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L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des ilots viables et vivants de souris diabétiques LEP R DB, puis d'évaluer la sécrétion d'insuline par les cellules bêta au sein des ilots à l'aide d'une imagerie photonique sur cellules vivantes. Cette approche repose d'abord sur la préparation de réactifs tels que le mélange enzymatique destiné à la digestion du pancréas, le milieu de culture pour l'entretien des ilots, et le tampon extracellulaire utilisé pour le dosage par deux photons. Ensuite, l'abdomen d'une souris euthanasiée est ouvert et le mélange enzymatique est injecté dans le pancréas afin de digérer l'organe.

Ensuite, les ilots sont séparés du tissu pancréatique digéré et mis en culture. Enfin, la microscopie à deux photons est utilisée pour visualiser les fusions individuelles de granules d'insuline provenant des cellules bêta à l'intérieur des ilots. En définitive, ce protocole aidera les chercheurs à comprendre comment la sécrétion d'insuline est régulée dans l'état physiologique et en situation pathologique.

L'amélioration principale de la technique d'isolement des ilots réside dans l'utilisation d'enzymes mixtes afin d'augmenter le rendement et la viabilité des ilots. La technique d'imagerie à deux photons est actuellement la seule méthode permettant d'enregistrer la sécrétion d'insuline à partir de plusieurs cellules au sein d'un ilot intact. Pour préparer les enzymes destinées à l'isolement des ilots pancréatiques, diluez un flacon de cinq milligrammes de lyase TL avec 26 millilitres de DMEM, préparez la collagénase de type IV dans du tampon de Hank à une concentration de 0,5 milligramme par millilitre, puis complétez avec les solutions mixtes de lyase TL et de collagénase.

Dans un rapport de quatre à un par volume, aliquoter le mélange d'enzymes en portions de 2,5 millilitres chacune et conserver à moins 20 degrés Celsius. Pour préparer le milieu d'isolement RPMI dans un grand flacon conique contenant un litre d'eau, dissoudre un flacon de poudre RPMI 1 6 4 0 à température ambiante et compléter avec deux grammes de bicarbonate de sodium et 4,02 grammes de hippes. Utiliser de l'hydroxyde de sodium pour ajuster le pH à 7,4, puis filtrer, stériliser et conserver à quatre degrés Celsius.

Préparez le milieu de culture RPMI en ajoutant 10 % de FBS et 1 % d'antibiotiques au milieu d'isolement RPMI pour l'imagerie à deux photons. Préparez un tampon extracellulaire riche en sodium à l'aide des réactifs suivants. Pour préparer le colorant extracellulaire, réalisez un stock à huit millimolaire de SRB, divisez un aliquot de tampon extracellulaire en petites tubes et conservez à moins 20 degrés Celsius.

Pour obtenir une concentration de travail, utilisez du tampon extracellulaire frais pour diluer le SRB stock d’un facteur un à dix. Après avoir sacrifié une souris et pulvérisé soigneusement le corps de la souris avec de l’éthanol à 70 % conformément au protocole décrit, placez l’animal de manière à ce que la tête soit orientée vers le chirurgien et la queue éloignée de celui-ci. Effectuez deux longues incisions latérales à travers la peau abdominale et le péritoine afin de former un lambeau en forme de V.

Tirer le lambeau de peau vers le haut afin de découvrir toute la cavité abdominale. Mettre l'intestin de côté et, à l'aide du tissu plié, maintenir le foie en place pour révéler le canal cholédoque. Ensuite, appliquer une pince vasculaire au niveau de l'ampoule de la paroi duodénale afin d'empêcher les enzymes injectées d'entrer dans le duodénum.

Il s'agit d'une étape importante qui détermine si les enzymes pancréatiques pénètrent dans le canal pancréatique par reflux, au site d'injection, ou dans le duodénum. Utilisez une aiguille de calibre 31 pour canuler le canal cholédoque près de la jonction du canal hépatique commun et du canal kystique, en laissant de la place pour une deuxième injection. Si le pancréas n'est pas correctement perfusé lors de la première tentative, injectez lentement environ deux millilitres de mélange d'enzymes froid dans le canal cholédoque de la souris.

Si le clamp est bien positionné, le pancréas sera rapidement perfusé. Une fois le pancréas perfusé, retirer rapidement l'organe, le placer dans un flacon en verre et l'incuber dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant environ 19 minutes. Après l'incubation, arrêter le processus de digestion en ajoutant environ 20 millilitres de milieu d'isolement froid.

Agiter doucement le flacon pour désagréger le pancréas et verser le contenu à travers un tamis T normal de taille de pore d'un millimètre dans un tube stérile de 50 millilitres. Compléter le tube avec le milieu d'isolement et centrifuger à 400 G et 4 degrés Celsius pendant une minute. Avec la rupture, ajouter du milieu d'isolement au palais et le dissoudre.

Ensuite, transférez la suspension dans deux tubes de 15 millilitres et effectuez une deuxième centrifugation. Après avoir aspiré le surnageant, ajoutez six millilitres de milieu de séparation cellulaire par gradient de densité dans chaque tube et mélangez par pipetage ou vortex pour resuspendre. Puis, le long de la paroi des tubes, ajoutez délicatement environ six millilitres de milieu d'isolement par-dessus le milieu de séparation par gradient de densité, et centrifugez à 100 ×g et à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Après la séparation, recueillir les couches supérieure, moyenne et inférieure dans trois boîtes distinctes. Ensuite, au microscope stéréoscopique, utiliser une pipette pour prélever manuellement les œillets dans les trois boîtes. La majorité se trouvera dans la couche moyenne, ce qui aidera les œillets à se remettre de la digestion enzymatique.

Préparez des groupes de 40 îlots dans des boîtes de Pétri de 25 centimètres contenant six millilitres de milieu de culture RPMI avec 10 millimolaire de glucose et cultivez pendant deux jours. Changez le milieu quotidiennement afin d'effectuer une imagerie à deux photons comme test indirect pour mesurer la sécrétion d'insuline. Commencez par utiliser 3 millimolaire de glucose dans un tampon extracellulaire pour pré-incuber les îlots cultivés pendant deux jours.

Pendant 30 minutes, appliquez de la graisse sur la platine du microscope pour éviter toute fuite de solution, puis fixez une chambre de contrôle thermique contenant une lame en verre sur la platine du microscope. Ensuite, recouvrez la chambre avec 500 microlitres de tampon extracellulaire contenant 0,8 millimolaire de SRB et diverses concentrations de glucose. Puis, placez l'anneau pré-incubé au centre de la chambre et focalisez-vous à trois ou quatre couches cellulaires à l'intérieur de l'anneau.

Dans les îlots de rongeurs, la coloration immuno-histochimique pour l'insuline montre que la majorité des cellules sont des cellules bêta. Ensuite, à l'aide d'un microscope à deux photons équipé d'un objectif à immersion huile de 60 x, identifier les événements exocytaires individuels par l'apparition soudaine d'un petit point fluorescent. Enfin, dans le logiciel d'analyse d'image, confirmer un événement par la phase de montée rapide du signal fluorescent dans une région d'intérêt pour une souris de type sauvage.

Environ 200 œillets sont attendus en utilisant le protocole démontré dans cette vidéo. Les œillets sains apparaissent brillants, de forme ronde et possèdent un bord régulier. Une digestion excessive lors de l'isolement donne généralement des œillets petits et flous, ainsi que des œillets auxquels sont attachées des cellules asar.

Bien qu’un lot surexposé présente moins de pores dans le dosage à deux photons en réponse à des stimuli tels que le glucose ou l’insuline granulaire élevée en potassium, un SRB pénètre dans les granules, ce qui entraîne l’apparition d’un point fluorescent soudain d’environ 400 nanomètres de diamètre. Pendant la durée de l’enregistrement, tous les événements d’exocytose en réponse au stimulus sont identifiés ainsi que la localisation des événements, le moment de leur apparition, leur durée et le type de fusion. Des événements tels que KISS et Run ou la fusion complète sont caractérisés et s’avèrent utiles pour évaluer tout défaut de fusion des granules dans les modèles de diabète de type deux.

Cette méthode a permis de montrer que le défaut observé dans les ilots pancréatiques de souris diabétiques DB DB est la perte de la fusion complète des granules, et non un changement dans la cinétique de la fusion individuelle des granules. En outre, le facteur le plus important influençant la sécrétion diminuée d'insuline dans la maladie est une réduction du nombre de cellules réactives. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre la perfusion pancréatique et l'activation des ilots à partir de souris RDB, et être également en mesure de réaliser les deux essais sur langue pour évaluer les réponses sécrétoires au sein d'ilots intacts.