Méthodes de caractérisation de la Co-développement de biofilms et Habitat Hétérogénéité

L’objectif global de cette procédure est de caractériser les interactions du biofilm avec l’environnement environnant à l’aide de méthodes intégrées. Un système de cellules d’écoulement microfluidique à double entrée est construit dans lequel des fluides contenant du glucose et des fluides sans glucose sont pompés à travers une cellule d’écoulement générant un gradient de glucose. Des bactéries sont ajoutées au système et des biofilms sont laissés se développer sur plusieurs jours.

Les biofilms sont ensuite imagés par microscopie confocale 3D pour caractériser le transport des solu. Dans les biofilms, des traceurs fluorescents sont injectés dans le système d’écoulement et une imagerie en accéléré est effectuée pour caractériser le champ d’écoulement autour des colonies de biofilms, des microbilles fluorescentes sont injectées et une imagerie en accéléré est effectuée. L’analyse du transport de solutés et du suivi des particules des données résultantes démontre l’utilité de cette méthode pour évaluer les processus de biofilm dans divers environnements chimiques au sein d’un seul appareil et d’une seule série d’expériences.

Le principal avantage de ces méthodes est qu’elles permettent d’évaluer simultanément de multiples aspects des interactions entre l’environnement du biofilm. Les méthodes rapportées ici peuvent aider à répondre à des questions clés sur la formation de biofilms dans les environnements naturels ou dans les infections liées au biofilm. En travaillant dans une hotte à flux laminaire, transférez une colonie de posa PAO, une extrémité GFP une colonie de e coli DH cinq alpha d’une plaque LB dans des tubes séparés contenant trois millilitres de bouillon lb.

Incuber les cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius tout en secouant à 225 tr/min. Ce système d’écoulement est basé sur une cellule microfluidique à double entrée qui facilite l’observation de la croissance du biofilm sous un gradient chimique bien défini formé par le mélange de deux solutions à l’intérieur de la chambre d’écoulement. Pendant l’écoulement, un gradient de concentration lisse se forme dans la direction transversale.

En raison de la diffusion, le profil de concentration est raide près de l’entrée et plus détendu en aval. Le jour de l’expérience, assemblez soigneusement le système d’écoulement. Tout d’abord, fixez le tube dans la pompe péristaltique, puis fixez une extrémité du tube à une bouteille moyenne contenant 900 millilitres de milieu FAB avec glucose, et l’autre extrémité à un piège à bulles.

Répétez ce processus pour connecter une deuxième bouteille moyenne contenant 900 millilitres de fab sans glucose à un deuxième piège à bulles. Ensuite, insérez des vannes à trois voies juste avant les entrées de la cellule d’écoulement et connectez chacun des pièges à bulles à la cellule d’écoulement. Enfin, connectez la sortie de la cellule d’écoulement à une bouteille à déchets.

Assurez-vous que la cellule d’écoulement est placée avec la lamelle vers le bas pour permettre aux cellules suspendues de se déposer sur la lamelle. Une fois le système d’écoulement assemblé, allumez la pompe péristaltique à un débit de 10 millilitres par heure pour chaque entrée afin de remplir le système Avec le milieu fab est introduit dans les deux entrées avec un glucose fourni uniquement dans une entrée. Ensuite, en travaillant dans la hotte, diluez les deux cultures bactériennes à un rapport de un pour un millilitre d’eau stérile avec une OD 600 équivalente de 0,01 pour chaque bactérie afin d’inoculer la cellule d’écoulement, utilisez une seringue en plastique stérile pour injecter 500 microlitres d’inoculum dans chacune des entrées de la cellule d’écoulement via la vanne à trois voies.

Après l’injection, arrêtez la pompe et laissez les cellules bactériennes se fixer au verre de protection pendant une heure après la fixation des cellules, réglez la pompe à 0,03 millilitre par minute pour chaque entrée et laissez le système s’écouler pendant trois jours à température ambiante au cours desquels un biofilm se développe sous un gradient d’exposition au glucose. Après trois jours se sont écoulés. À l’aide d’un marqueur et d’une règle, dessinez une grille sur le côté vitre de la cellule d’écoulement en vue de l’imagerie.

Cela aidera à localiser les régions d’imagerie pour contrer la coloration pour la visualisation d’e coli. Tout d’abord, éteignez les lumières pour assombrir la zone de travail car la tache du comptoir est sensible à la lumière. À l’aide d’une seringue, injectez lentement un millilitre de colorant d’acide nucléique fluorescent rouge perméable aux cellules diluées dans la valve à trois voies en amont de la chambre d’écoulement.

Arrêtez le flux. Gardez la cellule d’écoulement stagnante dans l’obscurité pendant 30 minutes. Après 30 minutes se sont écoulées.

Reprenez le débit à 0,03 millilitre par minute et lavez la tache non liée pendant 15 minutes. Ensuite, arrêtez l’écoulement et observez les biofilms à l’aide de la microscopie confocale avec un objectif 63x. Trouvez un champ de vision contenant une bonne quantité de biomasse avec des colonies de biofilm bien séparées comme indiqué ici.

Capturez ensuite des piles d’images 3D dans les canaux appropriés pour cartographier les modèles spatiaux de développement du biofilm dans l’image de la cellule d’écoulement, les biofilms à trois distances longitudinales ou X ou plus le long de l’entrée de la cellule d’écoulement, et à trois positions transversales ou Y par rapport au gradient nutritionnel imposé. Pour caractériser les modèles de transport de solu dans le biofilm, il faut commencer par la cellule d’écoulement. Après trois jours de développement du biofilm, encore une fois, je travaillais dans l’obscurité.

Arrêtez la pompe pour interrompre le débit, ouvrez les pièges à bulles pour relâcher la pression d’injection. Ensuite, à l’aide d’une seringue, injectez un millilitre de solution diluée de traceur de science-fiction dans l’une des vannes à trois voies en amont de la cellule d’écoulement. Après avoir injecté la solution de science-fiction, fermez les pièges à bulles.

Ajustez la vanne à trois voies et redémarrez la pompe à 0,03 millilitre par minute pour délivrer la solution de science-fiction dans la cellule d’écoulement. Ensuite, basculez le mode d’imagerie confocal sur XYT avec une fréquence d’images de 0,15 hertz. Une résolution temporelle élevée est préférée pour verbaliser la pénétration du colorant, cependant, un balayage rapide diminue la qualité de l’image.

Réglez donc la vitesse de balayage et la moyenne de ligne pour équilibrer la résolution temporelle de l’imagerie et la qualité de l’image. Une fois les paramètres d’imagerie réglés, redémarrez la pompe pour reprendre le débit. À un rythme de 0,03 millilitre par minute, sci cinq seront délivrés simultanément dans la cellule d’écoulement.

Lancez l’imagerie confocale en accéléré. Une fois l’imagerie time-lapse terminée. Réalisation d’une analyse de diffusion selon les instructions du document d’accompagnement.

Pour caractériser le champ d’écoulement autour des biofilms, diluez les microbilles fluorescentes d’un micromètre dans de l’eau stérilisée jusqu’à une concentration solide finale de 0,2 % et un volume final de 0,5 millilitre. Ensuite, faites un vortex pour vous assurer que les microbilles sont bien dispersées, interrompez l’écoulement, puis injectez et délivrez les microbilles fluorescentes diluées dans la cellule d’écoulement. Comme précédemment, modifiez le débit à 0,01 millilitre par heure.

Le faible débit permet un suivi précis du trajet des particules. Basculez les paramètres confocaux en mode XYT et demandez au logiciel de suivre le mouvement des particules dans une tranche Z. Capturez des images de séries chronologiques comme auparavant en utilisant une fréquence d’images d’un hertz.

Répétez la procédure d’injection de particules et imagez à différents endroits Z. Une fois l’imagerie terminée, suivez les instructions du document d’accompagnement pour calculer les vecteurs d’écoulement afin d’étudier les interactions bactériennes dans un biofilm sous un gradient de glucose. Posa GFP et E coli ont été différenciés dans les biofilms d’espèces doubles par contre-coloration.

Avec cyto, 62 images ont été acquises dans chacune des neuf régions d’imagerie de la chambre d’écoulement. Dans les superpositions illustrées ici, posa GFP apparaît vert ou jaune, et e coli apparaît rouge. Posa a dominé la biomasse du biofilm dans les régions à fortes concentrations de glucose et E. coli a dominé dans les régions à faible concentration de glucose.

Ainsi, les deux espèces occupaient des niches écologiques distinctes. Ces résultats démontrent l’utilité de la cellule d’écoulement microfluidique à double entrée dans l’étude de l’activité de développement et des interactions de biofilms dans des environnements complexes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser une cellule à flux microfluidique à double entrée pour faire pousser des biofilms sous des gradients chimiques et comment obtenir des paramètres environnementaux pour le développement de biofilms en utilisant les injections de particules fluorescentes ou de chasseurs après le développement.

Ces méthodes ont ouvert la voie aux chercheurs dans les domaines de la microbiologie environnementale et clinique pour explorer les interactions complexes entre les communautés microbiennes et leur environnement.