Name: Mammosphere Formation dosage du sein humain cancer des tissus et des lignées cellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Apprenez à quantifier les cellules souches cancéreuses du sein et leur capacité d'auto-renouvellement par dosage des mammosphères en suspension. Cette méthode évalue le potentiel tumorigène in vitro.

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Ce travail est soutenu par le BRC Imperial, l&#39;Institut national de recherche en santé, et de lutte contre le cancer avec une mention spéciale à Hilary Artisanat et Sir Douglas Myers.

Les procédures ci-dessous ont été éthique approuvé par l&#39;Imperial College, Londres. 1. Génération de mammospheres primaires du sein humain Cancer Cell Lines REMARQUE: Effectuez les étapes suivantes sous une hotte de culture stérile. <ol><li> Préparez mammosphere des milieux contenant du DMEM / F12 supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 U / ml de streptomycine. Préparer les médias complète immédiatement avant utilisation en ajoutant 20 facteur ng / ml recombinant de croissance épidermique humain (EGF; Sigma), 10 ng / ml de base facteur humain recombinant de croissance des fibroblastes (bFGF; R &amp; D Systems) et le supplément 1x B27. </li><li> Aspirer le milieu de flacon contenant adhérentes MCF-7 ou MDA-MB-231 cellules (ou une ligne de votre choix de cellules de cancer du sein; 70-80% de confluence), laver deux fois dans PBS 1x et Trypsiniser cellules. </li><li> Centrifuger les cellules à 200 xg à température ambiante pendant 5 min. Cellules surnageant et remettre décantation dans 1-5 ml de milieu mammosphere. Pipettede haut en bas et si nécessaire utiliser un filtre de plafonnement des tamis cellulaire de 40 um pour obtenir une suspension à cellule unique. Utiliser un hémocytomètre pour assurer une suspension cellulaire unique est formée (dans la négative, utiliser une aiguille G 25 à la seringue la suspension de cellules jusqu&#39;à 3 fois). </li><li> Si nécessaire isolat CD44 + CD24- sous-ensemble cellulaire via FACS en utilisant anti-CD24-phycoérythrine (PE) et l&#39;isothiocyanate (FITC) des anticorps monoclonaux anti-CD44 9-fluorescéine. Alternativement, isoler telle population en utilisant un système (MACS) avec anti-CD44 et les microbilles combinées anti-CD24-biotine selon les instructions du fabricant magnétique des cellules activées de tri. Effectuer une sélection positive en utilisant LS colonnes, et la sélection négative en utilisant des colonnes de LD et de confirmer les phénotypes de toutes les cellules isolées par cytométrie de flux 17. </li><li> Calculer le nombre de cellules viables par ml en utilisant du bleu trypan. REMARQUE: La viabilité des cellules est calculé comme le nombre de cellules viables, divisé par le nombre total de cellules dans les grilles sur la hemocyTometer. Les cellules qui prennent bleu trypan sont considérés comme non viable. La procédure suivante est utilisée pour déterminer avec précision la proportion de cellules viables. <ol><li> Préparer une solution à 0,4% de bleu trypan dans du PBS. Ajouter 0,1 ml de solution stock trypan bleu à 1 ml de cellules. Chargez un hémocytomètre et d&#39;examiner immédiatement sous un microscope à faible grossissement. Compter le nombre de cellules totales et du nombre de cellules à coloration bleue. Les cellules viables = [1,00 - (Nombre de cellules bleues ÷ Nombre de cellules totales)] × 100. </li><li> Pour calculer le nombre de cellules viables par ml de culture, utiliser la formule ci-dessous. Rappelez-vous pour corriger le facteur de dilution. Nombre de cellules viables × 10 × 1,1 = 4 cellules / ml de culture </li></ol></li><li> Reprendre un montant pré-déterminé de cellules dans 2 ml de milieu mammosphere complets dans chaque puits d&#39;une plaque adhérente à 6 puits ultra-faible. La densité de semis est normalement 500-4,000 cellules / cm 2 cellule par puits. Éventuellement utiliser low fixation des plaques 24 puits pendant l&#39;ensemencement des cellules à la même densité dans 0,5 ml de milieu. NOTE: Nous recommandons l&#39;optimisation de la densité et l&#39;heure de la culture ensemencement pour chaque lignées cellulaires d&#39;intérêt. </li><li> Incuber à faible fixation des plaques 6 puits ultra à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 5 à 10 jours (selon la lignée cellulaire et de la taille de mammospheres) sans perturber les plaques, en particulier pendant la phase des 5 premiers jours de croissance . </li></ol> 2. Génération de mammospheres primaires de cancer du sein humain échantillons cliniques REMARQUE: tissu de cancer du sein humain peut être obtenu à partir de patients subissant une intervention chirurgicale pour l&#39;élimination des tumeurs du sein. tissu de magasin sur de la glace pendant jusqu&#39;à 24 heures dans 50 ml dans des tubes stériles dans des milieux de culture contenant 100 U / ml de pénicilline et 100 U / ml de streptomycine. Effectuez les étapes suivantes sous une hotte de culture stérile. <ol><li> Transférer l&#39;échantillon dans une boîte de 100 mm tissus Petri avec un petit volume de médias. Remove du tissu adipeux avec des ciseaux stérile, scalpel et des pinces. </li><li> Ajouter 2-3 ml de DMEM / F12 et émincer l&#39;échantillon dans une mm 3 morceaux avec un scalpel stérile ou lame de rasoir jusqu&#39;à ce qu&#39;aucun gros morceaux restent. </li><li> Remettre en suspension les morceaux de tissu dans préchauffée 10 ml de DMEM contenant des enzymes protéolytiques (3000 U / ml de collagénase et 1000 U / ml hyaluronidase) et incuber à 37 ° C dans un agitateur rotatif jusqu&#39;à ce que tous les fragments de tissus sont digérés. Habituellement digestion complète prend 1-3 heures. Réglez le temps de digestion selon caractères pathologiques de tumeurs. (Par exemple adénocarcinome du sein est généralement plus difficile à digérer par rapport au carcinome mucineux qui est plus fragile et a besoin de plus courte durée de digestion). Évaluer le degré de digestion chaque demi-heure en observant 20 ul suspension en vertu hémocytomètre. </li><li> Autoriser les fragments dans les sédiments pendant 5 min, puis transférer le surnageant dans un tube en polypropylène de 15 ml conique et centrifuger à 200 g pendant 10 min à temtempérature. Décanter avec soin les cellules surnageant et remettre en suspension dans 1-5 ml de milieu de mammosphere. </li><li> Suivez les étapes décrites ci-dessus 01/01 au 01/04 pour les lignées cellulaires afin d&#39;obtenir et plaque suspensions de cellules isolées. Cellules passe à travers le G 25 seringue un maximum de deux fois si nécessaire pour limiter endommager les cellules. </li></ol> 3. mammosphere efficacité de formation (%) Calcul <ol><li> Après la période de culture, compter les mammospheres (supérieure à 40 um) de diamètre sous un microscope au grossissement de 40X. Image numériquement cinq domaines aléatoires en utilisant un appareil photo numérique sur un microscope optique et déterminent la taille des mammospheres l&#39;aide du logiciel d&#39;acquisition. Utilisez ne importe quel logiciel d&#39;analyse d&#39;images. </li><li> Calculer mammosphere efficacité Forming (MFE%) selon l&#39;équation suivante: MFE (%) = (nombre de mammospheres par puits) / (nombre de cellules ensemencées par puits) x 100 </li></ol> 4. Le passage en série de mammospheres pour l&#39;évaluation de l&#39;auto-renouvellement <ol><li&gt; Pipette le support contenant les mammospheres de chaque puits dans un tube de 15 ml. Laver les puits avec du PBS et ajouter aux médias recueillies. Centrifuger à 115 g pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 pi de 0,5% de trypsine / EDTA 0,2% préchauffé. Incuber pendant 2-3 min. </li><li> Ajouter 500 pi de FCS pour neutraliser la trypsine. Centrifuger à 500 g pendant 5 min. Rejeter le surnageant et remettre le culot dans 100 pi de mammospheres médias, pipetage de haut en bas de désagréger sphères. </li><li> Compter les cellules avec un hémocytomètre et déterminer si les cellules sont en suspension à une seule cellule. Si non passer par un G 25 seringue jusqu&#39;à trois fois pour obtenir des cellules individuelles. Ensemencer les cellules dans un nouveau plus bas attachement plaque ultra 6 puits à la même densité utilisé dans la génération primaire. </li><li> Après 5-10 jours, comptez sphères&gt; 40 um et de calculer l&#39;efficacité de la sphère de formation selon la formule rapportée auparavant. </li></ol>

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<li>Yu, F., Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((let-7+regulates+self+renewal+and+tumorigenicity+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells.</a> Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts qui pourrait être perçu comme préjugeant de l’impartialité de cet article.

Évaluation positive des mammospheres primaires et secondaires se appuie sur les cellules étant étalées à suffisamment faibles densités qui mammospheres forme de clones uniques, avec une agrégation de la sphère minimale. Cependant, à des densités trop faibles, trop peu mammospheres peuvent former de distinguer les effets des traitements statistiquement. La densité de semis doit être optimisée pour chaque lignée cellulaire utilisée, car ils peuvent varier considérablement dans leur sphère formant efficacité (ceux qui expr...

L&#39;existence de lignées cellulaires tumorales dirigés par des cellules souches du cancer souches ressemblant a grandement ajouté à notre compréhension de l&#39;hétérogénéité tumorale. Alors que certains diversité phénotypique dans les tumeurs ne se pose de l&#39;excroissance clonale de clones génétiquement distinctes, une composante importante semble résulter de différences épigénétiques: les cellules cancéreuses peuvent transition (parfois réversible) entre la tige, l&#39;ancêtre, et les Etats différenciées via l&#39;activation ou la répression de gène spécifique les programmes d&#39;expression 1-3. Cela peut tenir compte de facteurs intrinsèques ou extrinsèques cellulaires, ce qui reflète le programme d&#39;expression génique actuellement être exprimé dans une cellule avec son signalisation autocrine résultant en liaison avec signalisation paracrine d&#39;un cancer, stromales ou les cellules immunitaires voisine délivrant facteurs modulateurs et les conditions microenviromental tels que le degré de hypoxie 2,4,5. Bien que la lignée traçage des approches novatricessont avancer notre capacité à étudier les cellules souches du cancer putatifs dans leur niche in vivo 6-8, les dosages de la sphère de formation restent une approche populaire et pratique pour estimer le potentiel des cellules de cancer du sein de se comporter comme des cellules souches, au moins dans les conditions de dosage utilisées. Il est souvent utilisé aux côtés méthodes rétrospectives pour les cellules souches du cancer de purification, par leur expression de marqueurs membranaires CD44 et CD24 9 et les niveaux de l&#39;enzyme ALDH (aldéhyde déshydrogénase) d&#39;activité 10, les marqueurs qui ont été proposés pour correspondre à plus mesenchymal- et épithélial -comme cellules respectivement 11 souches du cancer. L&#39;approche de la formation de la sphère a d&#39;abord été développé en tant que dosage de neurosphères, permettant la croissance de cellules souches putatives provenant de clones individuels dans non adhérentes, des conditions sans sérum avec l&#39;ajout de l&#39;épithélium du facteur de croissance (EGF) 12, puis est utilement appliquée à normaux et cancéreux tissus mammaires. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; L&#39;identité de la cellule fondateur sphère de formation, et les types de cellules mixtes qui composent la masse de la sphère, sont pertinentes pour les conclusions qui peuvent être fabriqués à partir de mammographie, ou autre sphère formant essais. Os repos cellules souches de bonne à long terme, la pensée de se reposer en phase G0, ne sera pas l&#39;expérience de la combinaison précise de facteurs qui favoriseraient activation in vivo. Le dosage de la place mammosphere permet la croissance des cellules soit prête pour la division mitotique ou déjà en division 13. Ces progéniteurs, mais pas véritablement une cellule de repos, peuvent être le stade de la cellule qui prolifère avec les mitogenes et EGF facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) utilisés dans le dosage. Néanmoins, ils contiennent une gamme de la signalisation associée aux cellules souches activé cheminements de 14. En outre, la vitesse de leur formation se rapporte à la tumorigénicité de tissu ont été prélevés, lorsqu&#39;elle est mesurée par leur efficacité dans des essais de dilution limitée dans des xénogreffes de souris 2,15,16 &lt;/ Sup&gt;. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour isoler des cellules individuelles et de générer mammospheres primaires des deux lignées cellulaires de cancer du sein humain et des échantillons cliniques de tumeurs du sein. Nous décrivons également comment effectuer des passages en série de mammospheres primaires pour évaluer l&#39;auto-renouvellement, et comment calculer sphère formant efficacité qui permet la comparaison entre les différentes densités de semis (voir schéma de la figure 1).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-glutamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>100 U/ml Pénicilline & Streptomycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Facteur de croissance épidermique humain recombinant (EGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Facteur de croissance des fibroblastes humains basiques recombinants (bFGF)</td><td>R& D systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>1x supplément B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12399902</td><td></td></tr><tr><td>0,5 % trypsine/0,2 % EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>First Link UK</td><td>02-00-850</td><td></td></tr><tr><td>Trypan bleu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 6 puits à faible fixation</td><td>Corning</td><td>CLS3814</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase type 1A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir stériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>12443170</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel stérile</td><td>Fisher Scientific</td><td>11758353</td><td></td></tr><tr><td>Micro-dissection stérile ciseaux</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146</td><td></td></tr></tbody></table>

mammosphere formation dosage du sein humain cancer des tissus et des lignées cellulaires

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similaires aux tissus sains, beaucoup de sang et de tumeurs solides sont maintenant pensés pour être organisée hiérarchiquement, avec un sous-ensemble de cellules cancéreuses souches ressemblant que l&#39;auto-renouveler tout en donnant naissance à une descendance plus différenciée. Comprendre et cibler ces cellules souches cancéreuses dans le cancer du sein, qui peuvent posséder amélioré chimio- et radio-résistance par rapport à la masse de la tumeur non-tige, est devenu un domaine de recherche important. Marqueurs y compris CD44, CD24, et l&#39;activité de l&#39;ALDH peut être évaluée en utilisant cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour isoler de façon prospective les cellules qui affichent la tumorigénicité accrue lorsqu&#39;ils sont implantés dans des souris immunodéprimées: le dosage de mammosphere a également été largement utilisée pour sa capacité à identifier a posteriori SPHERE formant des cellules qui se développent à partir de souches unique clones de cellules comparables. Nous exposons ici approches pour la culture appropriée de mammospheres partir de lignées cellulaires ou d&#39;échantillons primaires des patients, de leur passages, et des calculs pour estimer la sphère fl&#39;efficacité ormer (SFE). D&#39;abord, nous discutons des considérations et des pièges clés dans la planification et l&#39;interprétation des expériences mammosphere appropriée.

Différents échantillons ou ceux qui sont soumis à des traitements différents peuvent varier dans le nombre de mammospheres&gt; 40 um qui se forment après la normalisation pour les cellules ensemencées initiales. Calculer mammosphere efficacité de formation (MFE) pour chaque traitement grandi en trois exemplaires. Cela permet des expériences avec différentes densités d&#39;ensemencement à comparer. Les données sont affichées sur un meilleur diagramme à barres, de préférence avec des contrôles positifs et négatifs, et l&#...

Les dosages de mammosphère flottante peuvent étudier le sous-ensemble de cellules cancéreuses du sein de type souche qui survivent en suspension et présentent une tumorigenèse accrue lorsqu’elles sont implantées chez la souris. Ce protocole fournit une mesure in vitro pratique de la capacité de formation de sphères, un indicateur de la tumorigenèse in vivo, tout en facilitant l’analyse du paysage transcriptionnel associé aux tiges.

Mammosphere Formation dosage du sein humain cancer des tissus et des lignées cellulaires

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'estimer la proportion de cellules de type souche au sein d'une lignée cellulaire cancéreuse ou d'un échantillon de tissu tumoral, et d'évaluer leur capacité d'auto-renouvellement au cours de passages successifs. Pour ce faire, une lignée cellulaire cancéreuse ou un tissu tumoral est traité afin d'obtenir une suspension monocellulaire, puis trié pour isoler les sous-populations cellulaires positives pour CD44 et négatives pour CD24. Les cellules sont ensemencées dans des plaques à faible adhérence, incubées pour permettre leur croissance, puis examinées au microscope optique sous forme de sphéroïdes.L'efficacité de formation est quantifiée en déterminant le nombre de sphéroïdes formés par rapport au nombre de cellules initialement ensemencées. Le processus de génération d'une suspension monocellulaire, d'incubation pour permettre la croissance et de détermination de l'efficacité de formation de sphéroïdes est répété au cours de passages successifs, fournissant ainsi une mesure de la capacité des cellules à s'auto-renouveler au fil du temps. Cette méthode offre un essai fonctionnel simple permettant d'identifier les cellules présentant des propriétés fonctionnelles de cellules souches, telles que l'auto-renouvellement, ainsi qu'une estimation quantitative du nombre de cellules souches provenant de tumeurs in vivo.Un principe fondamental des tests de formation de sphéroïdes est que chaque sphéroïde provient d'une cellule unique, et est donc d'origine clonale. Pour ces raisons, la densité cellulaire est le paramètre le plus important de ce test, car elle a un impact critique sur la viabilité. Travailler sous une hotte de culture stérile. Commencer cette procédure avec des cellules MCF seven ou MDA MB 2 3 1 qui sont à 70 à 80 % de confluence.Aspirez le milieu du flacon, lavez les cellules deux fois avec du PBS. Ajoutez ensuite du tripsin EDTA et incubez de deux à six minutes, puis arrêtez le détachement en ajoutant un milieu mammosphère contenant 10 % de FBS. Une fois les cellules détachées, transférez-les dans un tube conique de centrifugeuse de 15 millilitres et centrifugez à 200 × g pendant cinq minutes à température ambiante.Après la centrifugation, décantez la senna. Ensuite, resuspendez les cellules dans un à cinq millilitres de milieu manosphère, puis pipetez 10 fois de haut en bas pour rompre le culot cellulaire. Puis, faites passer la suspension cellulaire à travers un filtre à mailles de 40 microns et récupérez l'écoulement dans le tube attaché.Pour obtenir une suspension monocellulaire, je prélève un aliquot de 20 microlitres des cellules remises en suspension et je les dépose sur un hémo-cytomètre que j'examine au microscope. Si des agrégats cellulaires sont observés comme ici, utiliser une seringue pour faire passer la suspension une ou deux fois à travers une aiguille de calibre 25. Une fois les cellules dispersées en une suspension monocellulaire comme illustré ici, passer à l'isolement de sous-populations cellulaires CD 44 positives et CD 24 négatives par tri cellulaire activé par fluorescence ou par tri cellulaire activé par magnétisme.Utilisez une colonne LS pour sélectionner positivement les cellules positives pour CD44. Étant donné que les cellules désirées s'attachent aux parois de la colonne LS, jetez l'écoulement, puis retirez les cellules de la colonne. Appliquez cinq millilitres de tampon et utilisez le piston fourni avec la colonne en appuyant dessus pour éliminer les cellules souhaitées.Ensuite, utilisez une colonne LD pour purifier davantage la population par sélection négative. Ici, les cellules positives pour le CD 24 s'attachent aux colonnes LD. Récupérez l'écoulement qui contient les cellules négatives pour le CD 24.Ensuite, à l’aide de la cytométrie en flux, confirmez les phénotypes de toutes les cellules isolées. À l’aide de la méthode d’exclusion au bleu de Trypan, calculez la densité des cellules viables après avoir dilué convenablement la suspension cellulaire. Ensemencez chaque puits d’une plaque de six puits à attachement ultrabas avec 500 à 4 000 cellules par centimètre carré dans deux millilitres de milieu complet pour mammosphères.Incuber les plaques en prenant soin de ne pas les perturber pendant cinq à 10 jours, jusqu'à l'observation de sphéroïdes. Poursuivre la culture jusqu'à ce que les sphéroïdes atteignent un diamètre d'au moins 40 microns, mais qu'ils n'aient pas encore commencé à devenir apoptotiques. Obtenir des tissus humains de cancer du sein auprès de patients subissant une chirurgie pour l'ablation de tumeurs mammaires.Conserver le tissu sur de la glace jusqu'à 24 heures dans 50 millilitres. Tubes stériles en DMEM contenant 100 unités par millilitre de pénicilline et 100 unités par millilitre de streptomycine, en travaillant sous une hotte de culture cellulaire stérile.Transférez l'échantillon dans une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres contenant un petit volume de milieu à l'aide de ciseaux stériles, d'un scalpel et de pinces. Retirez le tissu adipeux. Ajoutez deux à trois millilitres de D-M-E-M-F 12 et, à l'aide d'un scalpel stérile ou d'une lame de rasoir, hachez finement l'échantillon jusqu'à ce qu'aucun gros morceau ne reste.Les morceaux de tissu sont placés dans 10 millilitres de DMEM préchauffé contenant des enzymes protéolytiques et incubés à 37 degrés Celsius dans un agitateur rotatif pendant une à trois heures. Lorsqu'on utilise des enzymes digestives pour dissocier des cellules tumorales primitives viables, il existe un compromis critique entre la mort cellulaire et une extraction suffisante de la matrice cellulaire. Pour assurer le succès, il est essentiel de surveiller régulièrement cette digestion. Toutes les demi-heures, prélevez 20 microlitres de la suspension à l’aide d’une pipette et déposez-les sur un hémo-cytomètre, puis utilisez un microscope pour évaluer le degré de digestion.Une fois la digestion terminée, laissez les fragments sédimenter pendant cinq minutes. Transférez ensuite le surnageant dans un tube conique en polypropylène de 15 millilitres.Centrifugez à 200 × g pendant 10 minutes à température ambiante. Après la centrifugation, décantez soigneusement l'agent surnageant et resuspendez les cellules dans un à cinq millilitres de milieu pour mammosphères. Préparez ensuite des suspensions de cellules simples et mettez-les en culture selon la méthode décrite dans la section précédente.Dans cette vidéo, faites passer les cellules de haut en bas à l’aide d’une seringue de 25 g, au maximum deux fois, pour disperser les cellules si nécessaire. Après la période de culture, observez les cellules à un grossissement de 40 fois au microscope équipé d’une caméra numérique. Acquérez des images de cinq champs aléatoires.Une fois toutes les images prises, utilisez le logiciel d'acquisition pour déterminer le nombre de microsphères dont le diamètre est supérieur à 40 microns. Enfin, calculez l'efficacité de formation des métasphères en divisant le nombre de microsphères dans chaque puits par le nombre de cellules semées dans chaque puits, multiplié par 100. Transférez le milieu contenant les microsphères de chaque puits dans un tube de 15 millilitres. Lavez chaque puits avec du PBS et ajoutez-le au milieu recueilli.Ensuite, centrifuger les cellules à 115 ×g pendant 10 minutes à température ambiante. Après la centrifugation, éliminer le surnageant. Suspendre le culot dans 500 microlitres de trypsine-EDTA préchauffée et incuber pendant deux à trois minutes.Après l'incubation, ajoutez 500 microlitres de SBF pour neutraliser la trypsine, puis centrifugez à 500 × g pendant cinq minutes. Une fois la centrifugation terminée, éliminez le surnageant, puis resuspendez le culot dans 100 microlitres de milieu pour mammosphères. Pipetez plusieurs fois pour désagréger les sphères éventuelles. À nouveau, à l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules et déterminez si elles se sont dissociées en une suspension monocellulaire.Sinon, faire passer les cellules à travers une seringue de calibre 25 jusqu'à deux fois afin d'obtenir des cellules individuelles, puis ensemencer les cellules dans une nouvelle plaque ultrabasse adhérence à six puits à la même densité utilisée lors de la génération primaire. Après cinq à dix jours, compter les sphères de plus de 40 microns et calculer l'efficacité de formation de sphères comme précédemment, afin d'estimer l'efficacité de formation de sphères. Les atmosphères ont été cultivées à partir d'une lignée cellulaire épithéliale positive pour les œstrogènes CF7 et d'une lignée cellulaire mésenchymateuse triple négative MDA-MB-231, comme décrit dans cette vidéo. Le décompte des sphères mammaires de plus de 40 microns fournit une estimation de l'efficacité de formation de sphères pour chaque lignée cellulaire.Remarquez que l'agrégation minimale de fusion cellulaire observée ici a été obtenue par un ensemencement à faible densité, à raison de 500 cellules par centimètre carré pour les MCF7 et de 1000 cellules par centimètre carré pour les MDA-MB-231. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment cultiver et compter des mammosphères provenant de différentes lignées cellulaires ou d'échantillons tumoraux chirurgicaux. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'ensemencer les cellules à faible densité afin d'assurer la clonalité, et de s'assurer qu'une forte proportion des cellules est viable lors de l'extraction à partir d'échantillons chirurgicaux.En complément de cette procédure, d'autres méthodes, telles que la greffe de populations cellulaires chez des souris immunodéprimées, doivent être réalisées afin de déterminer la tumorigénicité in vivo des tissus d'intérêt.

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HC11 différentiation lactogène peut être caractérisée par la formation de structures en forme de dôme appelé mammospheres. Les structures peuvent être énumérés par microscopie à contraste de phase afin d'aider à quantifier différentiation lactogène.

Souris cellules épithéliales mammaires forme Mammospheres cours de la différenciation lactogène

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Génération de mammosphères primaires : une technique pour déterminer l’activité cellulaire

Imagerie time-lapse est utilisé pour évaluer le comportement des principaux pré-néoplasiques des cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de risque de cancer du sein afin de déterminer s'il existe des corrélations entre certains paramètres comportementaux et génétiques distinctes des lésions.

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Culture de cellules primaires en utilisant organites intacts de tissu fournit un système modèle qui imite le microenvironnement in vivo multicellulaire. Nous avons développé un modèle de culture primaire de tissu d'épithélium mammaire sans sérum qui perpétue mixtes lignées de culture cellulaire et des expositions morphologie différenciés, sans interruption de tissu enzymatique. organites mammaires restent viables pendant&gt; 6 mois.

Non enzymatique, sans sérum de culture de tissus de lésions mammaires pré-invasives pour la génération spontanée de mammospheres

Nous décrivons ici le modèle et l’approche pour étudier les fonctions des macrophages alvéolaires pulmonaires dans les métastases cancéreuses. Pour démontrer le rôle de ces cellules dans les métastases, le modèle syngénique (4T1) du cancer du sein en conjonction avec la déplétion du macrophage alvéolaire avec des liposomes clodronates a été utilisé.

L&#39;étude du rôle des macrophages alvéolaires dans le cancer du sein métastase

Ici, nous décrivons la mise en œuvre et l'interprétation des résultats d'un essai quantitatif d'auto-renouvellement de la mammosphère in vitro.

Quantification de l'auto-renouvellement dans les cultures de la mammosphère murine

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