Name: Lepr Db Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging dîlots intacts (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Découvrez l'isolement d'îlots pancréatiques chez la souris Lepr db et l'imagerie biphotonique pour étudier la sécrétion d'insuline en temps réel. Cette méthode permet d'analyser les mécanismes cellulaires du diabète de type 2.

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Ce travail a été soutenu par une subvention du Conseil australien de la recherche DP110100642 (à PT) et des subventions du Conseil national de la santé et de la recherche médicale APP1002520 et APP1059426 (à PT et HYG).

NOTE: Toutes les expériences actuelles ont été réalisées conformément aux procédures locales d&#39;éthique animale de l&#39;Université de Queensland (approuvés par l&#39;Université du Queensland, Comité d&#39;éthique Biosciences anatomique). 1. Isolement îlots <ol><li> Préparation des réactifs <ol><li> Mélange d&#39;enzymes <ol><li> Pour la digestion du pancréas, utilisez un mélange de libérase et de la collagénase de type IV. Diluer libérase TL (thermolysine bas) 1 flacon de 5 mg avec 26 ml de DMEM (milieu de Eagle modifié Dulbecco). </li><li> Préparer la collagénase de type IV dans du tampon de Hank à une concentration de 0,5 mg / ml, supplémenté avec 5 mM de HEPES, 0,5 mM de CaCl2, 0,1 mg / ml de DNAse et de 1 mg / ml d&#39;albumine de sérum bovin. </li><li> Mélanger la TL Libérase et des solutions de collagénase dans un rapport de 4: 1 (en volume), soit 4 ml Libérase TL + 1 ml de collagénase. Aliquoter le mélange d&#39;enzymes pour 2,5 ml chacun et conserver à -20 ° C. NOTE: Les temps d&#39;incubation de tissu vvier un bit entre des lots d&#39;enzyme (30 sec à 1 min de différence). Par conséquent, un essai de traitement par lots peut être nécessaire. </li></ol></li><li> RPMI Isolation médias <ol><li> Dissoudre un flacon de poudre dans du milieu RPMI 1640 1 L d&#39;eau à la température ambiante et compléter avec 2 g de NaHCO 3, 4,02 g d&#39;HEPES. </li><li> Combiner les médias d&#39;isolement RPMI dans une grande fiole conique, mélanger avec un agitateur magnétique, ajuster à pH 7,4 avec NaOH, filtre stériliser et conserver à 4 ° C. </li></ol></li><li> RPMI Culture Media </li><li> Utilisation des milieux de culture RPMI avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% d&#39;antibiotiques (par exemple, de la pénicilline 100 U / ml, streptomycine 100 pg / ml). </li></ol></li><li> Isolement et culture des Islet <ol><li> Sacrifice des animaux <ol><li> Sacrifiez la souris par dislocation cervicale ou CO 2 asphyxie selon les procédures d&#39;éthique de l&#39;institution locale. Vaporiser le corps de la souris à fond avec de l&#39;éthanol 70%. </li></ol></li><li> Perfusion pancréatique <ol><li> USE 2 coupes longues latéralement à travers la peau de l&#39;abdomen et du péritoine pour faire un rabat en forme de V. Tirez le rabat de la peau vers le haut pour découvrir la totalité de la cavité abdominale, mettre de côté l&#39;intestin et de garder le foie en place par un mouchoir en papier plié pour révéler le canal cholédoque (figures 1 et 2). Mettez l&#39;animal de sorte que la tête vers le chirurgien et la queue loin du chirurgien. </li><li> Appliquer une pince vasculaire à l&#39;ampoule sur la paroi du duodénum pour bloquer les enzymes injecté de pénétrer dans le duodénum (Figure 1). NOTE: Ceci est une étape importante car elle détermine si les enzymes injectées iront dans le canal pancréatique et perfuser le pancréas ou de reflux au site d&#39;injection (plus de pince) ou aller dans le duodénum (sous serre). </li><li> Cathétériser le canal cholédoque avec une aiguille 31 G près de la jonction du canal hépatique commun et canal cystique (Figure 1) et laisser la place à une deuxième injection si èmee pancréas ne parvient pas à perfuser la première fois. Lentement (~ 10 sec) injecter environ 2 ml de mélange d&#39;enzymes froid dans la souris canal cholédoque. NOTE: Le pancréas seront perfusés rapidement si la pince est dans la bonne position. </li><li> Ajustez la position de serrage si l&#39;aiguille est à l&#39;intérieur du canal cholédoque, mais ne peut pas perfuser le pancréas (ie., Se déplacer jusqu&#39;à la pince un peu loin du foie si plus serré ou vers le bas un peu pour le foie si, en vertu serré). REMARQUE: L&#39;aiguille va parfois dans la capsule qui entoure au lieu de la lumière du conduit. Un signe utile de vérifier si l&#39;aiguille est à l&#39;intérieur du canal cholédoque est la dilatation du canal lors de l&#39;injection. Si le pancréas ne parvient pas à perfuser, une alternative est le mélange d&#39;enzymes peut être injecté à plusieurs sites du pancréas avec un rendement plus faible prévu. La perfusion de l&#39;emplacement gauche du pancréas (le lobe splénique) est important pour la maximisation du rendement d&#39;îlots de Langerhans. </li><li> Après le pancréas est perfused, enlever rapidement le pancréas, le mettre dans un flacon (~ 20 ml, verre) et incuber pendant ~ 19 min dans un bain d&#39;eau à 37 C ° de. NOTE: Le temps d&#39;incubation peut varier un peu en fonction de la souche de souris et de l&#39;âge. </li><li> Après le temps d&#39;incubation, arrêter le processus de digestion en ajoutant ~ 20 ml de milieux d&#39;isolement froid. Agiter doucement le flacon pour perturber le pancréas et le verser dans un tamis de thé normal (diamètre de pore de 1 mm) dans un tube de 50 ml stérile. Compléter le tube avec les médias d&#39;isolement et centrifuger à 400 g pendant 1 min à 4 ° C avec frein off. </li><li> Dissoudre le culot dans les médias de l&#39;isolement et de transférer à nouveau à deux tubes de 15 ml, puis centrifuger à 400 g pendant 1 min à 4 ° C avec frein off. Après aspiration du surnageant, mélanger les deux pastilles bien avec 6 ml de milieu de séparation des cellules de gradient de densité (Histopaque 1077 solution) par tube au vortex ou aspiration et refoulement. Puis ajouter délicatement ~ 6 ml de milieux d&#39;isolement sur le côté du tube au-dessus deles milieux de séparation de gradient de densité et centrifuger à 100 g pendant 15 min à 4 ° C avec frein off. </li><li> Recueillir le surnageant dans le (milieux d&#39;isolement) supérieure, moyenne et inférieure (densité cellulaire gradient milieux de séparation) couche en 3 plats séparés. Retirez à la main les îlots dans ces trois plats, en utilisant une pipette sous un microscope à dissection. NOTE: La couche intermédiaire contient la plupart des îlots. Les îlots sont reconnus comme des structures compactes de ~ 50 à 500 um de taille (Figure 3). Nous obtenons ~ 200 îlots de souris WT et 300 à &lt;100 îlots de souris db / db. </li></ol></li><li> La culture Islet <ol><li> Pour aider les îlots se remettre de la digestion enzymatique, des groupes de culture de 40 îlots dans une boîte de Pétri de 25 cm avec 6 ml RPMI milieux de culture (10 mM de glucose) à 37 ° C, 5% / 95% de CO 2 / O 2 pendant 2 jours avant en direct -cell 2 photons imagerie. Changer les milieux de culture quotidienne. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Live Cell 2-Photon Imaging <ol><li> Préparation des réactifs <ol><li> Extracellulaire Buffer <ol><li> Préparer le tampon de sodium extracellulaire riche pour le dosage de deux photons avec 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 5 mM de NaHCO 3 et 10 mM de HEPES. </li></ol></li><li> Extracellulaire Dye <ol><li> Pour le test 2-photon, préparer stocks SRB 8 mM dans un tampon extracellulaire, aliquote dans des petits tubes et conserver à -20 ° C. Diluer le stock SRB 1:10 dans un tampon extracellulaire frais pour obtenir une concentration de travail de 0,8 mm. </li></ol></li></ol></li><li> photon Imaging <ol><li> Tout d&#39;abord, pré-incubation de 2 jours îlots cultivés en 3 mM de tampon glucose extracellulaire pendant 30 min. NOTE: Nous utilisons îlots entre 2 et 5 jours dans la culture. </li><li> Ensuite, placez une lame de verre sur la chambre thermo-commande monté sur la platine du microscope. Utiliser de la graisse pour empêcher la fuite de solution. </li><li> Couvrir la chambre avec 500 pi de extracellparti- tampon contenant 0,8 mM SRB avec des concentrations de glucose différentes (3 mm, 6 mm, 15 mm et 20 mM de glucose). </li><li> Ensuite, placer l&#39;îlot pré-incubées dans le milieu de la chambre et de se concentrer à 3-4 couches de cellules dans l&#39;îlot où, dans les îlots de rongeurs, immunocoloration pour l&#39;insuline montre que la plupart des cellules sont des cellules bêta. NOTE: Le SRB décrira tous la membrane cellulaire de l&#39;îlot rapidement et l&#39;îlot est prêt à l&#39;image. </li><li> Utilisation d&#39;un microscope à 2 photons avec un objectif 60X à immersion dans l&#39;huile (1,42 NA) et un logiciel d&#39;imagerie (par exemple., ScanImage 11). La figure 4 illustre un dispositif de microscopie classique. Image des événements d&#39;exocytose utilisant SRB comme une membrane impermeant marqueur extracellulaire fluorescente excitée par des impulsions laser femtosecondes à 880 nm, avec fluorescence détectée à 550-650 nm. Notez les réponses des îlots à la stimulation. </li><li> Identifier les événements d&#39;exocytose simples par l&#39;apparition soudaine d&#39;une petite tache fluorescente (résolution de 10 pixels /1; m) et confirmer par la phase de montée rapide du signal fluorescent sur ​​une région d&#39;intérêt (~ 0,78 um 2). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).</li>
<li>Ashcroft, F. M., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus+and+the+beta+cell%3A+The+last+ten+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years.</a> Cell. 148, 1160-1171 (2012).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53, S16-S21 (2004).</li>
<li>Kjorholt, C., Akerfeldt, M. C., Biden, T. J., Laybutt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hyperglycemia%2C+independent+of+plasma+lipid+levels%2C+is+sufficient+for+the+loss+of+beta-cell+differentiation+and+secretory+function+in+the+db%2Fdb+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Chronic hyperglycemia, independent of plasma lipid levels, is sufficient for the loss of beta-cell differentiation and secretory function in the db/db mouse model of diabetes.</a> Diabetes. 54, 2755-2763 (2005).</li>
<li>Wang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+type+2+diabetic+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Spontaneous type 2 diabetic rodent models.</a> Journal of Diabetes Research. , (2013).</li>
<li>Hummel, K. P., Dickie, M. M., Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+a+new+mutation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diabetes a new mutation in mouse.</a> Science. 153, 1127-1128 (1966).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Gaisano, H. Y., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+deficit+in+islets+from+db%2Fdb+mice+is+mainly+due+to+a+loss+of+responding+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The secretory deficit in islets from db/db mice is mainly due to a loss of responding beta cells.</a> Diabetologia. 57, 1400-1409 (2014).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+principally+regulates+insulin+secretion+in+mouse+islets+by+controlling+the+numbers+of+granule+fusion+events+per+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose principally regulates insulin secretion in mouse islets by controlling the numbers of granule fusion events per cell.</a> Diabetologia. 56, 2629-2637 (2013).</li>
<li>Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+pore+dynamics+and+insulin+granule+exocytosis+in+the+pancreatic+islet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet.</a> Science. 297, 1349-1352 (2002).</li>
<li>Low, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+secretion+from+beta+cells+in+intact+mouse+islets+is+targeted+towards+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature.</a> Diabetologia. 57, 1655-1663 (2014).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2, 13(2003).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le facteur le plus critique dans l&#39;isolement d&#39;îlots est la perfusion initiale du pancréas; un sous perfusion du pancréas résultats avec un rendement d&#39;îlots considérablement plus faible. D&#39;autres facteurs affectent également la qualité de l&#39;isolation tel que le temps de digestion et le niveau d&#39;agitation qui peut compenser en partie au niveau de la perfusion. Par exemple, un pancréas perfusés pleinement devra être incubées à 37 ° C pendant ~ 18 min 30 sec tout en agitant doucement, à la différen...

Le rôle d&#39;un dysfonctionnement des cellules bêta dans la maladie a été largement reconnu 3,4. Des lignées cellulaires telles que la MIN6 et INS-1 sont des outils utiles pour comprendre la biologie de comportement des cellules bêta. Toutefois, le contrôle physiologique de la sécrétion d&#39;insuline a lieu dans les îlots de Langerhans. Ces îlots contiennent des milliers de cellules bêta serrées, ainsi que les vaisseaux sanguins et d&#39;autres types de cellules endocrines. Cet environnement au sein de l&#39;îlot influe sur la sécrétion d&#39;insuline et est susceptible d&#39;être important dans le diabète. Par conséquent, pour comprendre le contrôle physiologique de la sécrétion d&#39;insuline, et la physiopathologie de la maladie, il est essentiel d&#39;étudier îlots intacts. isolement des îlots Îlots humains vivants et, en particulier, des îlots humains provenant de patients atteints de diabète de type 2 sont difficiles à obtenir. En outre, des îlots humains ont des possibilités limitées pour la manipulation moléculaire expérimentale. Les chercheurs ont donc utilisé estpermet à partir d&#39;animaux et des modèles animaux de diabète de type 2. Un tel modèle de la maladie est la souris db / db. Ceci est une mutation spontanée que les modèles diabète de type 2 avec une progression de phénotype qui se rapproche étroitement de la maladie humaine 5,6. Le protocole présenté ici pour isolement des îlots de souris db / db diabétiques comporte de nombreuses étapes en commun avec d&#39;autres groupes avec quelques améliorations pour un meilleur rendement, la purification et le renforcement de la survie de l&#39;îlot. 2 imagerie photonique Le dosage des cellules vivantes 2 photons décrit ici permet aux chercheurs de quantifier le nombre et évaluer les caractéristiques des granulés contenant de l&#39;insuline à partir de cellules simples de 7 et diabétique de type sauvage îlots 8,9.

<table><tbody><tr><td>Liberase TL 5 mg</td><td></td> <td>Roche-5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type IV-1g</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1077 500 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (10x) 1L</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R1383</td><td>pour préparer le milieu d’isolation</td></tr><tr><td>RPMI 1640 (1x) 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21870-076</td><td>pour préparer des milieux de culture</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine 100 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>pour préparer des milieux de culture&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin 500 ml</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10099-141</td><td>pour préparer un milieu cultivé</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11966-025</td><td>pour diluer la libérase</td></tr><tr><td>programme Metamorph</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>pour analyser les images à 2 photons</td></tr></tbody></table>

lepr<sup&gt; db</sup&gt; modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-photon imaging d&#39;îlots intacts

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Le diabète de type 2 est une maladie chronique qui touche 382 millions de personnes en 2013, et devrait atteindre 592 millions d&#39;ici 2035 1. Au cours des deux dernières décennies, le rôle de la dysfonction des cellules bêta dans le diabète de type 2 a été clairement établi 2. progrès de la recherche a nécessité des procédés pour l&#39;isolement des îlots pancréatiques. Le protocole de l&#39;isolement des îlots présenté ici part de nombreuses étapes communes avec des protocoles d&#39;autres groupes, avec quelques modifications pour améliorer le rendement et la qualité des îlots isolés à la fois du type sauvage et db Lepr diabétique de souris (db / db). Un des cellules vivantes Procédé d&#39;imagerie à 2 photons est ensuite présenté qui peut être utilisée pour étudier le contrôle de la sécrétion d&#39;insuline des îlots à l&#39;intérieur.

Rendement Islet et la purification Pour un type sauvage souris normale, environ 200 îlots sont attendus. Îlots sains regarder lumineux, de forme ronde et avoir une frontière lisse. Un lot d&#39;isolement sur ​​digéré a généralement petites et floues îlots tandis qu&#39;un lot de sous-digéré a moins îlots et attachée cellules îlots acineuses (Figure 3). Pour les souris diabétiques db / db, le rendement de l&#39;îlot et l&#39;apparence dépend de la progression de la maladie av...

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des îlots à partir du modèle murin de diabète de type 2, Leprdb et les détails d’un test sur cellules vivantes pour la mesure de la sécrétion d’insuline à partir d’îlots intacts qui utilise la microscopie à 2 photons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des ilots viables et vivants de souris diabétiques LEP R DB, puis d'évaluer la sécrétion d'insuline par les cellules bêta au sein des ilots à l'aide d'une imagerie photonique sur cellules vivantes. Cette approche repose d'abord sur la préparation de réactifs tels que le mélange enzymatique destiné à la digestion du pancréas, le milieu de culture pour l'entretien des ilots, et le tampon extracellulaire utilisé pour le dosage par deux photons. Ensuite, l'abdomen d'une souris euthanasiée est ouvert et le mélange enzymatique est injecté dans le pancréas afin de digérer l'organe.Ensuite, les ilots sont séparés du tissu pancréatique digéré et mis en culture. Enfin, la microscopie à deux photons est utilisée pour visualiser les fusions individuelles de granules d'insuline provenant des cellules bêta à l'intérieur des ilots. En définitive, ce protocole aidera les chercheurs à comprendre comment la sécrétion d'insuline est régulée dans l'état physiologique et en situation pathologique.L'amélioration principale de la technique d'isolement des ilots réside dans l'utilisation d'enzymes mixtes afin d'augmenter le rendement et la viabilité des ilots. La technique d'imagerie à deux photons est actuellement la seule méthode permettant d'enregistrer la sécrétion d'insuline à partir de plusieurs cellules au sein d'un ilot intact. Pour préparer les enzymes destinées à l'isolement des ilots pancréatiques, diluez un flacon de cinq milligrammes de lyase TL avec 26 millilitres de DMEM, préparez la collagénase de type IV dans du tampon de Hank à une concentration de 0,5 milligramme par millilitre, puis complétez avec les solutions mixtes de lyase TL et de collagénase.Dans un rapport de quatre à un par volume, aliquoter le mélange d'enzymes en portions de 2,5 millilitres chacune et conserver à moins 20 degrés Celsius. Pour préparer le milieu d'isolement RPMI dans un grand flacon conique contenant un litre d'eau, dissoudre un flacon de poudre RPMI 1 6 4 0 à température ambiante et compléter avec deux grammes de bicarbonate de sodium et 4,02 grammes de hippes. Utiliser de l'hydroxyde de sodium pour ajuster le pH à 7,4, puis filtrer, stériliser et conserver à quatre degrés Celsius.Préparez le milieu de culture RPMI en ajoutant 10 % de FBS et 1 % d'antibiotiques au milieu d'isolement RPMI pour l'imagerie à deux photons. Préparez un tampon extracellulaire riche en sodium à l'aide des réactifs suivants. Pour préparer le colorant extracellulaire, réalisez un stock à huit millimolaire de SRB, divisez un aliquot de tampon extracellulaire en petites tubes et conservez à moins 20 degrés Celsius.Pour obtenir une concentration de travail, utilisez du tampon extracellulaire frais pour diluer le SRB stock d’un facteur un à dix. Après avoir sacrifié une souris et pulvérisé soigneusement le corps de la souris avec de l’éthanol à 70 % conformément au protocole décrit, placez l’animal de manière à ce que la tête soit orientée vers le chirurgien et la queue éloignée de celui-ci. Effectuez deux longues incisions latérales à travers la peau abdominale et le péritoine afin de former un lambeau en forme de V.Tirer le lambeau de peau vers le haut afin de découvrir toute la cavité abdominale. Mettre l'intestin de côté et, à l'aide du tissu plié, maintenir le foie en place pour révéler le canal cholédoque. Ensuite, appliquer une pince vasculaire au niveau de l'ampoule de la paroi duodénale afin d'empêcher les enzymes injectées d'entrer dans le duodénum.Il s'agit d'une étape importante qui détermine si les enzymes pancréatiques pénètrent dans le canal pancréatique par reflux, au site d'injection, ou dans le duodénum. Utilisez une aiguille de calibre 31 pour canuler le canal cholédoque près de la jonction du canal hépatique commun et du canal kystique, en laissant de la place pour une deuxième injection. Si le pancréas n'est pas correctement perfusé lors de la première tentative, injectez lentement environ deux millilitres de mélange d'enzymes froid dans le canal cholédoque de la souris.Si le clamp est bien positionné, le pancréas sera rapidement perfusé. Une fois le pancréas perfusé, retirer rapidement l'organe, le placer dans un flacon en verre et l'incuber dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant environ 19 minutes. Après l'incubation, arrêter le processus de digestion en ajoutant environ 20 millilitres de milieu d'isolement froid.Agiter doucement le flacon pour désagréger le pancréas et verser le contenu à travers un tamis T normal de taille de pore d'un millimètre dans un tube stérile de 50 millilitres. Compléter le tube avec le milieu d'isolement et centrifuger à 400 G et 4 degrés Celsius pendant une minute. Avec la rupture, ajouter du milieu d'isolement au palais et le dissoudre.Ensuite, transférez la suspension dans deux tubes de 15 millilitres et effectuez une deuxième centrifugation. Après avoir aspiré le surnageant, ajoutez six millilitres de milieu de séparation cellulaire par gradient de densité dans chaque tube et mélangez par pipetage ou vortex pour resuspendre. Puis, le long de la paroi des tubes, ajoutez délicatement environ six millilitres de milieu d'isolement par-dessus le milieu de séparation par gradient de densité, et centrifugez à 100 ×g et à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes.Après la séparation, recueillir les couches supérieure, moyenne et inférieure dans trois boîtes distinctes. Ensuite, au microscope stéréoscopique, utiliser une pipette pour prélever manuellement les œillets dans les trois boîtes. La majorité se trouvera dans la couche moyenne, ce qui aidera les œillets à se remettre de la digestion enzymatique.Préparez des groupes de 40 îlots dans des boîtes de Pétri de 25 centimètres contenant six millilitres de milieu de culture RPMI avec 10 millimolaire de glucose et cultivez pendant deux jours. Changez le milieu quotidiennement afin d'effectuer une imagerie à deux photons comme test indirect pour mesurer la sécrétion d'insuline. Commencez par utiliser 3 millimolaire de glucose dans un tampon extracellulaire pour pré-incuber les îlots cultivés pendant deux jours.Pendant 30 minutes, appliquez de la graisse sur la platine du microscope pour éviter toute fuite de solution, puis fixez une chambre de contrôle thermique contenant une lame en verre sur la platine du microscope. Ensuite, recouvrez la chambre avec 500 microlitres de tampon extracellulaire contenant 0,8 millimolaire de SRB et diverses concentrations de glucose. Puis, placez l'anneau pré-incubé au centre de la chambre et focalisez-vous à trois ou quatre couches cellulaires à l'intérieur de l'anneau.Dans les îlots de rongeurs, la coloration immuno-histochimique pour l'insuline montre que la majorité des cellules sont des cellules bêta. Ensuite, à l'aide d'un microscope à deux photons équipé d'un objectif à immersion huile de 60 x, identifier les événements exocytaires individuels par l'apparition soudaine d'un petit point fluorescent. Enfin, dans le logiciel d'analyse d'image, confirmer un événement par la phase de montée rapide du signal fluorescent dans une région d'intérêt pour une souris de type sauvage.Environ 200 œillets sont attendus en utilisant le protocole démontré dans cette vidéo. Les œillets sains apparaissent brillants, de forme ronde et possèdent un bord régulier. Une digestion excessive lors de l'isolement donne généralement des œillets petits et flous, ainsi que des œillets auxquels sont attachées des cellules asar.Bien qu’un lot surexposé présente moins de pores dans le dosage à deux photons en réponse à des stimuli tels que le glucose ou l’insuline granulaire élevée en potassium, un SRB pénètre dans les granules, ce qui entraîne l’apparition d’un point fluorescent soudain d’environ 400 nanomètres de diamètre. Pendant la durée de l’enregistrement, tous les événements d’exocytose en réponse au stimulus sont identifiés ainsi que la localisation des événements, le moment de leur apparition, leur durée et le type de fusion. Des événements tels que KISS et Run ou la fusion complète sont caractérisés et s’avèrent utiles pour évaluer tout défaut de fusion des granules dans les modèles de diabète de type deux.Cette méthode a permis de montrer que le défaut observé dans les ilots pancréatiques de souris diabétiques DB DB est la perte de la fusion complète des granules, et non un changement dans la cinétique de la fusion individuelle des granules. En outre, le facteur le plus important influençant la sécrétion diminuée d'insuline dans la maladie est une réduction du nombre de cellules réactives. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre la perfusion pancréatique et l'activation des ilots à partir de souris RDB, et être également en mesure de réaliser les deux essais sur langue pour évaluer les réponses sécrétoires au sein d'ilots intacts.

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Dans cette vidéo, nous décrivons l’imagerie intravitale d’un pancréas de souris à travers une fenêtre stabilisée pour la visualisation à long terme de la dynamique cellulaire.

Imagerie intravitale : méthode d’observation cellulaire du pancréas de souris à travers une fenêtre d’imagerie stabilisée

Cette vidéo présente une méthode basée sur l’imagerie pour visualiser des cellules bêta transplantées exprimant la luciférase dans une souris immunodéficiente diabétique non obèse. L’introduction de splénocytes à partir d’une souris diabétique entraîne une destruction progressive des cellules bêta, confirmée visuellement par une diminution de la luminescence après l’introduction du substrat.

Imagerie des cellules bêta transgéniques chez une souris immunodéficiente confrontée à des splénocytes diabétiques

Une nouvelle approche combinant la greffe intraoculaire et la microscopie confocale permet longitudinale, non-invasive imagerie en temps réel avec une seule cellule de résolution au sein des tissus...

Transplantation dans la chambre antérieure de l&#39;oeil pour longitudinale, non-invasive<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie avec une seule cellule de résolution en temps réel

Les auteurs décrivent un protocole pour la visualisation de l’exocytose de l’insuline dans les îlots intacts à l’aide de pHluorin, une protéine fluorescente verte sensibles au pH. Les îlots isolés sont infectées par l’adénovirus encodage pHluorin couplé à la vésicule fret neuropeptide Y. Cela permet la détection des événements de fusion granule insuline par microscopie confocale.

Confocale, imagerie du Neuropeptide Y-pHluorin : une Technique pour visualiser l’insuline granules cytotoxiques dans les îlots murins et humains intacts

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Des études ex vivo îlots pancréatiques sont importants pour la recherche sur le diabète. Les techniques existantes pour étudier des îlots cultivés dans leur architecture 3D natif sont chronophages, inefficace et rarement utilisés. Cet ouvrage décrit une méthode nouvelle, simple et efficace pour générer des sections de paraffine de haute qualité des îlots cultivés ensemble.

Îlots pancréatiques, enrobage pour les Sections de paraffine

Ici, nous présentons un protocole pour la formation image et la quantification de la dynamique du calcium dans les populations cellulaires hétérogènes, telles que les cellules des isfètes pancréatiques. Les reporters fluorescents sont livrés dans la couche périphérique des cellules dans l'înet, qui est alors immobilisé et image, et l'analyse par cellule de la dynamique de l'intensité de fluorescence est effectuée.

Imagerie de la dynamique du calcium dans les sous-populations de cellules d'islet pancréatique de souris

Le but de ce protocole est de surveiller en permanence la dynamique du processus d’engraftage des îlots pancréatiques humains et des cellules d’hôte par rapport aux donneurs. Ceci est accompli en transplantant des îlots humains dans la chambre antérieure de l’oeil (ACE) d’un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receveur de souris suivi d’une imagerie répétée à 2 photons.

Imagerie in vivo longitudinale et quantification des îlots pancréatiques humains Greffant et contribution des cellules hôtes dans la chambre oculaire antérieure

Cette étude présente l’application de tranches de tissu pancréatique vivant à l’étude de la physiologie des îlots et des interactions entre les îlots et les cellules immunitaires.

Observation de la fonction des îlots et des interactions entre les îlots et les cellules immunitaires dans les tranches de tissu pancréatique vivant

L’imagerie in vivo à haute résolution du pancréas a été facilitée par la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique.

Visualisation longitudinale stabilisée au niveau cellulaire in vivo du pancréas dans un modèle murin avec une fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique

Nous proposons un protocole mini-invasif pour la transplantation intramusculaire d’îlots de cellules souches pancréatiques dérivées de cellules souches humaines dans des souris immunodéficientes pour une implantation in vivo et une analyse en aval.

Transplantation intramusculaire de cellules endocrines pancréatiques dérivées des cellules souches pluripotentes humaines chez la souris

Découvrez l'isolement d'îlots pancréatiques chez la souris Lepr db et l'imagerie biphotonique pour étudier la sécrétion d'insuline en temps réel. Cette méthode permet d'analyser les mécanismes cellulaires du diabète de type 2.

Lepr Db Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging dîlots intacts (Vidéo) | JoVE Journal

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