Name: Méthodes de caractérisation de la Co-développement de biofilms et Habitat Hétérogénéité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Découvrez la caractérisation des interactions entre biofilms et leur environnement en utilisant une cellule microfluidique à double entrée. Cette méthode permet d'analyser les gradients chimiques et la dynamique des flux autour des colonies.

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Nous remercions Matt Parsek de l’Université de Washington (Seattle, WA) pour avoir fourni les souches de P. aeruginosa et E. coli et Roger Nokes de l’Université de Canterbury (Nouvelle-Zélande) pour avoir fourni l’accès au logiciel Streams. Ce travail a été soutenu par des subventions R01AI081983 des National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases. L’imagerie confocale a été réalisée au Northwestern Biological Imaging Facility (BIF).

1. Configuration et inoculation de la cellule d’écoulement
REMARQUE : Utilisez une cellule d’écoulement microfluidique à double entrée décrite dans Song et al., 201414 pour cultiver des biofilms. Cette cellule d’écoulement est capable de créer des gradients chimiques lisses bien définis. La conception de la cellule d’écoulement est illustrée à la figure 1 et la fabrication de la cellule d’écoulement a été décrite précédemment dans Song et coll., 201414. Ici, nous détaillons nos méthodes en utilisant P. aeruginosa et E. coli pour former des biofilms, mais d’autres espèces peuvent également convenir. Nous avons utilisé P. aeruginosa PAO1-gfp, qui exprime constitutivement une protéine fluorescente verte (GFP), comme organisme modèle pour le développement du biofilm. De plus, nous avons utilisé E. coli DH5α pour former des biofilms d’espèces mixtes avec P. aeruginosa. Les souches de P. aeruginosa et d’E. coli ont été cultivées sur des plaques de gélose LB.
<ol>
	<li>Préparez la cellule d’écoulement à l’aide de polydiméthylsiloxane (PDMS) lié à une lamelle de verre par un traitement au plasma d’oxygène, comme décrit aupoint 14. Les dimensions de la chambre de la cellule d’écoulement sont de 23 mm × 13 mm × 0,24 mm (longueur × largeur × profondeur).</li>
	<li>Préparez le milieu de croissance FAB modifié15. Pour observer la croissance du biofilm sous un gradient nutritionnel à l’intérieur de la cellule d’écoulement, introduisez le milieu FAB15 modifié avec 0,6 μM de glucose dans une entrée et introduisez le milieu FAB sans aucune source de carbone par l’autre entrée. Stérilisez par filtre (taille des pores = 0,2 μm) la solution mère de glucose (60 mM) avant de l’ajouter au milieu FAB. Autoclavez également le milieu FAB avec le cycle 1 (liquide, 15 min ; 121 °C, 17 psi) avant utilisation.</li>
	<li>Stérilisez le système d’écoulement. Avant l’inoculation, autoclaver l’ensemble de la voie d’écoulement (bouteilles moyennes, tubes, pièges à bulles, cellules d’écoulement) à l’aide du cycle 1, à l’exception des vannes à trois voies en plastique (jetables et pré-stérilisées) situées en amont de la cellule d’écoulement. (Des vannes à trois voies sont utilisées pour l’injection de culture cellulaire, de traceur fluorescent et de microbilles.) Pour éviter toute contamination lors de l’assemblage, couvrez toutes les ouvertures des tubes et des connecteurs avec du papier d’aluminium ou des sacs d’autoclave avant l’autoclavage.</li>
	<li>Connectez le système d’écoulement. Assemblez soigneusement les composants du système de cellules d’écoulement (voir la vidéo pour l’assemblage du système d’écoulement) et fournissez le fluide de croissance à la cellule d’écoulement via une pompe péristaltique qui contrôle avec précision le débit.</li>
	<li>Préparez la culture cellulaire pour l’inoculation en transférant une colonie de P. aeruginosa ou d’E. coli des plaques LB dans 3 ml de bouillon LB et agitez la culture O/N à 225 tr/min et 37 °C. Diluez les cultures cellulaires O/N dans 1 ml d’eau stérilisée jusqu’à une DO finalede 600 = 0,01 comme inoculum. (Cultivez et diluez les bactéries dans une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination.)</li>
	<li>Pour les expériences avec des biofilms d’espèces mixtes, diluer les deux cultures bactériennes dans un rapport de 1:1 dans 1 ml avec une DO équivalentede 600 = 0,01 pour chaque bactérie.</li>
	<li>Inoculer la cellule d’écoulement. Injecter 1 ml d’inoculum à l’entrée de la cellule d’écoulement à partir de la vanne à trois voies. Après l’injection, interrompez le débit pendant 1 heure pour permettre aux cellules bactériennes de se fixer au verre de protection. (Assurez-vous que la cellule d’écoulement est placée avec la lamelle vers le bas pour permettre aux cellules en suspension de se déposer sur la lamelle.)</li>
	<li>Après 1 heure, reprenez l’écoulement et pompez le milieu de croissance vers la cellule d’écoulement à un débit constant de 0,03 ml/min pour chaque entrée pendant 3 jours.</li>
</ol>
2. Caractérisation du développement du biofilm en réponse aux gradients de nutriments à l’aide de la microscopie confocale

REMARQUE : P. aeruginosa peut être imagé avec la GFP exprimée de manière constitutive, mais E. coli dans les biofilms d’espèces mixtes doit être imagé par contre-coloration.

<ol>
	<li>Observez les biofilms de 3 jours à l’aide de la microscopie confocale. Pour des résultats représentatifs, observez les biofilms à l’aide d’un microscope confocal avec un objectif 63X. Avant l’imagerie, marquez la cellule d’écoulement à double entrée avec une grille sur le côté du verre de couverture. (Le but de cette grille est de permettre à l’expérimentateur de localiser les régions d’imagerie à l’intérieur de la chambre de la cellule d’écoulement.)</li>
	<li>Pour contre-colorer, diluez 10 μl de colorant d’acide nucléique fluorescent rouge perméable à la cellule, tel qu’un colorant d’acide nucléique fluorescent vert tel que STYO 62, solution mère (1 mM) dans de l’eau stérilisée de 990 μl, puis injectez lentement le colorant dilué à l’aide d’une seringue dans la chambre de la cellule d’écoulement à partir de la vanne à trois voies en amont. Gardez la cellule d’écoulement stagnante et dans l’obscurité pendant 30 min, puis reprenez l’écoulement pour laver la tache non liée pendant 15 min.</li>
	<li>Effectuer l’imagerie confocale. Activez le laser à argon de 488 nm pour l’excitation et les canaux de collecte d’émission pour la GFP (500-535 nm) et la coloration des acides nucléiques (pour la coloration des acides nucléiques fluorescents verts, 650-750 nm). Ajustez les gains et les décalages pour les deux canaux afin d’obtenir des images claires et nettes. Sélectionnez xyz et le mode d’imagerie simultanée. Utilisez le bouton de commande z pour identifier le bas et le haut du biofilm sur le terrain. Réglez le pas z sur 0,5 μm pour l’acquisition d’une pile d’images 3D. (Pour garantir une qualité d’image élevée, utilisez une moyenne linéaire de quatre pour l’acquisition d’images.)</li>
	<li>Pour cartographier les modèles spatiaux de développement du biofilm à l’intérieur de la cellule d’écoulement, imagez les biofilms à trois distances longitudinales (x) ou plus le long de l’entrée de la cellule d’écoulement, et à trois positions transversales (y) par rapport au gradient nutritionnel imposé, comme le montre la figure 1.</li>
</ol>
3. Caractérisation du transport interne de solutés par injections de traceur fluorescent conservateur
REMARQUE : Un traceur fluorescent conservateur, tel que Cy5, peut être utilisé pour caractériser les modèles de transport de soluté dans le biofilm.
<ol>
	<li>Dissoudre le Cy5 (ester monoréactif du NHS) dans l’eau jusqu’à une concentration finale de 10 mg/ml sous forme de solution mère. Conservez la solution mère Cy5 dans un congélateur à -20 °C. 
	REMARQUE : Comme Cy5 est sensible à la lumière, stockez, diluez et injectez les solutions Cy5 dans l’obscurité.</li>
	<li>Avant les injections du traceur fluorescent, prendre une pile d’images 3D du biofilm de 3 jours avec microscopie confocale (avec un objectif 63X). (De vastes régions de colonies de biofilm sont idéales pour les observations chronologiques du transport des colorants.) Choisissez également un plan z avec des colonies bien séparées pour l’imagerie (comme le montre la figure 5A).</li>
	<li>Pour chaque expérience d’injection de Cy5, diluer 2 μl de la solution mère de Cy5 dans de l’eau stérilisée à 998 μl pour obtenir une solution d’injection ayant une concentration de Cy5 de 20 μg/ml.</li>
	<li>Arrêtez la pompe pour interrompre le débit et injectez la solution Cy5 en amont de la cellule d’écoulement à l’aide d’une seringue via la vanne à 3 voies. (Il est important d’empêcher les bulles d’air de pénétrer dans le chemin d’écoulement lors de l’injection. Les pièges à bulles doivent être maintenus ouverts pendant l’injection dans le dos.)</li>
	<li>Après avoir injecté la solution Cy5, fermez les pièges à bulles, ajustez la vanne à 3 voies et redémarrez la pompe pour délivrer la solution Cy5 injectée dans la cellule d’écoulement.</li>
	<li>Basculez le mode d’imagerie confocale sur xyt. Activez les canaux Cy5 et GFP en mode d’imagerie simultanée. Ajustez les paramètres confocaux sur l’intensité Cy5 (intensité laser, gain et décalage) pour éviter de saturer les signaux, ce qui est essentiel pour la quantification. (Une résolution temporelle élevée est préférable pour visualiser la pénétration du colorant. Cependant, un balayage rapide diminue la qualité de l’image.) Choisissez la vitesse de balayage et la moyenne de ligne appropriées pour équilibrer la résolution temporelle de l’imagerie et la qualité de l’image. Pour ce protocole, utilisez une moyenne de ligne de quatre et une fréquence d’images de 0,15 Hz.</li>
	<li>Reprendre le débit pour délivrer le Cy5 dans la cellule d’écoulement (toujours à un débit de 0,03 ml/min). Démarrez simultanément l’imagerie confocale de séries chronologiques.</li>
	<li>Quantifiez la pénétration de Cy5 en faisant la moyenne radiale de l’intensité de Cy5 au sein d’une colonie de biofilm circulaire 2D. Pour faire la moyenne, il faut d’abord identifier le bord d’un amas de biofilm, puis générer une carte de distance pour une section 2D de l’amas, et enfin faire la moyenne des motifs radiaux des intensités Cy5 pour générer une courbe de pénétration (voir Figure 6).
	<ol>
		<li>Pour réaliser l’étape 3.8, utilisez le progiciel BioSPA (Biofilm Spatial Pattern Analysis) (non publié, progiciel et manuel disponibles sur demande) ou d’autres programmes d’analyse d’images.</li>
		<li>Pour utiliser BioSPA, importez d’abord un ensemble d’images dans BioSPA. Sélectionnez ensuite le seuil approprié pour les canaux GFP et Cy5 afin de créer des images binaires. Dans le menu analyse/calcul, sélectionnez Analyse avancée, puis Analyse de diffusion. Utilisez le canal GFP pour définir le bord d’un cluster et utilisez l’outil Polygone pour sélectionner un cluster comme région d’intérêt (ROI).</li>
		<li>Double-cliquez sur le groupe de biofilm sélectionné pour effectuer une analyse de diffusion. Enregistrez les résultats de l’analyse de diffusion et calibrez l’intensité de Cy5 à la concentration de Cy5 à l’aide d’une courbe d’étalonnage.
		<ol>
			<li>Pour générer une courbe d’étalonnage de la concentration Cy5, mesurez les intensités Cy5 sur un gradient de concentration Cy5 en microscopie confocale. (L’intensité et la concentration de Cy5 ont une relation linéaire.)</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Caractérisation du champ d’écoulement environnant par suivi des particules fluorescentes
REMARQUE : Les particules fluorescentes, telles que les microbilles fluorescentes, peuvent être utilisées pour caractériser le champ d’écoulement autour des biofilms. Le champ d’écoulement autour des biofilms peut être calculé à partir des observations chronologiques des positions des particules à l’aide d’un logiciel de vélocimétrie de suivi des particules. Les résultats présentés ici ont été obtenus avec le progiciel Streams 2.0216 (téléchargement du logiciel et guide d’utilisation disponibles à l’adresse <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a>).
<ol>
	<li>Diluer les microbilles fluorescentes (diamètre ~1 μm) dans de l’eau stérilisée jusqu’à une concentration finale solide de 0,2 % et un volume final de 0,5 ml. Vortex pour s’assurer que les microbilles sont bien dispersées.</li>
	<li>Injectez et délivrez les microbilles fluorescentes diluées dans la cellule d’écoulement en suivant les procédures des étapes 3.3 à 3.5. Pour permettre un suivi précis de la trajectoire des particules, utilisez un débit relativement faible (0,01 ml/h pour les résultats de suivi des particules dans cet article).</li>
	<li>Basculez les paramètres confocaux en mode xyt pour suivre le mouvement des particules en une tranche z et prendre des images chronologiques. (Une fréquence d’images de 1 Hz a été utilisée pour les résultats représentatifs présentés dans cet article.) Répétez l’injection de particules et l’image à différents emplacements z pour générer un champ d’écoulement 3D.</li>
	<li>Pré-traitez les images confocales de séries temporelles en soustrayant le signal de fluorescence de fond (le signal de la première image acquise de l’ensemble d’images) à l’aide d’ImageJ (téléchargement du logiciel et manuel disponible sur <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a>) ou d’autres programmes.</li>
	<li>Dans ImageJ, ouvrez la première image d’un ensemble d’images, puis importez l’ensemble d’images. Sous Calculateur de processus/image, soustrayez la première image de l’ensemble d’images. Enregistrez l’ensemble d’images prétraitées.</li>
	<li>Pour calculer des vecteurs d’écoulement, importez des images confocales de séries chronologiques dans Streams 2.02. Sous « Ouvrir la vue du processus », sélectionnez et exécutez « Identifier les particules ». Utilisez le seuil approprié pour identifier les particules. Utilisez 0,5 et 5 μm comme seuils de diamètre minimum et maximum pour les particules de 1 μm.</li>
	<li>Ensuite, sous « Ouvrir la vue du processus », sélectionnez et exécutez « Pipeline d’analyse PTV » pour générer des chemins de particules. Vérifiez les chemins des particules pour voir s’ils représentent le mouvement des particules. Enfin, sélectionnez et exécutez « Créer un champ de vitesse » pour générer une carte vectorielle d’écoulement.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons démontré une série de méthodes pour caractériser trois interactions importantes entre le biofilm et l’environnement : la réponse du biofilm aux gradients chimiques, les effets de la croissance du biofilm sur le microenvironnement d’écoulement environnant et l’hétérogénéité du biofilm résultant des limitations de transport interne.
Nous avons d’abord montré l’utilisation d’une nouvelle cellule d’écoulement microfluidique pour imposer un gradient chimique bien défini pour le développe...

Les micro-organismes se fixent aux surfaces et forment des biofilms - des agrégats cellulaires enfermés dans une matrice polymère extracellulaire1. Les biofilms se comportent très différemment des cellules microbiennes individuelles, car les biofilms présentent une hétérogénéité spatiale spectaculaire résultant d’une combinaison de limitations internes du transport de solutés et de variations spatiales du métabolisme cellulaire2,3. Les concentrations d’oxygène et de nutriments diminuent considérablement à l’interface entre le biofilm et le liquide environnant et s’épuisent davantage à l’intérieur du biofilm2. Des variations spatiales dans la respiration du biofilm et la synthèse des protéines peuvent également se produire en réponse à la disponibilité localisée de l’oxygène et des nutriments2.
Dans les environnements aquatiques et pédologiques, la plupart des bactéries résident dans les biofilms. Les biofilms naturels effectuent d’importants processus biogéochimiques, notamment le cycle du carbone et de l’azote et la réduction des métaux4,5. Cliniquement, la formation de biofilm est responsable d’infections pulmonaires et urinaires prolongées6. Les infections associées aux biofilms sont très problématiques car les cellules des biofilms ont une résistance extrêmement élevée aux antimicrobiens par rapport à leurs homologues planctoniques6. Parce que les biofilms sont importants dans divers contextes, une quantité importante de recherches a été axée sur la compréhension des facteurs environnementaux qui contrôlent les activités du biofilm et l’hétérogénéité spatiale des biofilms et du microenvironnement environnant.
Des études antérieures ont montré que le développement du biofilm est fortement régulé par un certain nombre de facteurs environnementaux : les biofilms développent différentes morphologies dans diverses conditions d’écoulement ; la disponibilité de l’oxygène et des nutriments influence la morphologie du biofilm ; et le stress de cisaillement hydrodynamique affecte la fixation des cellules planctoniques aux surfaces et le détachement des cellules des biofilms7-9. De plus, les conditions d’écoulement externe influencent l’apport de substrats dans et à l’intérieur des biofilms10. La croissance des biofilms modifie également les conditions physiques et chimiques environnantes. Par exemple, la croissance du biofilm entraîne un appauvrissement local en oxygène et en nutriments2 ; les biofilms accumulent des composés inorganiques et organiques de l’environnementenvironnant 11 ; et les grappes de biofilm détournent l’écoulement et augmentent la friction de surface12,13. Étant donné que les biofilms interagissent avec leur environnement de manière très complexe, il est essentiel d’obtenir simultanément des informations sur les propriétés du biofilm et les conditions environnementales, et des approches multidisciplinaires doivent être utilisées pour caractériser de manière exhaustive les interactions entre le biofilm et l’environnement.
Nous présentons ici une série de méthodes intégrées pour caractériser les modèles spatiaux de croissance microbienne au sein de biofilms mono-espèces et bi-espèces sous un gradient nutritionnel imposé, et pour observer la modification résultante du microenvironnement chimique et fluide local. Nous décrivons d’abord l’utilisation d’une cellule d’écoulement microfluidique à double entrée récemment développée pour observer la croissance du biofilm sous des gradients chimiques bien définis. Nous démontrons ensuite l’utilisation de cette cellule d’écoulement microfluidique pour observer la croissance de deux espèces de bactéries, Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli, dans des biofilms sous diverses conditions nutritionnelles. Nous montrons comment la visualisation in situ de la propagation de traceurs fluorescents dans les colonies de biofilms peut être utilisée pour évaluer quantitativement les modèles de transport de solutés dans les biofilms. Enfin, nous montrons comment la vélocimétrie de suivi des particules à l’échelle microscopique, réalisée en microscopie confocale, peut être utilisée pour obtenir un champ d’écoulement local autour des biofilms en croissance.

<table><tbody><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Gilson</td><td>Miniplus 3</td><td>Configuration de la cellule d’écoulement et inoculation</td></tr><tr><td>Tube de pompe 0,50 mm OVC, Orange/Jaune</td><td>Gilson</td><td>F117934</td><td>Configuration et inoculation de la cellule d’écoulement</td></tr><tr><td>Robinet d’arrêt à trois voies avec serrure Luer mâle pivotante</td><td>Smiths Medical&nbsp ;</td><td>MX9311L</td><td>Configuration et inoculation de cellules d’écoulement</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Encapsulation de cellules solaires pour la fabrication de panneaux solaires</td><td>ML Solar LLC</td><td></td><td>Configuration et inoculation de cellules d’écoulement</td></tr><tr><td>Pyrex Medium Bottle, 1&nbsp ; L, GL45</td><td>VWR</td><td>16157-191 Configuration et</td><td>inoculation de la cellule d’écoulement</td></tr><tr><td>C-FLEX Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>06422-02</td><td>Configuration et inoculation de la cellule d’écoulement</td></tr><tr><td>1 ml Seringue TB</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Configuration et inoculation de la cellule</td></tr><tr><td>d’écoulement Tube polymère</td><td>IDEX</td><td>1520G</td><td>Configuration et inoculation de la cellule d’écoulement</td></tr><tr><td>Adaptateur de stub Luer Intramedic stérile Clay</td><td>Adams</td><td>427564</td><td>Configuration et inoculation de cellules d’écoulement</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Configuration et inoculation de cellules d’écoulement</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>HACH</td><td></td><td>Configuration et inoculation de cellules d’écoulement</td></tr><tr><td>Filtres à seringue - stériles (0,2 &mu ; m)</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719A</td><td>Configuration et inoculation de la cellule d’écoulement</td></tr><tr><td>MAXQ Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Configuration et inoculation de la cellule d’écoulement</td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Milieu de croissance</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique anhydre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20908-A7</td><td>Milieu de croissance</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Milieu de croissance</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Milieu de croissance</td></tr><tr><td>Chlorure de magnisium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Milieu de croissance</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de calcium Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Milieu de croissance</td></tr><tr><td>Sulfate de calcium dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3771</td><td>Milieu de croissance</td></tr><tr><td>Sulfate de fer(II) heptahydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215422</td><td>Milieu de croissance</td></tr><tr><td>Sulfate de manganèse(II) monohydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Milieu de croissance</td></tr><tr><td>Sulfate de cuivre(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451657</td><td>Milieu de croissance</td></tr><tr><td>Sulfate de zinc heptahydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z0251</td><td>Milieu de croissance</td></tr><tr><td>Sulfate de cobalt(II) heptahydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td><td>Milieu</td></tr> <tr><td>de croissanceMolybdate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>243655</td><td>Milieux de croissance</td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Milieux de croissance</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>Milieux de croissance</td></tr><tr><td>Luria Bertani Broth</td><td>Sigma Aldrich L3022</td><td></td><td>Milieux de croissance</td></tr><tr><td>TCS SP2 Microscopie confocale</td><td>Leica</td><td></td><td>Imagerie fluorescente</td></tr><tr><td>SYTO 62</td><td>Life Technology</td><td>S11344</td><td>Imagerie fluorescente</td></tr><tr><td>Cy5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>PA15100</td><td>Imagerie fluorescente</td></tr><tr><td>Rouge Fluorescent (580/605) FluoSphere</td><td>Life Technology</td><td>F-8801</td><td>Imagerie fluorescente</td></tr><tr><td>BioSPA</td><td>Packman Lab</td><td></td><td>Traitement d’images</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Image Processing</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Image</td></tr><tr><td>Processing Streams 2.02</td><td>Université de Cantebury</td><td></td><td>Traitement d’images</td></tr></tbody></table>

méthodes de caractérisation de la co-développement de biofilms et habitat hétérogénéité

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Les biofilms sont des communautés microbiennes attachée surface qui ont des structures complexes et produisent hétérogénéités spatiales importantes. le développement du biofilm est fortement réglementé par le flux environnante et l&#39;environnement nutritionnel. la croissance du biofilm augmente également l&#39;hétérogénéité du microenvironnement local en générant des champs d&#39;écoulement complexes et des structures de transport de solutés. Pour étudier le développement de l&#39;hétérogénéité dans les biofilms et les interactions entre les biofilms et leur micro-habitat local, nous avons grandi biofilms mono-espèces de Pseudomonas aeruginosa et les biofilms double-espèces de P. aeruginosa et Escherichia coli sous gradients nutritionnels dans une cellule d&#39;écoulement microfluidique. Nous fournissons des protocoles détaillés pour la création de gradients de nutriments dans la cellule d&#39;écoulement et pour la culture et la visualisation de développement du biofilm dans ces conditions. Nous avons également des protocoles actuels pour une série de méthodes optiques de quantifier la répartition spatiale de la structure du biofilm, distri circulerbutions sur les biofilms, et le transport de masse autour et à l&#39;intérieur des colonies de biofilm. Ces méthodes prennent en charge des enquêtes approfondies de la co-développement du biofilm et l&#39;habitat hétérogénéité.

La cellule d'écoulement microfluidique à double entrée permet d'observer la croissance de biofilms sous un gradient chimique bien défini, créé par le mélange de deux solutions à l'intérieur de la chambre d'écoulement. Ce gradient chimique résultant a été précédemment observé par injection de colorant et caractérisé en détail par Song et al.14. Des gradients de concentration réguliers se formaient dans la direction transversale, comme illustré dans la Figure 1. Le profil de concentrati...

Les biofilms ont des interactions complexes avec leur environnement. Pour étudier de manière exhaustive les interactions biofilm-environnement, nous présentons ici une série de méthodes permettant de créer un environnement chimique hétérogène pour le développement de biofilms, de quantifier la vitesse d’écoulement locale et d’analyser le transport de masse dans et autour des colonies de biofilms.

Méthodes de caractérisation de la Co-développement de biofilms et Habitat Hétérogénéité

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

L'objectif général de cette procédure est de caractériser les interactions des biofilms avec l'environnement environnant à l'aide de méthodes intégrées. Un système de cellule d'écoulement microfluidique à double entrée est mis en place, dans lequel des milieux contenant du glucose et des milieux sans glucose sont pompés à travers une cellule d'écoulement, générant un gradient de glucose. Des bactéries sont ajoutées au système et les biofilms sont laissés à se développer sur plusieurs jours.Les biofilms sont ensuite observés par microscopie confocale 3D afin de caractériser le transport des solutés. Dans les biofilms, des traceurs fluorescents sont injectés dans le système d'écoulement et une imagerie en accéléré est réalisée pour caractériser le champ d'écoulement autour des colonies de biofilms ; des microbilles fluorescentes sont injectées et une imagerie en accéléré est effectuée. L'analyse du transport des solutés et du suivi des particules à partir des données obtenues démontre l'utilité de cette méthode pour évaluer les processus de biofilm dans divers environnements chimiques au sein d'un même dispositif et lors d'une seule série d'expériences.Le principal avantage de ces méthodes est qu'elles permettent d'évaluer simultanément plusieurs aspects des interactions entre les biofilms et leur environnement. Les méthodes décrites ici peuvent aider à répondre à des questions essentielles concernant la formation de biofilms dans des environnements naturels ou dans les infections liées aux biofilms. Dans une hotte à flux laminaire, transférer une colonie de Pseudomonas aeruginosa PAO1 GFP et une colonie d'Escherichia coli DH5α depuis une boîte de gélose LB vers des tubes séparés contenant trois millilitres de bouillon LB.Incuber les cultures toute la nuit à 37 degrés Celsius sous agitation à 225 tr/min. Ce système d'écoulement repose sur une cellule microfluidique à double entrée qui permet d'observer la croissance du biofilm sous un gradient chimique bien défini, formé par le mélange de deux solutions dans la chambre d'écoulement. Pendant l'écoulement, un gradient de concentration régulier s'établit dans la direction transversale.En raison de la diffusion, le profil de concentration est abrupt près de l'entrée et plus atténué en aval. Le jour de l'expérience, montez soigneusement le système d'écoulement. Commencez par fixer le tube dans la pompe péristaltique, puis reliez une extrémité du tube à une bouteille de milieu contenant 900 millilitres de milieu FAB avec du glucose, et l'autre extrémité à un piège à bulles.Répétez ce processus pour relier une deuxième bouteille de milieu contenant 900 millilitres de fab sans glucose à un deuxième piège à bulles. Ensuite, insérez des vannes trois voies juste avant les entrées de la cellule d'écoulement et reliez chacun des pièges à bulles à la cellule d'écoulement. Enfin, reliez la sortie de la cellule d'écoulement à une bouteille de déchets.Veillez à placer la cellule d'écoulement avec le côté de la lame couvre-objet vers le bas afin de permettre aux cellules en suspension de se déposer sur la lame. Une fois le système d'écoulement assemblé, mettez en marche la pompe péristaltique à un débit de 10 millilitres par heure pour chaque entrée afin de remplir le système. Le milieu fab est introduit par les deux entrées, le glucose étant fourni uniquement dans une des entrées. Ensuite, en travaillant sous hotte, diluez les deux cultures bactériennes à un ratio de un pour un dans un millilitre d'eau stérile, avec une DO 600 équivalente de 0,01 pour chaque bactérie, afin d'ensemencer la cellule d'écoulement. Utilisez une seringue en plastique stérile pour injecter 500 microlitres de l'inoculum dans chacune des entrées de la cellule d'écoulement via le robinet trois voies.Après l'injection, arrêtez la pompe et laissez les cellules bactériennes s'attacher au verre de couverture pendant une heure. Une fois les cellules attachées, réglez la pompe à 0,03 millilitre par minute pour chaque entrée et laissez le système circuler pendant trois jours à température ambiante, durant lesquels un biofilm se développe sous un gradient d'exposition au glucose. Une fois les trois jours écoulés, utilisez un marqueur et une règle pour tracer une grille sur la face du verre de couverture de la cellule d'écoulement en prévision de l'acquisition d'images.Cela permettra de localiser les régions d'imagerie à contre-colorer pour l'observation d'e coli. Commencez par éteindre les lumières afin d'assombrir la zone de travail, car le contre-colorant est sensible à la lumière. Utilisez une seringue pour injecter lentement un millilitre de colorant nucléique rouge fluorescent, perméant aux cellules et dilué, dans le robinet à trois voies en amont de la chambre d'écoulement.Arrêtez l'écoulement. Laissez la cellule d'écoulement stagnante dans l'obscurité pendant 30 minutes. Une fois les 30 minutes écoulées.Reprendre le débit à 0,03 millilitre par minute et laver l'excès de colorant pendant 15 minutes. Ensuite, arrêter l'écoulement et observer les biofilms par microscopie confocale avec un objectif 63 x. Choisir un champ contenant une quantité suffisante de biomasse, avec des colonies de biofilm bien séparées, comme illustré ici.Ensuite, acquérez des séries d'images 3D dans les canaux appropriés afin de cartographier les motifs spatiaux du développement du biofilm à l'intérieur de l'image de la chambre d'écoulement, les biofilms à trois distances longitudinales ou selon l'axe X ou plus à partir de l'entrée de la chambre d'écoulement, et à trois positions transversales ou selon l'axe Y par rapport au gradient nutritionnel imposé. Pour caractériser les motifs de transport des solutés au sein du biofilm, commencez par la chambre d'écoulement. Après trois jours de développement du biofilm, travaillez à nouveau dans l'obscurité.Arrêtez la pompe pour interrompre le débit, ouvrez les purgeurs d'air pour relâcher la pression d'injection. Ensuite, utilisez une seringue pour injecter un millilitre de solution diluée de traceur sci-fi dans l'une des deux valves à trois voies en amont de la cellule d'écoulement. Après l'injection de la solution sci-fi, fermez les purgeurs d'air.Régler le robinet à trois voies et réactiver la pompe à 0,03 millilitre par minute pour acheminer la solution sci-fi dans la cellule d'écoulement. Ensuite, passer le mode d'imagerie confocale en XYT avec une fréquence d'images de 0,15 hertz. Une résolution temporelle élevée est préférable pour visualiser la pénétration du colorant, cependant, un balayage rapide diminue la qualité des images.Réglez ainsi la vitesse de balayage et la moyenne des lignes afin d'équilibrer la résolution temporelle de l'imagerie et la qualité de l'image. Une fois les paramètres d'imagerie définis, redémarrez la pompe pour reprendre l'écoulement. À un débit de 0,03 millilitre par minute, sci cinq sera introduit simultanément dans la cellule d'écoulement.Initier l'imagerie confocale en mode laps de temps. Une fois l'acquisition en mode laps de temps terminée, effectuer l'analyse de diffusion conformément aux instructions du document joint.Pour caractériser le champ d'écoulement autour des biofilms, diluez les microbilles fluorescentes d'un micromètre dans de l'eau stérilisée jusqu'à une concentration finale en solide de 0,2 % et un volume final de 0,5 millilitre. Ensuite, vortexez pour vous assurer que les microbilles sont bien dispersées, arrêtez l'écoulement, puis injectez et introduisez les microbilles fluorescentes diluées dans la cellule d'écoulement. Comme précédemment, réglez le débit à 0,01 millilitre par heure.Le faible débit permet un suivi précis du trajet de la particule. Passez les paramètres du microscope confocal en mode XYT et demandez au logiciel de suivre le mouvement des particules dans une seule coupe en Z. Capturez des séries temporelles d'images comme précédemment, en utilisant une fréquence d'images de un hertz. Répétez la procédure d'injection de particules et effectuez des acquisitions d'images à différentes positions en Z. Une fois l'acquisition terminée, suivez les instructions du document accompagnant pour calculer les vecteurs d'écoulement afin d'étudier les interactions bactériennes dans un biofilm soumis à un gradient de glucose. Posa GFP et E. coli ont été différenciés dans des biofilms à deux espèces par coloration contrastée.Avec le cyto, 62 images ont été acquises dans chacune des neuf régions d'imagerie sur la chambre d'écoulement. Dans les superpositions montrées ici, le Posa GFP apparaît en vert ou en jaune, et l’E. coli apparaît en rouge. Le Posa dominait la biomasse du biofilm dans les régions à forte concentration de glucose, tandis que l’E. coli dominait dans les régions à faible concentration de glucose.Ainsi, les deux espèces occupaient des niches écologiques distinctes. Ces résultats démontrent l'utilité de la cellule d'écoulement microfluidique à double entrée pour l'étude de l'activité de développement des biofilms et de leurs interactions dans des environnements complexes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser une cellule d'écoulement microfluidique à double entrée pour cultiver des biofilms sous des gradients chimiques, et comment obtenir des paramètres environnementaux relatifs au développement des biofilms à l'aide d'injections de particules fluorescentes ou de traceurs, après le développement.Ces méthodes ont ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la microbiologie environnementale et clinique pour explorer les interactions complexes entre les communautés microbiennes et leur environnement proche.

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