Génération d'une épaisseur en trois dimensions équivalent de peau et automatisé Blessant

L’objectif global de cette procédure est de créer un équivalent de peau tridimensionnel sur toute l’épaisseur, qui ressemble à la peau naturelle, et de générer des plaies précises et reproductibles dans des conditions stériles à l’aide d’un dispositif de plaie automatisé. Ceci est accompli en intégrant d’abord des fibroblastes dermiques humains primaires dans un hydrogel de collagène. Ensuite, les kératinocytes épidermiques primaires humains sont assis sur le dessus de l’hydrogel enrobé de fibronectine.

Ensuite, le modèle est cultivé dans des conditions immergées, puis sous une interface air-liquide, un équivalent cutané tridimensionnel de pleine épaisseur est formé, composé d’un composant dermique et d’un épiderme multicouche. Enfin, une plaie standardisée est générée dans un environnement stérile. En fin de compte, la coloration immunohistochimique et la microscopie sont utilisées pour évaluer la structure histologique de l’équivalent cutané blessé de pleine épaisseur.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les modèles animaux, par exemple, est que l’équivalent de la peau de pleine épaisseur est composé de cellules humaines primaires. Ainsi, avec le dispositif de plaie automatisé, nous pouvons générer des plaies standardisées, de sorte que le dispositif de plaie automatisé peut fournir un aperçu des processus de cicatrisation des plaies cutanées dans un environnement humanisé. Il peut également être appliqué à nos systèmes tels que l’ingénierie des tissus osseux.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés de la cicatrisation des plaies, telles que les processus biologiques, la réparation cutanée sous-jacente et l’interaction cellulaire entre les composants épidermiques et dermiques. Pour commencer, dissolvez le collagène avec 0,1 % d’acide acétique jusqu’à une concentration finale de six milligrammes par millilitre. Préparez la solution de neutralisation du gel en mélangeant 232,5 millilitres de deux DMM X, 7,5 millilitres de FCS, 7,5 millilitres de trois molaires et 2,5 millilitres de cinq milligrammes par millilitre.

Le sulfate de chondroïtine place des inserts dans les puits d’une plaque de 24 puits pour détacher les fibroblastes dermiques humains ou HDFS et centrifuger les suspensions cellulaires pendant cinq minutes. À 270 G, comptez les cellules et centrifugez un Eloqua de 1 200 000 HDF pendant cinq minutes. À 270 g, retirez le snat et utilisez quatre millilitres de solution de neutralisation de gel refroidie pour remettre soigneusement le HDF en suspension sans provoquer de bulles d’air.

Ensuite, remettez la solution en suspension avec huit millilitres de solution de collagène. Ensuite, utilisez une pipette à plusieurs étapes et ajoutez 500 microlitres de mélange de cellules de collagène dans chaque insert. Dans la plaque à 24 puits, incubez les gels pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour permettre aux gels de se solidifier.

Utilisez ensuite deux millilitres de DMM plus 10 % FCS par puits. Pour immerger les gels, incubez les gels pendant 24 heures. Utilisez de l’eau ultrapure pour dissoudre la protéine de fibronectine humaine à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre.

Après avoir incubé les gels équivalents dermiques pendant 24 heures, retirez le milieu. Utilisez 25 microlitres de solution de fibronectine pour couvrir chaque équivalent dermique et incubez les gels pendant 30 minutes. Entre-temps, remettez en suspension l’épiderme humain, les kératinocytes ou le HKS avec kgm deux plus 5 % FCS jusqu’à une concentration finale de 1 million de cellules par graine de litre, 100 000 heeks sur chaque gel.

Ensuite, incubez les gels pendant 45 minutes pour permettre aux cellules d’adhérer à l’aide de kgm deux prêts plus 5 % FCS immergés les cellules et poursuivez l’incubation. Après une incubation de deux à trois jours, remplacer le milieu par 2 % de FCS, puis le milieu sans FCS, deux à trois jours plus tard. Le septième jour, retirez complètement le milieu.

À l’aide d’une pince stérile, placez chaque insert dans un puits d’une plaque à six puits. Ajoutez ensuite 1,5 millilitres de fluide de transport aérien par puits. En prenant soin de ne pas mouiller la surface du FTSC.

Changez de support tous les deux à trois jours pendant 14 jours supplémentaires. Préparez le dispositif de plaie automatisé en utilisant de l’éthanol à 70 % et de la lumière ultraviolette pour désinfecter la zone de travail à l’aide d’une pince stérile. Placez les équivalents cutanés dans les zones désignées de la plaque de support de l’échantillon de l’autoclave.

Placez une plaque de support d’échantillon dans la douille sous la tête de perçage. Utilisez le logiciel de contrôle pour régler les paramètres de blessure comme suit. Vitesse de rotation 15 000 tr/min de pénétration, 1,5 millimètre.

Propulsion 100 hertz. Transférez les paramètres de blessure vers le dispositif de bobinage automatisé. Commencez la procédure de blessure une fois terminée.

Retirez la plaque de support d’échantillon de la douille et utilisez une pince stérile pour transférer le FTSE blessé dans l’insert utilisé pour la culture. Incuber les blessés FTSE jusqu’à l’évaluation expérimentale. Utilisez les modèles pour son analyse histologique à tout moment.

Les HDFS et HKS isolés ont été caractérisés par coloration immunohistochimique avant de les utiliser pour le FTSE. Les HDF sont positifs pour menton, un marqueur des fibroblastes primaires HEK exprimant fortement la protéine de différenciation précoce CYTOKÉRATINE 14, mais presque pas de protéine de différenciation tardive des kératinocytes CYTOKÉRATINE 10. Les FTSE ont été cultivés pendant sept jours dans des conditions de milieu immergé, suivis de 14 jours à l’interface air-liquide.

Au cours de ce processus, le FTSC se contracte de manière significative dans les 21 jours. Les HEK prolifèrent en modifiant le niveau moyen de telle sorte que la surface des modèles est exposée à l’air. Et en augmentant la concentration de calcium, les HKS sont stimulés pour se différencier en un épiderme multicellulaire composé de plusieurs couches cellulaires vitales de kératinocytes.

Dans différents états de différenciation D et atrium cornée. En comparant la coloration à l’hématine et à l’éosine du FTSE avec la peau humaine native, il devient évident que le FTSE imite l’architecture histologique de la peau. Le HDF dans l’hydrogel de collagène peut être coloré avec des anticorps primaires contre la vimentine.

De plus, les kératinocytes forment une couche épidermique composée de cellules positives à la cytokératine 14 et du marqueur de différenciation tardive. La CYTOKÉRATINE 10 est exprimée dans les couches super basales. De plus, le St.Stratum cornium est positif pour RIN après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la dermatologie pour explorer la cicatrisation des plaies cutanées et une configuration in vitro standardisée qui imite étroitement la peau humaine.