Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et Ex Vivo Culture cellulaire

L’objectif global de cette procédure est d’isoler efficacement les lymphocytes T résidents de la peau à partir de biopsies de peau humaine. Ceci est accompli en obtenant d’abord des biopsies de peau humaine à l’aide d’un poinçon de biopsie ronde. Ensuite, chaque biopsie cutanée est coupée en quatre petits morceaux dans une boîte de Pétri.

Ensuite, le tissu cutané est dissocié mécaniquement et enzymatiquement pour produire une suspension unicellulaire. Enfin, les lymphocytes résidents de la peau sont analysés par cytométrie fluide et cultivés ex vivo. En fin de compte, un nombre suffisant de lymphocytes viables résidant dans la peau humaine peut être isolé et analysé par immunomarquage et analyse FACS.

Cette méthode aidera à répondre à des questions clés en dermatologie et en immunologie des tumeurs cutanées. Par exemple, comment les lymphocytes T résidents de la peau contribuent à la maladie. Xuehui He, un doctorant de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Après avoir préparé le milieu de culture, conformément au protocole textuel, ajoutez deux millilitres de milieu complet à trois puits d’une plaque de culture stérile à six puits. Ensuite, utilisez un poinçon de biopsie rond de quatre millimètres pour obtenir une biopsie cutanée. Placez-le dans un milieu de culture complet RPMI 1640 et laissez-le sur la paillasse jusqu’à quatre heures, ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Pendant l’incubation de la biopsie, étiquetez un tube de dissociation à capuchon bleu et ajoutez cinq millilitres de milieu de culture complet. Ensuite, utilisez des outils stériles pour placer la biopsie dans le premier puits pour la rincer. Transférez le tissu dans le deuxième puits, rincez, puis répétez le processus une fois de plus dans le troisième puits.

Transférez la biopsie cutanée bien rincée dans une boîte de Pétri stérile et pipetez 100 microlitres de milieu de culture complet sur l’échantillon. Ensuite, utilisez un scalpel stérile jetable en acier inoxydable pour gratter soigneusement le tissu adipeux sous-cutané. Dans une boîte de Pétri fraîche et stérile, coupez chaque biopsie cutanée en quatre petits morceaux.

Transférez ensuite les échantillons dans le tube de dissociation préparé contenant cinq millilitres de milieu complet. Fermez hermétiquement le tube et fixez-le à l’envers au manchon du dissociateur de tissus automatisé. Assurez-vous que tout le matériau de l’échantillon se trouve dans la zone du rotor.

Ensuite, démarrez le processus de dissociation en exécutant le programme M rate zéro un. Dissocier la biopsie à la vitesse de rotation appropriée pendant 56 secondes. Après le traitement, détachez le tube de dissociation du dissociateur et assurez-vous que tout le matériau dissocié est collecté au fond du tube.

Ajoutez 150 microlitres de collagène A dans le tube de dissociation et incubez l’échantillon dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes. Ensuite, ajoutez 100 micro-litres de DNase dans le tube de dissociation et mélangez bien. Fixez le tube de dissociation au manchon du dissociateur tissulaire automatisé et exécutez le programme M rate zéro un pour dissocier la biopsie une fois de plus.

Ensuite, placez une passoire cellulaire en nylon de 70 micromolaires sur le dessus d’un tube de faucon de 50 millilitres et appliquez les matériaux d’échantillon dissociés sur la passoire cellulaire pour éliminer les amas cellulaires et les débris tissulaires. Utilisez cinq millilitres de milieu complet pour laver une fois la passoire cellulaire. Ensuite, centrifugez le filtrat à 450 G et 20 degrés Celsius, plus ou moins deux degrés pendant 10 minutes avant d’aspirer le surnageant.

Après avoir répété l’étape de lavage une fois de plus, utilisez 300 microlitres de milieu de culture complet pour remettre en suspension les palettes cellulaires. Les suspensions unicellulaires sont maintenant prêtes pour une analyse plus approfondie. Pour effectuer une coloration intracellulaire des cytokines, utilisez la PMA, l’ionomysine et la brefeldine A pour stimuler les cellules et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre heures avant d’effectuer l’analyse par cytométrie en flux.

Pour effectuer l’activation polyclonale des lymphocytes T résidents de la peau, aliquote 100 microlitres de suspension unicellulaire dans une plaque à fond rond à 96 puits. Ajouter des microbilles enrobées d’anticorps anti-CD3, anti-CD28, des cytokines humaines recombinantes, IL-2 et IL-1B. Avec un couvercle de poids bien étiqueté, couvrez la plaque de culture et incubez à 37 degrés Celsius, cinq pour cent de dioxyde de carbone et 100 % d’humidité.

Ensuite, lorsque la couleur du support devient jaune, changez-la. Une colonie cellulaire claire peut être observée le huitième jour en culture cellulaire. Pour effectuer une analyse FACS, transférez les cellules d’intérêt dans une plaque à 96 puits à fond en V.

Centrifuger à 450 G et 20 degrés Celsius, plus ou moins deux degrés pendant deux minutes. Ensuite, aspirez le surnageant. Utilisez 100 microlitres de fluorescence 780 conjuguée préparée pour colorer les cellules en les incubant à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon FACS et centrifugez avant d’aspirer le surnageant. Ensuite, après avoir sélectionné les anticorps monoclonaux marqueurs de surface cellulaire dans la liste fournie dans le protocole texte, utilisez le tampon FACS pour préparer les solutions d’anticorps. Utilisez le contrôle isotopique des anticorps avec un échantillon non coloré pour définir les paramètres de la porte.

Maintenant, ajoutez 25 microlitres de mélange d’anticorps de souris préparé dans chaque puits et protégez-le de la lumière. Incuber à 20 degrés Celsius pendant 20 minutes. Ajoutez 100 microlitres de tampon FACS, centrifugez et aspirez le surnageant.

À l’aide de tampons préparés pour la coloration foxp3 selon le protocole textuel, ajoutez 100 microlitres de tampon de fixation et de perméabilisation pour remettre les palettes en suspension. Bien mélanger et incuber à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de perméabilisation dans chaque puits et centrifugez avant d’aspirer le surnageant.

Après avoir lavé les cellules une fois de plus et choisi les bons anticorps, ajoutez 20 microlitres de mélange d’anticorps monoclonaux préparé dans chaque puits et protégez-le de la lumière avant de l’incuber à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. À l’aide d’un tampon de perméabilisation, lavez les cellules une fois de plus. Ensuite, utilisez 110 microlitres de tampon FACS pour remettre les palettes en suspension et transférer les suspensions de cellules dans des tubes mico FACS.

Enfin, si le numéro exact de cellule est requis, à 10 microlitres d’une suspension uniforme de flurosphères bien mélangée à chaque échantillon immédiatement avant de prendre les mesures FACS. Comme le montre ici, différents types de leucocytes CD45 positifs ont été identifiés dans des suspensions unicellulaires dérivées de la peau d’individus sains. Y compris les lymphocytes T CD4 positifs, les lymphocytes T CD8 positifs et les cellules dendritiques CD11c positives.

Alors que peu de lymphocytes B, de cellules NK ou de microphages ont été observés. De plus, la méthodologie permet d’analyser des cellules CD4 positives CD25 positives pour foxp3 dans des biopsies de peau humaine. Par exemple, en utilisant la coloration intracellulaire après fixation et perméabilisation, il est possible de mettre en évidence l’expression du facteur de transcription foxp3 dans les lymphocytes T CD25 positifs.

Comme démontré ici, pour éviter l’auto-fluorescence de fond et pour éviter la population de cellules auto-fluorescentes, l’anticorps anti-humain CD45 de souris conjugué à un fluorochrome 421 violent et brillant est recommandé pour le contrôle de la population lymphocytaire. Cette figure montre que la majorité des cellules résidentes de la peau humaine étaient des lymphocytes T CD3 positifs. Pour l’analyse de la viabilité cellulaire, un colorant de viabilité fixable est recommandé pour distinguer les cellules viables des cellules mortes ou mourantes.

Pour une analyse fonctionnelle plus approfondie, en utilisant une seule biopsie cutanée de quatre millimètres de la peau lésionnelle de patients atteints de psoriasis, il a été démontré que les lymphocytes T dérivés de la biopsie produisaient de l’IL-17a et de l’inteféron gamma. Suite à une stimulation de quatre heures avec de l’ionomycine PMA en présence de brefeldin A.Enfin, cette figure montre que les lymphocytes T d’individus psyoriatiques ont une capacité beaucoup plus élevée à produire les cytokines IL-17a et interféron gamma associées au psoriasis. N’oubliez pas que travailler avec des tissus humains et des agents de laboratoire peut être dangereux.

Prenez toujours en compte les mesures de sécurité.