Ensuite, ajouter 100 µL de DNase dans le tube de dissociation et bien mélanger. Fixer le tube de dissociation sur le manchon du dissociateur tissulaire automatisé et exécuter le programme M spleen zero one afin de dissocier à nouveau la biopsie.Ensuite, placez un filtre cellulaire en nylon de 70 micromoles sur le dessus d'un tube conique de 50 millilitres et appliquez-y les échantillons dissociés afin d'éliminer les agrégats cellulaires et les débris tissulaires. Utilisez cinq millilitres de milieu complet pour rincer une fois le filtre cellulaire. Puis, centrifugez le filtrat à 450 G et à 20 degrés Celsius, plus ou moins deux degrés, pendant 10 minutes avant d'aspirer le surnageant.Après avoir répété l'étape de lavage une fois supplémentaire, utilisez 300 micro-litres de milieu de culture complet pour resuspendre les culots cellulaires. Les suspensions monocellulaires sont désormais prêtes pour une analyse ultérieure. Pour réaliser la coloration intracellulaire des cytokines, utilisez le PMA, l'ionomycine et la brefeldine A afin de stimuler les cellules, puis incubez-les à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre heures avant d'effectuer l'analyse par cytométrie en flux.Pour effectuer l'activation polyclonale des lymphocytes T résidents de la peau, aliquoter 100 microlitres de suspension cellulaire unique dans une plaque 96 puits à fond rond. Ajouter les microbilles revêtues d'anticorps anti-CD3 et anti-CD28, la cytokine humaine recombinante IL-2 et IL-1B. Recouvrir la plaque de culture d'un couvercle étiqueté et incuber à 37 degrés Celsius, 5 pour cent de dioxyde de carbone et 100 pour cent d'humidité.Ensuite, lorsque la couleur du milieu devient jaune, le changer. Une colonie cellulaire claire peut être observée au huitième jour en culture cellulaire. Pour effectuer l'analyse FACS, transférer les cellules d'intérêt dans une plaque 96 puits en V.Centrifuger à 450 G et à 20 degrés Celsius, plus ou moins deux degrés, pendant deux minutes. Ensuite, aspirer le surnageant. Utiliser 100 micro-litres de colorant fixable de viabilité conjugué fluorescent 780 préparé pour colorer les cellules en incubant à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon FACS et centrifugez avant d'aspirer le surnageant. Puis, après avoir sélectionné les anticorps monoclonaux marquant les marqueurs de surface cellulaire à partir de la liste fournie dans le protocole écrit, utilisez le tampon FACS pour préparer les solutions d'anticorps. Utilisez un témoin isotopique des anticorps conjointement avec un échantillon non coloré pour définir les paramètres de sélection.À présent, ajoutez 25 microlitres du mélange d'anticorps préparés pour souris dans chaque puits et protégez de la lumière. Incubez à 20 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ajoutez 100 microlitres de tampon FACS, centrifugez, puis aspirez le surnageant.À l'aide des tampons préparés pour la coloration de Foxp3 selon le protocole indiqué, ajouter 100 microlitres de tampon de fixation et de perméabilisation afin de resuspendre les culots. Bien mélanger et incuber à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, ajouter 100 microlitres de tampon de perméabilisation dans chaque puits et centrifuger avant d'aspirer le surnageant.Après un nouvel lavage des cellules et le choix des anticorps appropriés, ajouter 20 microlitres du mélange d'anticorps monoclonaux préparé dans chaque puits et protéger de la lumière avant d'incuber à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. À l'aide du tampon de perméabilisation, laver les cellules une fois supplémentaire. Ensuite, utiliser 110 microlitres de tampon FACS pour re-suspendre les culots et transférer les suspensions cellulaires dans des tubes FACS micro.Enfin, si le nombre exact de cellules est requis, ajouter 10 microlitres d'une suspension uniforme bien mélangée de fluorosphères à chaque échantillon immédiatement avant de procéder aux mesures FACS. Comme illustré ici, différents types de leucocytes positifs pour CD45 ont été identifiés dans des suspensions uniques de cellules provenant de la peau de sujets sains, notamment des lymphocytes T positifs pour CD4, des lymphocytes T positifs pour CD8 et des cellules dendritiques positives pour CD11c.Alors que peu de cellules B, de cellules NK ou de microphages ont été observés. De plus, la méthodologie permet l'analyse des cellules CD4 positives CD25 positives foxp3 positives dans des biopsies cutanées humaines. Par exemple, en utilisant une coloration intracellulaire après fixation et perméabilisation, il est possible de démontrer l'expression du facteur de transcription foxp3 dans les cellules T CD25 positives.Comme illustré ici, afin d'éviter la fluorescence autofluorescente de fond et de ne pas détecter la population cellulaire autofluorescente, il est recommandé d'utiliser l'anticorps de souris anti-CD45 humain conjugué à un fluorochrome brilliant violent 421 pour le positionnement de la population de lymphocytes. Cette figure montre que la majorité des cellules résidentes dans la peau humaine étaient des lymphocytes T positifs pour le CD3. Pour l'analyse de viabilité cellulaire, l'utilisation d'un colorant de viabilité fixable est recommandée afin de distinguer les cellules viables des cellules mortes ou en voie de mort.Pour une analyse fonctionnelle supplémentaire, en utilisant une seule biopsie cutanée de quatre millimètres de peau lésée provenant de patients atteints de psoriasis, il a été démontré que les lymphocytes T issus de la biopsie produisaient l'IL-17a et l'interféron gamma. Après une stimulation de quatre heures avec la PMA et l'ionomycine en présence de brefeldine A. Enfin, cette figure montre que les lymphocytes T provenant d'individus psoriasiques ont une capacité nettement plus élevée à produire les cytokines associées au psoriasis, à savoir l'IL-17a et l'interféron gamma. N'oubliez pas que le travail avec des tissus humains et des agents de laboratoire peut présenter des risques. Tenez toujours compte des mesures de sécurité.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

La migration des lymphocytes T se produit pendant homing vers les organes lymphoïdes, la sortie de la vascularisation, et entrer dans les tissus périphériques. Ici, nous décrivons un protocole qui peut être utilisé pour analyser la migration lymphocytaire...

Human T isolement des lymphocytes, de la Culture et de l&#39;analyse des migrations In Vitro</em

Une façon rapide, robuste d'isoler des cellules adultes viables souches épithéliales de la peau humaine est décrite. La méthode utilise la digestion enzymatique de la matrice collagène de la peau, suivie par la plumaison des follicules pileux et à l'isolement des suspensions de cellules uniques ou fragments de tissus pour la culture cellulaire.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine

Ce protocole décrit la dissociation rapide non enzymatique de fragments de tissus humains frais pour l’évaluation qualitative et quantitative des cellules CD45+ (lymphocytes/leucocytes) présentes dans divers tissus humains normaux et malins. De plus, le surnageant obtenu à partir de l’homogénat de tissu primaire peut être collecté et stocké pour une analyse ou une expérimentation plus approfondie.

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L'objectif de ce protocole est d'isoler les cellules endothéliales lymphatiques qui tapissent malformation lymphatique navires et prépuces kystiques humains en utilisant des cellules activées par fluorescence (FACS). La culture de cellules et de l'expansion ultérieure de ces cellules permet un nouveau niveau de sophistication expérimental pour les études génétiques, protéomiques, fonctionnels et de différenciation cellulaire.

Isolement des cellules endothéliales humaines lymphatique par multi-paramètres fluorescence tri cellulaire activé

Ce protocole décrit la digestion enzymatique de la peau de souris dans un milieu riche en nutriments, suivie d’une séparation par gradient pour isoler les leucocytes.  Les cellules ainsi dérivées peuvent être utilisées pour diverses applications en aval. Il s’agit d’une alternative efficace, économique et améliorée aux machines de dissociation des tissus et aux protocoles de digestion tissulaire basés sur la trypsine et la dispase.

Isolement de leucocytes infiltrant de la peau de souris Utilisation de digestion enzymatique et séparation par gradient

Nous décrivons ici un protocole permettant d’isoler les cellules myéloïdes de la peau de souris et de drainer les ganglions lymphatiques après injection intradermique de sporozoïtes de Plasmodium. La cytométrie en flux des cellules collectées fournit un test fiable pour caractériser la réponse inflammatoire de la peau et des ganglions lymphatiques drainants au parasite.

Myéloïde cellule d&#39;isolement de la peau de souris et Vidange ganglion Après intradermique immunisation avec Live Atténuée<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoïtes

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’isolement des lymphocytes des sites inductives y compris les plaques de Peyer tissu lymphoïde associé au tube digestif et les ganglions lymphatiques mésentériques drainants et les sites d’effecteur notamment la lamina propria et de la épithélium intestinal du petit système immunitaire intestinal.

Isoler des Lymphocytes du système immunitaire Intestinal souris petit

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Isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine par tri cellulaire activé par fluorescence

L’étude de la cicatrisation des plaies associée aux lésions musculo-squelettiques nécessite souvent l’évaluation des interactions in vitro entre les cellules de Schwann (SC), les kératinocytes et les fibroblastes. Ce protocole décrit l’isolement, la culture et la caractérisation de ces cellules primaires à partir du prépuce humain.

Isolement, culture et caractérisation des cellules de Schwann primaires, des kératinocytes et des fibroblastes du prépuce humain

Cet article décrit une méthode d’isolement par billes magnétiques de cellules endothéliales murines à partir de capillaires lymphatiques dermiques. Les cellules endothéliales lymphatiques isolées peuvent être utilisées pour des expériences in vitro en aval et l’analyse de l’expression des protéines.

Isolement des cellules endothéliales lymphatiques dermiques murines

Apprenez à isoler les lymphocytes T résidents de la peau humaine pour analyse phénotypique et culture ex vivo. Cette méthode combine dissociation mécanique et enzymatique pour obtenir des cellules viables en quantité suffisante.

Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et

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