Mesure de la force maximale isométrique généré par perméabilisées fibres du muscle squelettique

L’objectif global de cette procédure est de mesurer la capacité maximale de génération de force isométrique de fibres individuelles à partir d’échantillons de muscles squelettiques chimiquement perméables. Ceci est accompli en exposant d’abord les membranes des fibres musculaires à un détergent chimique, éliminant ainsi la barrière entre le contenu extracellulaire et intracellulaire. La deuxième étape consiste à extraire une fibre individuelle d’un petit faisceau de fibres et à l’attacher à l’appareil expérimental.

Ensuite, les modèles d’interférence laser sont utilisés pour définir la longueur optimale du sarcomère pour la fibre individuelle. Enfin, le calcium est administré pour provoquer une force de contraction isométrique maximale. En fin de compte, la technique de la fibre unique perme fournit une évaluation des propriétés contractiles du muscle squelettique sans les complexités associées à l’architecture musculaire entière.

La démonstration visuelle de cette méthode est utile car les étapes clés pour exécuter le protocole avec succès peuvent être difficiles à apprendre. Commencez par préparer les solutions de dissection, de stockage et de test comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Ensuite, utilisez des pinces pour préparer des boucles de suture à partir de brins de suture en nylon monofilament USP 10 zéro.

En utilisant la technique du double nœud plat, préparez quatre boucles pour chaque fibre à tester. Une fois formé, placez le nœud sous un microscope et réduisez sa taille à environ 750 micromètres de diamètre. Utilisation des marquages IPS GTI comme guide.

Ensuite, coupez tout excès de suture, en ne laissant que la boucle et les petites queues de 500 micromètres de chaque côté. Transférez une petite masse de tissu musculaire obtenue par biopsie ouverte ou à l’aiguille dans une boîte contenant une solution de dissection réfrigérée et ajoutez plus de solution de dissection pour vous assurer que le tissu reste immergé. Inspectez l’échantillon au microscope et manipulez-le pour aligner l’axe longitudinal des fibres vers l’épaule droite de l’investigateur.

Ancrez ensuite l’échantillon dans le plat en l’épinglant dans les coins avec la pince dans la main gauche et les ciseaux de micro-dissection dans la main droite. Commencez à disséquer doucement un faisceau le long des marges longitudinales entre les fibres. Retirez et jetez tout tissu endommagé par les pinces ou les épingles.

À la suite du processus de dissection, transférez les faisceaux de la solution de dissection dans un flacon de trois millilitres contenant 2,5 millilitres de solution de dissection fraîche et réfrigérée avec un détergent non ionique ajouté. Incuber l’échantillon sur de la glace pendant 30 minutes en l’agitant doucement de temps en temps et s’assurer que les faisceaux restent immergés tout au long de l’incubation. Transférez ensuite les paquets dans un flacon contenant une solution de dissection fraîche et agitez doucement et brièvement pour éliminer tout détergent restant.

Une fois rincés, transférez les paquets dans un flacon contenant une solution de stockage réfrigérée et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez la fiole de l’entreposage à quatre degrés Celsius et transférez tous les paquets dans une tasse à pharmacie ou une boîte de dissection. En préparation du stockage, transférez les paquets dans des flacons cryogéniques étiquetés individuellement, remplis de 200 à 400 microlitres de solution de stockage fraîche, et assurez-vous que le paquet n’est pas collé sur le côté du tube ou flottant à la surface.

Ensuite, bouchez le tube et conservez l’échantillon à moins 80 degrés Celsius. Mettre en place un appareil expérimental comme celui montré ici et attribué dans le protocole de texte qui l’accompagne. Remplissez ensuite la première chambre expérimentale avec une solution relaxante, la deuxième chambre avec une solution de pré-réactivation et la troisième avec une solution d’activation.

Ajustez la température dans la chambre jusqu’à ce qu’elle soit stable à 15 degrés Celsius avec l’appareil dans la solution relaxante. Enfilez deux des boucles de suture préparées sur les surfaces de fixation en acier inoxydable s’étendant à la fois du transducteur de force et du contrôleur de longueur. Ensuite, décongelez un paquet de fibres d’intérêt sur de la glace pendant environ 15 minutes, puis transférez-le dans une boîte de Pétri plaquée d’élastomère de silicone remplie d’une solution relaxante fraîche et réfrigérée.

Fixez le paquet en place avec des goupilles à chaque extrémité et assurez-vous qu’il est immergé à l’aide de la pince. Saisissez une fibre à une extrémité et commencez à l’extraire en douceur le long de son axe longitudinal. Des précautions doivent être prises lors de l’extraction des fibres du faisceau, car les adhérences entre les fibres et la matrice extracellulaire peuvent entraîner une tension excessive, entraînant finalement des dommages induits par l’étirement.

Une fois extraite, introduisez la fibre dans une pointe de pipette modifiée avec une petite quantité de solution relaxante et transférez-la dans la chambre expérimentale qui contient la solution relaxante en guidant doucement avec la pince. Retirez la fibre de la pointe de la pipette et ancrez-la au contrôleur de longueur. À l’aide de la première boucle de suture, manipulez l’autre extrémité de la fibre vers le transducteur de force et fixez la fibre en utilisant la même procédure.

Retirez tout excès de suture à l’aide des ciseaux de micro-dissection. Ensuite, enfilez la deuxième boucle sur la première et ancrez la fibre à un point situé à moins de 0,2 millimètre de l’extrémité de la surface de fixation du contrôleur de longueur. Répétez l’opération avec la deuxième boucle à l’extrémité du transducteur de force de la fibre.

Ajustez la position du contrôleur de longueur dans la direction de l’axe Y afin d’aligner la fibre parallèlement aux parois latérales de la chambre expérimentale. Ensuite, examinez la fibre à l’aide de la vue latérale du prisme et ajustez la position du contrôleur de longueur dans la direction de l’axe Z jusqu’à ce que la fibre soit parallèle au sol de la chambre. Si la fibre est endommagée de quelque manière que ce soit, la fibre doit être jetée et une nouvelle fibre attachée.

Allumez le laser et ajustez la position de la platine de sorte que le laser passe par le centre de la fibre. Réglez ensuite la longueur du sarcomère en augmentant ou en diminuant la tension sur la fibre à l’aide du contrôleur de longueur du pilote de micromètre de l’axe X jusqu’à ce que l’espacement souhaité de la lumière diffractée soit observé sur l’écran cible. Une fois que la longueur optimale du sarcomère a été définie, mesurez la distance entre les deux sutures les plus internes.

Positionnez la chambre de manière à ce que le réticule vertical de l’oculaire soit aligné sur le bord le plus intérieur d’une suture intérieure et zéro. L’affichage numérique sur le variateur micrométrique déplace la platine le long de l’axe des x par rapport au microscope jusqu’à ce que le réticule vertical de l’oculaire soit aligné avec la suture la plus interne. L’affichage numérique indiquera la longueur de la fibre, maintiendra la fibre à la longueur mesurée et utilisera la caméra montée sur le microscope pour capturer une image à fort grossissement de la partie centrale de la fibre à partir des vues de dessus et de côté.

Utilisez ces images pour calculer la section transversale de la fibre. Utilisez le logiciel de contrôle de la chambre pour déplacer la fibre vers la chambre contenant la solution de pré-réactivation et incubez-la pendant trois minutes. Pendant que la fibre est en solution inactivante, mesurez sa tension passive, puis déplacez la fibre vers la chambre contenant la solution d’activation et laissez la force isométrique maximale se développer comme en témoigne un plateau de force qui est précédé d’une montée rapide.

Ensuite, utilisez le contrôleur de longueur pour appliquer une réduction rapide et brève de la distance entre les points de fixation de la fibre, suivie d’un retour rapide à la longueur d’origine pour identifier la sortie du capteur de force qui correspond à zéro. La force illustrée ici est à la fois les vues supérieure et latérale d’une fibre de forme elliptique à partir de ces vues. L’aire de la section transversale a été déterminée en mesurant les diamètres en cinq points le long de la longueur de la fibre, puis en calculant la moyenne des cinq aires résultantes.

Les traces de force des fibres musculaires humaines, lentes et rapides illustrent que les fibres rapides génèrent une force à un taux plus élevé que les fibres lentes en utilisant la technique montrée dans cette vidéo. Les caractéristiques typiques des fibres musculaires humaines de souris et de rat ont été mesurées et sont présentées ici. La plage indiquée indique le 25e au 75e quartile et le N est le nombre de fibres testées.

Notez la grande variation de la force spécifique entre les différentes espèces. Les procédures décrites ici aboutissent à l’évaluation de la capacité maximale de génération de force intrinsèque d’une seule fibre musculaire squelettique en ajoutant des interventions supplémentaires, des aspects importants de la physiologie des muscles squelettiques, y compris, entre autres, la force, la force, la vitesse et la force. Les relations entre le calcium peuvent être révélées.