Name: Mesure de la force maximale isométrique généré par perméabilisées fibres du muscle squelettique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Apprenez à mesurer la force isométrique maximale des fibres musculaires perméabilisées. Cette technique permet d'évaluer les propriétés contractiles du muscle squelettique sans la complexité de l'architecture musculaire complète.

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<ol><li>Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+specific+force+and+power+production+of+muscle+fibers+from+myostatin-deficient+mice+are+associated+with+a+suppression+of+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation.</a> J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).</li>
<li>Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotator+cuff+tear+reduces+muscle+fiber+specific+force+production+and+induces+macrophage+accumulation+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy.</a> J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).</li>
<li>Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r, Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+muscle+fiber+force+production+and+disrupted+myofibril+architecture+in+patients+with+chronic+rotator+cuff+tears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Shoulder+Elbow+Surg%22%5BJournal%5D)">Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears.</a> J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).</li>
<li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcomere+length-tension+relations+of+frog+skinned+muscle+fibres+during+calcium+activation+at+short+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths.</a> J Physiol. 292, 177-192 (1979).</li>
<li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+contraction+of+rabbit+fast+and+slow+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers.</a> Biophys J. 53, 935-946 (1988).</li>
<li>Moisescu, D. G., Thieleczek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+strontium+concentration+changes+within+skinned+muscle+preparations+following+a+change+in+the+external+bathing+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution.</a> J Physiol. 275, 241-262 (1978).</li>
<li>Walker, S. M., Schrodt, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I+Segment+lengths+and+thin+filament+periods+in+skeletal+muscle+fibers+of+the+Rhesus+monkey+and+the+human%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human.</a> Anat Rec. 178, 63-81 (1974).</li>
<li>Gollapudi, S. K., Lin, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+determination+of+sarcomere+force-length+relationship+in+type-1+human+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Experimental determination of sarcomere force-length relationship in type-1 human skeletal muscle fibers.</a> J Biomech. 42, 2011-2016 (2009).</li>
<li>Brenner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+stabilizing+the+striation+pattern+in+maximally+calcium-activated+skinned+rabbit+psoas+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Technique for stabilizing the striation pattern in maximally calcium-activated skinned rabbit psoas fibers.</a> Biophys J. 41 (1), 99-102 (1983).</li>
<li>Claflin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high+and+low-velocity+resistance+training+on+the+contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibers+from+young+and+older+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans.</a> J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).</li>
<li>Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+deficits+and+breakage+rates+after+single+lengthening+contractions+of+single+fast+fibers+from+unconditioned+and+conditioned+muscles+of+young+and+old+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).</li>
<li>Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+of+human+muscle%3A+understanding+sarcopenia+at+the+single+muscle+cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Rehabil+Clin+N+Am%22%5BJournal%5D)">Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level.</a> Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).</li>
<li>Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+single-fiber+studies+tell+us+about+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">What do single-fiber studies tell us about exercise training.</a> Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).</li>
<li>Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+muscle+fibers+after+short-term+resistance+exercise+training%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regulatory+Integrative+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human muscle fibers after short-term resistance exercise training.</a> Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 238, 408-416 (2002).</li>
<li>Trappe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+spaceflight%2C+simulated+spaceflight+and+countermeasures+on+single+muscle+fiber+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gravit+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology.</a> J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).</li>
<li>Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+long-term+muscle+paralysis+on+human+single+fiber+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics.</a> J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).</li>
<li>Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+muscle+fiber+contractile+properties+in+adults+with+muscular+dystrophy+treated+with+MYO-029%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029.</a> Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).</li>
<li>Russell, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+fast+skeletal+muscle+troponin+as+a+potential+therapeutic+approach+for+treating+neuromuscular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation of fast skeletal muscle troponin as a potential therapeutic approach for treating neuromuscular diseases.</a> Nature Medicine. 18 (3), 352-356 (2012).</li>
<li>Krivickas, L. S., Yang, J. I., Kim, S. K., Frontera, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+fiber+function+and+rate+of+disease+progression+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle fiber function and rate of disease progression in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Muscle Nerve. 26, 636-643 (2002).</li>
<li>Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+EDL+and+soleus+muscles+of+myostatin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice.</a> J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).</li>
<li>Lynch, G. S., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction-induced+injury+to+single+permeabilized+muscle+fibers+from+mdx%2C+transgenic+mdx+and+control+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx and control mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 279, 1290-1294 (2000).</li>
<li>Mizunoya, Q., Wakamatsu, J., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+high-resolution+separation+of+rodent+myosin+heavy+chain+isoforms+in+a+mini-gel+electrophoresis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protocol for high-resolution separation of rodent myosin heavy chain isoforms in a mini-gel electrophoresis system.</a> Anal Biochem. 377, 111-113 (2008).</li>
<li>Hill, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+of+shortening+and+the+dynamic+constants+of+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The heat of shortening and the dynamic constants of muscle.</a> Proc R Soc Lond B Biol Sci. 126, 136-195 (1938).</li>
<li>Bottinelli, R., Canepari, M., Pellegrino, M. A., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-velocity+properties+of+human+skeletal+muscle+fibres%3A+myosin+heavy+chain+isoform+and+temperature+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force-velocity properties of human skeletal muscle fibres: myosin heavy chain isoform and temperature dependence.</a> J Physiol. 495, 573-586 (1996).</li>
<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+velocity+of+unloaded+shortening+and+its+relation+to+sarcomere+length+and+isometric+force+in+vertebrate+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres.</a> J Physiol. 291, 143-159 (1979).</li>
<li>Brenner, B., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+force+generation+in+muscle%3A+Correlation+with+actomyosin+ATPase+activity+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution.</a> PNAS. 83, 3542-3546 (1986).</li>
<li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+calcium+on+the+maximum+velocity+of+shortening+in+skinned+skeletal+muscle+fibres+of+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).</li>
<li>Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+the+inhibitory+effects+of+orthovanadate+on+shortening+velocity+in+fast+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle.</a> Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).</li>
<li>Ashley, C. C., Moisescu, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+changing+the+composition+of+the+bathing+solutions+upon+the+isometric+tension-pCa+relationship+in+bundles+of+crustacean+myofibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of changing the composition of the bathing solutions upon the isometric tension-pCa relationship in bundles of crustacean myofibrils.</a> J Physiol. 270, 627-652 (1977).</li>
<li>Godt, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-activated+tension+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog.+Dependence+on+magnesium+adenosine+triphosphate+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-activated tension of skinned muscle fibers of the frog. Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration.</a> J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).</li>
<li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculator+programs+for+computing+the+composition+of+the+solutions+containing+multiple+metals+and+ligands+used+for+experiments+in+skinned+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Physiologie+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells.</a> Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).</li>
<li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+physiological+ADP+concentrations+on+contraction+of+single+skinned+fibers+from+rabbit+fast+and+slow+muscles%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles).</a> Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).</li>
<li>Godt, R. E., Maughan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swelling+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Swelling of skinned muscle fibers of the frog.</a> Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).</li>
<li>Kawai, M., Wray, J. S., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+lattice+spacing+change+on+cross-bridge+kinetics+in+chemically+skinned+rabbit+psoas+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The effect of lattice spacing change on cross-bridge kinetics in chemically skinned rabbit psoas muscle fibers.</a> Biophys J. 64, 187-196 (1993).</li>
<li>Millman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+filament+lattice+of+striated+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The filament lattice of striated muscle.</a> Physiol Rev. 78 (2), 359-391 (1998).</li>
<li>Edman, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+mouse+single+muscle+fibers%2C+a+comparison+with+amphibian+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers.</a> J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).</li>
<li>Phillips, S. K., Woledge, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+isometric+force%2C+maximum+power+and+isometric+heat+rate+as+a+function+of+sarcomere+length+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%22%5BJournal%5D)">A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle.</a> Pflügers Archiv. 420, 578-583 (1992).</li>
<li>Stephenson, D. G., Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sarcomere+length+on+the+force-pCa+relation+in+fast+and+slow-twitch+skinned+muscle+fibres+from+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat.</a> J Physiol. 333, 637-653 (1982).</li>
</ol>

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L&#39;évaluation des propriétés contractiles des fibres musculaires squelettiques simples perméabilisées sont utilisées pour étudier la fonction musculaire dans une grande variété de contextes. Les exemples incluent les études qui ont évalué les effets du vieillissement, 12 exercer 10,13,14, 15 vols spatiaux, des blessures 2,3,16, traitements médicamenteux 17,18, 19 maladies et les manipulations génétiques 20,21 sur la structure et la fonction des fibres. En raison de la capacité d&#39;évaluer directement la performance contractile des myofibrilles dans leur configuration native, cette technique fournit une plate-forme attrayante pour partir à former une compréhension de la fonction myofibrillaire absent des effets potentiellement confondants qui sont présents lorsque la transmission du signal neuromusculaire et la libération de calcium induite par l&#39;excitation- sont inclus dans le système étudié. En outre, les tests fonctionnels de fibres simples peut être utilisé pour compléter les résultats de l&#39;identification de protéines contractiles telles que cellesobtenu par immunohistochimie ou électrophorèse sur gel + western blot 22. Une des principales fonctions du muscle squelettique est de générer de la force. Par conséquent sF o, une mesure de la capacité de génération de force intrinsèque d&#39;un système contractile, est d&#39;un grand intérêt pour les physiologistes musculaires. Des estimations fiables de la SF o exigent des mesures précises des deux ASC de la fibre et F o. Depuis fibres sont, en général, ni circulaire en coupe, ni uniforme dans la norme CSA sur toute leur longueur, un grand soin doivent être prises lors de l&#39;estimation CSA. A cet effet, les mesures sont effectuées à plusieurs endroits le long de la longueur de la fibre et, à chaque emplacement, à partir de deux points de vue séparés par 90 °. Des mesures fiables de F o nécessitent une attention à plusieurs détails, y compris la comptabilisation des force passive, ajuster la longueur des sarcomères de maximiser le chevauchement des filaments épais et minces, en utilisant une solution d&#39;activation avec une concentration de calcium tRésultats sur le chapeau de l&#39;activation maximale, en maintenant la température expérimentale désirée, et le maintien de conditions optimales de stockage (température et durée) des fibres avant le jour de l&#39;expérience. Bien que les étapes décrites ci-dessous décrivent la procédure pour évaluer la force isométrique maximale, il est souvent souhaitable d&#39;évaluer d&#39;autres qualités fonctionnelles importantes de fibres musculaires squelettiques. Ceci peut être obtenu en étendant le protocole expérimental afin d&#39;inclure d&#39;autres manipulations mécaniques de la fibre. Par exemple, la mesure de la vitesse à laquelle la fibre raccourcit contre une série de différentes charges permet la détermination de la relation force-vitesse, à partir de laquelle les relations de force de puissance et vitesse puissance peuvent être calculées 10,23,24. En outre, la vitesse de raccourcissement sans charge peut être déterminée en utilisant le «test mou&quot; 25, qui consiste à appliquer une série de mesures et DE MESURE raccourcissement creuses induisantng le temps requis par la fibre pour enlever le mou. Un autre paramètre cinétique qui est fréquemment rapporté est tr k, la constante de vitesse pour la force réaménagement suivant une perturbation mécanique qui détache temporairement tous les ponts transversaux 26. Enfin, la relation entre la concentration de calcium et la génération de la force active (la &quot;relation force-PCA») est souvent un intérêt 18 et peut être déterminée en exposant la fibre à une série de solutions avec des concentrations en calcium allant de en dessous du seuil d&#39;activation de l&#39;contractile système à ceux suffisante pour déclencher l&#39;activation maximale et donc la force maximale (F o). Bien que la majeure partie de l&#39;équipement mentionné est nécessaire pour évaluer la contractilité seule fibre, d&#39;autres équipements est pas absolument nécessaire. Le régulateur de longueur, par exemple, est essentiel pour tout protocole expérimental qui nécessite un allongement ou raccourcissement rapide et précise de la fibre,mais ne sont pas absolument nécessaires pour évaluer la force isométrique maximale (si un niveau dans le dossier de force zéro force doit toujours être identifié par des moyens). Les prismes qui permettent l&#39;observation de la fibre par le côté, tout en étant utile pour l&#39;évaluation de surface de section transversale, ne sont pas absolument nécessaire lors du positionnement de la fibre à l&#39;intérieur de la chambre expérimentale. En outre, des moyens de remplacement pour exposer la fibre à des différentes solutions expérimentales peuvent être employés, y compris la conception d&#39;un système à commande manuelle de chambres ou une chambre unique qui permet le remplissage et la vidange rapide de solutions. Enfin, alors que les températures expérimentales sous-physiologiques telles que 15 ° C sont habituellement utilisés pour améliorer la reproductibilité des mesures mécaniques 1,2,3,5,8,12,17,27, il est possible de générer des données valides à d&#39;autres températures 23 , 28 aussi longtemps que les effets de la température sur les propriétés de la solution (concentration de calcium, le pH, etc.) sont pris en considération. </p&gt; Les compositions des solutions de test sont parmi les aspects les plus critiques des techniques de fibres perméabilisées décrites ici. Considérations concernant la composition de la solution est complexe et dépasse la portée de cet article. Les solutions décrites dans l&#39;étape 5 de la section de protocole sont conçus en mettant l&#39;accent sur ​​une activation rapide de la fibre perméabilisées lors de leur transfert à partir de pré-activation pour l&#39;activation de solutions tout en maintenant une force ionique constante, la composition cationique, et l&#39;osmolarité 6,29. D&#39;autres approches de composition de la solution ont été utilisées avec un succès notable par d&#39;autres groupes de recherche et généralement faire usage de constantes de liaison publiés et des outils informatiques 27,30,31. Les concentrations d&#39;ions calcium dans les différentes solutions d&#39;activation est particulièrement important dans les études impliquant une activation submaximale telles que les évaluations de force PCA. Pour les expériences dans lesquelles les fibres sont entièrement activés, tels que ceux décrired ici, la concentration de calcium dans la solution d&#39;activation dépasse généralement avec une marge confortable que nécessaire pour obtenir la force maximale, ce qui rend sa connaissance précise moins critique. L&#39;addition de phosphate de créatine est important pour tamponner les fluctuations intramyofibrillar ATP et ADP qui seraient autrement associés à l&#39;activité contractile. La créatine kinase est nécessaire pour catalyser le transfert de phosphate de créatine phosphate à l&#39;ADP. Dans des conditions expérimentales qui se traduisent par des taux de rotation élevés, y compris l&#39;ATP à travailler à des températures élevées ou raccourcissement de mesure à grande vitesse en 32 fibres rapides, la créatine kinase doit être ajouté à la solution pour compléter la créatine kinase endogène qui reste lié à la fibre. Pour des conditions expérimentales moins exigeantes, le système de régénération d&#39;ATP 27 est moins critique. Limites de la technique perméabilisée de fibre unique sont les suivants. Les données générées par ces tests définissent lapropriétés contractiles myofibrillaires de l&#39;unité spécifique qui a été attaché à l&#39;appareil expérimental. Par conséquent, cette capture seulement une petite fraction de l&#39;ensemble de fibres à partir de multinucléées laquelle le segment a été obtenu qui, à son tour, représente une petite fraction du nombre total de fibres dans le muscle. Les enquêteurs doivent donc examiner attentivement l&#39;échantillonnage requis pour appuyer des conclusions tirées des expériences. En outre, l&#39;évaluation de l&#39;impact d&#39;une intervention de l&#39;entraînement physique sur la fonction de la fibre présume que les fibres évalués ont en effet été recrutés au cours de la formation. Bien que le protocole tente d&#39;imiter le milieu intracellulaire naturel de la fibre, le procédé de perméabilisation de sarcolemme est non spécifique et permet nécessairement constituants intracellulaires solubles diffusent librement dans les solutions de bain. Une autre conséquence de la perméabilité de la membrane est un changement dans l&#39;équilibre osmotique mis en évidence par un gonflement en volume de fibres 33. Legonflement de la fibre augmente la distance entre l&#39;actine et la myosine résultant de la sensibilité réduite de calcium du système de myofilaments 34,35, mais peut être inversée par l&#39;introduction de grandes composés osmotiquement actifs 34. Une dernière limite à considérer est la conséquence de la technique utilisée pour fixer les fibres de l&#39;appareil expérimental. Cela exige invariablement fausser la relation spatiale au sein du système de filament à et à proximité des points d&#39;attache, à la participation à des déficits fonctionnels. Plus précisément, les régions de la fibre à et adjacente aux points de fixation sont fonctionnellement compromise et contribuent ainsi artéfactuelle série élasticité au système de mesure. En résumé, nous avons décrit un moyen permettant d&#39;évaluer la capacité de génération de force de fibres musculaires squelettiques perméabilisées chimiquement in vitro. Bien que l&#39;objet de cet article a été mis sur l&#39;évaluation des generatin maximale de force isométriqueg capacité des fibres musculaires squelettiques humaines, l&#39;approche expérimentale peut être modifiée et étendue afin de déterminer une variété de paramètres cinétiques et les relations à travers une gamme d&#39;espèces de mammifères, ou autrement.

La principale fonction du muscle squelettique est de générer de la force. la force musculaire est provoquée in vivo par une séquence complexe d&#39;événements qui comprend potentiels nerveuses motrices d&#39;action, la transmission neuromusculaire, fibres musculaires des potentiels d&#39;action, la libération de calcium intracellulaire, et l&#39;activation du système de protéines régulatrices et contractiles. Parce que la génération de force est le résultat final de cette séquence, un déficit en vigueur pourrait être causée par la défaillance d&#39;un ou plusieurs des étapes individuelles. Un attribut clé de la préparation de fibres perméabilisées est qu&#39;il élimine la plupart des étapes nécessaires à la génération de force in vivo, avec seulement les fonctions de réglementation et contractiles associés à l&#39;appareil myofibrillaire restant. L&#39;enquêteur assume le contrôle de la livraison de l&#39;activation de calcium et de l&#39;énergie (ATP), et est récompensé par un système simplifié qui permet l&#39;évaluation des structures de réglementation et contractiles isolés dans leur co natifnfiguration. Mesures de force utilisant des fibres musculaires squelettiques perméabilisées sont donc précieux lors de l&#39;évaluation des modifications de la fonction musculaire observée in vivo. Par exemple, nous avons utilisé cette technique pour caractériser la capacité de génération de force de fibres de myostatine souris déficientes 1 et d&#39;évaluer la cause de la faiblesse musculaire persistante exposé suivant rotateurs chronique rotateurs 2,3. Méthodologie de fibres perméabilisées moderne peut être attribuée à des études influentes début des 4,5 et est actuellement utilisé par un certain nombre de groupes de recherche. Bien que les techniques ont été décrites dans la littérature, il n&#39;a pas encore été présenté dans le format vidéo. Le but de cet article est d&#39;illustrer, une technique valide et fiable mise à jour pour mesurer la capacité maximale de production de force de fibres simples à partir d&#39;échantillons de muscles squelettiques perméabilisées chimiquement. Pour ce faire, un segment de fibre individuelle (désigné ici en tant que ̶0; fibre &quot;) est extraite à partir d&#39;un paquet pré-perméabilisées et de fibres placées dans une chambre contenant une solution expérimentale au repos, le trait caractéristique de ce qui est une concentration en calcium qui est &lt;10 nM. La fibre est ensuite fixé à une extrémité à un transducteur de force et à l&#39;autre extrémité à un dispositif de commande de longueur. Avec la fibre maintenu à une longueur de sarcomère optimale, il est transféré à une solution d&#39;activation qui a une concentration en calcium suffisante pour provoquer l&#39;activation maximale et la force de contraction isométrique ainsi maximale. Force données sont acquises, stockées et analysées à l&#39;aide d&#39;un ordinateur personnel.

<table><tbody><tr><td>Tube à essai de culture en polystyrène avec capuchon</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>14-956-3D</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse à bouchon à vis de 0,5 ml</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>02-681-334</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons de microcentrifugeuse de 0,5 ml avec joint torique</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>02-681-358</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse cryobox</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>5055-5005</td><td></td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>Mettler-Toledo</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Suture non stérile 10-0 monofilament</td><td>Ashaway Line Twine</td><td>S30002</td><td></td></tr><tr><td>Épingles à insectes</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinces - Dumont #5</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de microdissection</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Entraînements micrométriques</td><td>Parker Hannifin</td><td>3936M</td><td></td></tr><tr><td>Thermomètre</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>Circulateur à bain d’eau&nbsp ;</td><td>Neslab Instruments</td><td>RTE-111</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de température</td><td>Aplha Omega Instruments</td><td>Série 800</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel LabVIEW</td><td>National</td> <td>Instruments-Computer</td><td></td></tr><tr><td></td> Système <td>à</td><td></td> chambres <td>variées</td></tr> <tr><td></td><td>Aurora Scientific</td><td>802D</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de longueur</td><td>Aurora Scientific</td><td>312C</td><td></td></tr><tr><td>Capteur de force</td><td>Aurora Scientific</td><td>403A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Réactifs</td></tr><tr><td>K-proprionate</td><td>TCI America</td><td>P0510</td><td></td></tr><tr><td>Imadizole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull ; 6H20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Brij 58</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (acide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>Na2H2ATP&bull ; 0.56H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (acide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>MgO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529699</td><td></td></tr><tr><td>HDTA (acide)</td><td>TCI America</td><td>D2019</td><td></td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>KOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>35113</td><td></td></tr><tr><td>HCL (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949</td><td></td></tr><tr><td>Na2CrP&bull ; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Norme de pH 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB115</td><td></td></tr><tr><td>Norme de pH 7</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB107</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de la force maximale isométrique généré par perméabilisées fibres du muscle squelettique

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

L’analyse des propriétés contractiles des fibres musculaires squelettiques chimiquement pelées ou perméabilisées offre un moyen puissant d’évaluer la fonction musculaire au niveau de la cellule musculaire unique. Les études sur les fibres musculaires uniques sont utiles à la fois en science fondamentale et en études cliniques. Pour les études fondamentales, les mesures de contractilité d’une seule fibre musculaire permettent d’étudier les mécanismes fondamentaux de production de force et d’analyser la fonction musculaire dans le contexte de manipulations génétiques. Cliniquement, les études sur les fibres musculaires uniques fournissent des informations utiles sur l’impact des blessures et des maladies sur la fonction musculaire, et peuvent être utilisées pour guider la compréhension des pathologies musculaires. Dans cet article vidéo, nous décrivons les étapes nécessaires pour préparer et isoler un segment de fibre musculaire squelettique individuel, le fixer à un appareil de mesure de force, l’activer pour produire une force isométrique maximale et estimer sa section transversale dans le but de normaliser la force produite.

Fibres simples sains, perméabilisées chimiquement devraient apparaître uniforme en forme et avoir l&#39;espacement des stries cohérente lorsqu&#39;on les examine sous un fort grossissement. Les fibres qui sont inflexibles lorsqu&#39;il est manipulé avec les forceps ou avoir des dommages structurels évidents doivent être jetés. Des images numériques à fort grossissement prises au cours de l&#39;étape 15 sont analysées pour cinq mesures de diamètre par paires le long de la section médiane de la fibre. Fibre CSA est estimée en supposant une section transversale elliptique et une moyenne de 5 mesures de la CSA individuels comme représenté sur la figure 7A. Figure 7B sert également à illustrer comment les dimensions des fibres dans une vue peuvent être significativement différents par rapport aux dimensions appariés dans l&#39;autre vue (c.-à-cross les sections ne sont pas, en général, année). Traces de forces représentatifs de fibres lentes et rapides humains sont présentés sur les figures 8A et 8B, respectivement. Voltagsortie e du transducteur de force est acquise lors d&#39;un test et convertie de force (mN) à l&#39;aide d&#39;acquisition de données et des logiciels d&#39;analyse (LabVIEW). Figure 9 illustre l&#39;approche utilisée pour évaluer la force active maximale (F o), qui est calculé en soustrayant la force nécessaire pour maintenir la fibre à longueur optimale de sarcomère tandis que dans un état ​​de relaxation (force passive, F P), de la plus grande force isométrique développé lors de l&#39;activation de la fibre maximale (de la force totale, F T). Depuis la sortie du transducteur de force qui correspond à une force nulle est, en général, différente pour chacune des différentes chambres de bain, on desserrer brièvement la fibre à la fois dans la pré-activation et l&#39;activation de solutions pour capter le niveau du zéro de la force fiche expérimentale. Normalisation de la force active maximale par le CSA de fibre est utilisée pour générer le plus de valeur informative de la force spécifique (SF o). Parce qu&#39;elle prend en considération le CSA de la fibre, SF o </sub&gt; fournit une mesure de la capacité de génération de force intrinsèque de l&#39;appareil contractile de la fibre, ce qui permet des comparaisons fonctionnelles entre les fibres de dimensions disparates. Il convient toutefois de noter que les mesures de la CSA sont pas en mesure de distinguer la proportion de la fibre de filaments contractiles occupé par rapport à la proportion occupée par d&#39;autres structures sous-cellulaires. Les caractéristiques typiques de santé, des fibres adultes de Claflin et al., 2011 10 pour l&#39;homme, Mendias et al. 2011 1 pour la souris et Gumucio et al. 2012 2 pour rat sont détaillés dans le tableau 3. Toutes les données présentées dans le tableau 3 ont été générés en utilisant la techniques décrites dans cet article. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> Humain (Vaste externe) </strong&gt; </td><td> Souris (EDL) </td><td nowrap="nowrap"> Rat (Infra) </td></tr><tr><td colspan="2"> Mâle </td><td colspan="2"> Femme </td><td> Mâle </td><td> Mâle </td></tr><tr><td> Type 1 </td><td> Type 2a </td><td> Type 1 </td><td> Type 2a </td><td> (Pas tapé) </td><td> (Pas tapé) </td></tr><tr><td> CSA (pm 2) </td><td> 4880 - 6900 </td><td> 5270 - 8380 </td><td> 3870 - 5470 </td><td> 4010 - 5610 </td><td> 1850 - 3080 </td><td> 5290 - 8010 </td></tr><tr><td> F o (mN) </td><td> 0,79 à 1,17 </td><td> De 1,02 à 1,54 </td><td> 0,64 à 0,97 </td><td> 0,71 à 1,07 </td><td> 0,14 à 0,25 </td><td> 0,55 au 0,97 </td></tr><tr><td> SF o (kPa) </td><td> 142-182 </td><td> 165-210 </td><td> 156-193 </td><td> 172-214 </td><td> 67-94 </td><td> 102-131 </td></tr><tr><td> n </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Les caractéristiques typiques de la santé, des fibres adultes de vastus lateralis humaine 10, extenseur des orteils de la souris et le rat épineux 1 2 muscles. Longueurs de sarcomériques optimales ont été fixés à 2,7 um pour les fibres humaines 7,8 et 2,5 um à la fois pour la souris (36, 37) et des fibres de rat (38). Gammes expérimentale L f (25 e et 75 e quartiles) étaient de 1,39 à 1,73 mm, de 1,17 à 1,53 mm et de 1,32 à 1,59 mm pour l&#39;homme, la souris et le rat, respectivement. Plages indiquées indiquent les 25 ème et 75 ème quartiles et n est le nombre de fibres testées. Les problèmes les plus courants rencontrés lors des tests comprennent un bordereau de boucle de suture, ce qui en résulte une force responsabe avec un &quot;catch&quot;, telle que celle illustrée sur la figure 10A, et une déchirure d&#39;épaisseur partielle ou totale de la fibre, ce qui entraîne une réaction de force qui retourne brusquement vers ou à (pause) zéro tandis que la fibre est toujours immergée dans la solution d&#39;activation (Figure 10B). Si un lapsus, déchirure ou de bris lors d&#39;une expérience, la fibre doit être jeté et les données exclue, même si le maintien d&#39;un enregistrement sur ​​les défaillances de la fibre peut aussi être informative 11. Un autre résultat négatif qui peuvent être rencontrées est l&#39;activation prématurée de la fibre tandis que dans la solution (Figure 10C) pré-activation. Activation partielle dans la solution pré-activation suggère une contamination entre puits significative (soit une augmentation involontaire de la concentration de calcium dans le pré-activation bien). Dans ce cas, tous les bains devraient être aspirés et bien rincés à l&#39;eau déminéralisée. Séchage des surfaces de séparation entre les chambres est également recomded que l&#39;humidité ou de la condensation dans ces domaines peuvent conduire à l&#39;évacuation de solution entre les bains. La décision d&#39;inclure ou d&#39;exclure des données dépendra en définitive la mise au point expérimentale et devraient donc être considérées lors de la conception de l&#39;étude. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> Figure 1: boucle de suture (10-0 monofilament en nylon de suture). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> Figure 2:. Dissection Bundle Forceps sont dans la main gauche, des ciseaux de microdissection sont dans la main droite. La ligne rouge indique l&#39;orientation favorable du poignet et des ciseaux avec les axes longitudinaux des fibres. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> Figure 3: </strong&gt; (A) Appareil de test avec des composants marqués. (A) des chambres expérimentales avec des fonds transparents. (B) Longueur-contrôleur. (C) transducteur de force. (D) de la source lumineuse. (E) Longueur-contrôleur xyz micromètre entraînement avec affichage numérique. (F) Stade micromètre entraînement avec affichage numérique. (G) transducteur de force xyz micromètre entraînement. (H) Programme d&#39;calibré écran cible diffraction laser. Table de l&#39;isolement (i) de vibration. (B) Gros plan des chambres expérimentales. Surface (j) de fixation en acier inoxydable étendant à partir de la longueur-contrôleur. Surface (k) de fixation en acier inoxydable étendant à partir du transducteur de force. (L) Side-view prisme. (M) de logement pour les modules de refroidissement thermoélectrique. (N) thermocouple pour signaler chambre température. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> Figure 4: modification 100 pipette ul utilisé pour transférer des fibres de plat de dissection à la chambre expérimentale. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> Figure 5:. Montage fibre unique sur appareil expérimental (A) des boucles de suture préparés enfilés sur des surfaces de fixation en acier inoxydable. (B) Fibre transféré à la chambre expérimentale. (C) Fibre ancrée sur les surfaces de fixation en acier inoxydable selon la première paire de boucles de suture avec un excès de suture enlevés. (D) Deuxième paire de boucles de suture filetés sur le dessus de premières boucles de suture et attachés en place. <img alt="Figure 6"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; Figure 6: Sarcomère longueur est déterminée par la projection d&#39;un motif d&#39;interférence laser sur un écran cible calibré (a) la source de laser.. (B) Mirror. (C) l&#39;écran cible. Motif d&#39;interférence (d) au laser. <img alt="La figure 7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="Figure 7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> Figure 7: (A) Détermination de la zone fibre coupe à longueur optimale de sarcomère (humaine = 2,7 um). En supposant une section transversale elliptique, l&#39;ASC est calculé pour chacun des cinq emplacements le long de la section médiane de la fibre et la moyenne des cinq mesures individuelles est rapporté comme CSA de la fibre. 2a représente le diamètre supérieur de la vue et est<html> un axe de l&#39;ellipse, 2b représente diamètre vue latérale et l&#39;autre est l&#39;axe de l&#39;ellipse. (B) images de fibres représentatives illustrant chacune des cinq mesures de diamètre correspondantes prises à la fois dans la vue de dessus et de côté. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> Figure 8: traces de force représentatifs de vastus lateralis humain sain fibres musculaires (A) de type 1 fibres (CSA: 5710 um 2, F o: 0,89 mN et SF o: 156 kPa).. (B) le type de fibre 2a (CSA: 9510 um, 2 F o: 1,66 mN et SF o: 174 kPa). Fibre myosine type de chaîne lourde a été déterminée par l&#39;utilisation de séparation électrophorétique et l&#39;argent-coloration techniques 22. ADO / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; Figure 9: Calcul de la force active maximale (F o) (a) vue élargi de la réponse de la force de la fibre pendant le mouvement de mou induisant de la longueur contrôleur initié en solution de pré-activation.. F P est la force nécessaire pour maintenir une longueur de sarcomère de 2,7 um avec la fibre au repos. (B) de vue élargi de longueur contrôleur mouvement de slack-induisant. Notez que F o = F T - F P. <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> Figure 10: (A) boucle de suture glissement, comme en témoigne une &quot;capture&quot; en vigueur trace lors de la montée de la force. Vérifiez que les boucles sont sécurisées avant d&#39;activer la fibre. (B) la rupture de la fibre lors de l&#39;activation. Peut-être en raison de l&#39;intégrité des fibres pauvres ou traitement de fibres agressif pendant suture boucle lieument. (C) l&#39;activation des fibres partielle prématurée due à la contamination de la chambre de pré-activation avec Ca 2+.

L&#39;analyse des propriétés contractiles des fibres musculaires squelettiques chimiquement peau, ou perméabilisées offre un puissant moyen permettant d&#39;évaluer la fonction musculaire au niveau de la cellule musculaire unique. Dans cet article, nous présentons une technique valide et fiable pour préparer et tester perméabilisées fibres musculaires squelettiques in vitro.

Mesure de la force maximale isométrique généré par perméabilisées fibres du muscle squelettique

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la capacité maximale de production de force isométrique de fibres individuelles provenant d'échantillons de muscles squelettiques rendus perméables chimiquement. Cela est réalisé en exposant d'abord les membranes des fibres musculaires à un détergent chimique, éliminant ainsi la barrière entre les contenus extracellulaire et intracellulaire. La deuxième étape consiste à extraire une fibre individuelle d'un petit faisceau de fibres et à l'attacher à l'appareil expérimental.Ensuite, des motifs d'interférence laser sont utilisés pour régler la longueur optimale du sarcomère pour la fibre individuelle. Enfin, du calcium est administré afin de provoquer la force maximale de contraction isométrique. En définitive, la technique de la fibre unique perméabilisée permet d'évaluer les propriétés contractiles du muscle squelettique sans les complexités associées à l'architecture musculaire globale.La démonstration visuelle de cette méthode est utile, car les étapes clés permettant d'exécuter correctement le protocole peuvent être difficiles à apprendre. Commencez par préparer les solutions de dissection, de stockage et de test, comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Ensuite, utilisez une pince pour préparer des boucles de suture à partir de brins de suture en nylon monofilament USP 10-0.À l’aide de la technique du nœud double par-dessus, préparez quatre boucles pour chaque fibre à tester. Une fois formé, placez le nœud sous un microscope et réduisez sa taille à un diamètre d’environ 750 micromètres, en utilisant les marquages IPS GTI comme guide.Ensuite, coupez tout excès de suture, en ne laissant que la boucle et de petites extrémités de 500 micromètres de chaque côté. Transférez une petite quantité de tissu musculaire obtenue par biopsie ouverte ou par aiguille dans une boîte contenant une solution de dissection froide et ajoutez davantage de solution de dissection pour s'assurer que le tissu reste immergé. Examinez l'échantillon au microscope et manipulez-le de manière à aligner l'axe longitudinal des fibres vers l'épaule droite de l'expérimentateur.Ensuite, fixer l'échantillon sur la boîte en le maintenant aux coins avec la pince dans la main gauche et les ciseaux de microdissection dans la main droite. Commencer délicatement à disséquer un faisceau le long des marges longitudinales entre les fibres. Retirer et jeter tout tissu endommagé par la pince ou les épingles.À la suite du processus de dissection, transférez les faisceaux depuis la solution de dissection vers un flacon de trois millilitres contenant 2,5 millilitres de solution de dissection fraîche et refroidie, à laquelle un détergent non ionique a été ajouté. Incubez l'échantillon sur glace pendant 30 minutes, avec une agitation douce occasionnelle, en veillant à ce que les faisceaux restent immergés pendant toute la durée de l'incubation. Transférez ensuite les faisceaux dans un flacon contenant de la solution de dissection fraîche et agitez doucement et brièvement pour éliminer tout détergent résiduel.Une fois rincés, transférez les faisceaux dans un flacon contenant la solution de conservation refroidie et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez le flacon du stockage à quatre degrés Celsius et transférez tous les faisceaux dans un gobelet médicinal ou une boîte de dissection. En prévision du stockage, transférez les faisceaux dans des cryotubes individuellement étiquetés, remplis de 200 à 400 microlitres de solution de conservation fraîche, et veillez à ce que le faisceau ne soit ni collé sur la paroi du tube ni en surface.Ensuite, fermer le tube et conserver l'échantillon à moins 80 degrés Celsius. Mettre en place un dispositif expérimental semblable à celui illustré ici et décrit dans le protocole accompagnant. Puis remplir la première chambre expérimentale avec la solution relaxante, la deuxième chambre avec la solution pré-activante et la troisième avec la solution activante.Régler la température dans la chambre jusqu'à ce qu'elle soit stable à 15 degrés Celsius avec l'appareil dans la solution relaxante. Enfiler deux des boucles de suture préparées sur les surfaces d'attache en acier inoxydable qui se prolongent à la fois depuis le transducteur de force et depuis le contrôleur de longueur. Ensuite, décongeler un faisceau de fibres d'intérêt sur de la glace pendant environ 15 minutes, puis le transférer dans une boîte de Pétri recouverte d'élastomère de silicone remplie de solution relaxante fraîche et froide.Fixez le faisceau en place à l'aide d'épingles aux deux extrémités et assurez-vous qu'il est immergé à l'aide de la pince. Saisissez une fibre à une extrémité et commencez à l'extraire régulièrement selon son axe longitudinal. Une attention particulière doit être portée lors de l'extraction des fibres du faisceau, car des adhérences entre les fibres et la matrice extracellulaire peuvent entraîner une tension excessive, conduisant finalement à des lésions induites par l'étirement.Une fois extraite, introduisez la fibre dans une pipette modifiée accompagnée d'une petite quantité de solution relaxante, puis transférez-la dans la chambre expérimentale contenant la solution relaxante en la guidant délicatement avec la pince. Retirez la fibre de la pipette et fixez-la au contrôleur de longueur. À l'aide de la première boucle de suture, amenez l'autre extrémité de la fibre vers le transducteur de force et fixez-la en suivant la même procédure.Retirez tout excès de suture à l’aide des ciseaux de dissection microchirurgicaux. Ensuite, passez la deuxième boucle par-dessus la première et fixez la fibre à un point situé à moins de 0,2 millimètre de l’extrémité de la surface d’attachement du contrôleur de longueur. Répétez l’opération avec la deuxième boucle à l’extrémité de la fibre fixée au transducteur de force.Régler la position du contrôleur de longueur dans la direction de l'axe Y afin d'aligner la fibre parallèlement aux parois latérales de la chambre expérimentale. Ensuite, examiner la fibre à l’aide de la vue latérale du prisme et ajuster la position du contrôleur de longueur dans la direction de l’axe Z jusqu’à ce que la fibre soit parallèle au fond de la chambre. Si la fibre est endommagée de quelque manière que ce soit, elle doit être jetée et une nouvelle fibre doit être fixée.Activeer le laser et ajustez la position de la platine de manière à ce que le laser traverse le centre de la fibre. Ensuite, réglez la longueur du sarcomère en augmentant ou en diminuant la tension appliquée à la fibre à l’aide du micromètre du conducteur sur l’axe X du contrôleur de longueur, jusqu’à ce que l’espacement souhaité de la lumière diffractée soit observé sur l’écran cible. Une fois la longueur optimale du sarcomère réglée, mesurez la distance entre les deux sutures les plus internes.Positionner la chambre de manière que le fil vertical du réticule de l'oculaire soit aligné sur la bordure interne la plus proche d'une suture intérieure, puis effectuer le zéro. L'affichage numérique du micromètre commande le déplacement de la platine le long de l'axe des x par rapport au microscope, jusqu'à ce que le fil vertical du réticule de l'oculaire soit aligné avec la suture la plus interne. L'affichage numérique indiquera alors la longueur de la fibre ; maintenir la fibre à la longueur mesurée et utiliser la caméra montée sur le microscope pour acquérir une image à fort grossissement de la partie centrale de la fibre, selon les vues supérieure et latérale.Utilisez ces images pour calculer la surface transversale de la fibre. Utilisez le logiciel de commande de la chambre pour déplacer la fibre vers la chambre contenant la solution de pré-activation et incubez pendant trois minutes. Pendant que la fibre est dans la solution d'inactivation, mesurez sa tension passive, puis déplacez la fibre vers la chambre contenant la solution d'activation et laissez se développer la force isométrique maximale, indiquée par un plateau de force précédé d'une augmentation rapide.Ensuite, utilisez le contrôleur de longueur pour appliquer une réduction brève et rapide de grande amplitude de la distance entre les points d'attache de la fibre, suivie d'un retour rapide à la longueur initiale, afin d'identifier la sortie du transducteur de force correspondant à zéro. Les forces illustrées ici correspondent aux vues supérieure et latérale d'une fibre de forme elliptique provenant de ces observations. La section transversale a été déterminée en mesurant les diamètres en cinq points le long de la longueur de la fibre, puis en calculant la moyenne des cinq surfaces obtenues.Les tracés de force provenant de fibres musculaires humaines, lentes et rapides illustrent que les fibres rapides génèrent la force à un rythme plus élevé que les fibres lentes, selon la technique présentée dans cette vidéo. Les caractéristiques typiques des fibres musculaires humaines, de souris et de rat ont été mesurées et sont présentées ici. La plage indiquée correspond aux quartiles 25e à 75e et N représente le nombre de fibres testées.Remarquez la grande variation de la force spécifique entre les différentes espèces. Les procédures décrites ici permettent d'évaluer la capacité maximale intrinsèque de génération de force d'une fibre musculaire squelettique unique, en ajoutant des interventions supplémentaires, ainsi que des aspects importants de la physiologie du muscle squelettique, notamment entre autres, la relation longueur-force, la relation force-vitesse et les relations force-calcium, qui peuvent être mises en évidence.

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Cette vidéo montre la modulation de l'activité réflexe, la force volitive et déambulation à travers des évaluations cliniques et quantitatives chez les individus atteints de lésion médullaire incomplète du moteur à la suite d'une administration orale aiguë d'une recapture de la sérotonine (ISRS).

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Évaluation ex vivo de la contractilité, fatigabilité et isolées du Alternans muscles squelettiques

Mesures de la fonction musculaires contribuer à l'évaluation des agents thérapeutiques potentiels pour les pathologies musculaires, ainsi que pour la détermination des mécanismes sous-jacents physiologie de ce tissu. Nous allons démontrer la préparation du long extenseur des orteils et muscles du diaphragme pour les tests fonctionnels. Les protocoles de contractions isométriques et excentriques seront affichés, ainsi que les différences de résultats entre les muscles dystrophiques, ce qui...

Isométrique et excentrique évaluation de génération de forces des muscles squelettiques Isolé à partir des modèles murins de dystrophies musculaires

Nous présentons un protocole pour évaluer les changements dans la fonction neuromusculaire. La neurostimulation électrique percutanée est une méthode non invasive qui évoque des réponses musculaires. Les propriétés électrophysiologiques et mécaniques de ces réponses permettent d’évaluer la fonction neuromusculaire du cerveau au muscle (niveaux supra-rachidien, rachidien et périphérique).

Évaluation des systèmes neuromusculaire Fonction Utilisation percutanée électrique stimulation du nerf

Nous décrivons un protocole in vivo pour mesurer la dorsiflexion du pied suite à la stimulation du nerf péronier et à la contraction du compartiment crural antérieur de la patte postérieure du rat. De telles mesures sont un outil translationnel indispensable pour évaluer la pathologie des muscles squelettiques et les approches d’ingénierie tissulaire de la réparation et de la régénération musculaires.

des applications de<em&gt; In Vivo</em&gt; Tests fonctionnels du Rat jambier antérieur pour l&#39;évaluation de l&#39;ingénierie tissulaire Skeletal Muscle Repair

Une évaluation fonctionnelle de la jonction neuromusculaire (NMJ) peut fournir des informations essentielles sur la communication entre le muscle et le nerf. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer globalement les fonctionnalités NMJ tant musculaire à l’aide de deux préparations différentes muscle-nerf, c'est-à-dire soléaire-sciatique et diaphragme-phrénique.

Mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire

Présenté ici est un protocole pour évaluer les propriétés contractiles des myofibrils musculaires striés avec la résolution nano-Newton. Le protocole utilise une configuration avec une sonde de force optique basée sur l’interférométrie. Cette configuration génère des données avec un rapport signal/bruit élevé et permet d’évaluer la cinétique contractile des myofibrils.

Isoler les myofibrils des biopsies des muscles squelettiques et déterminer la fonction contractile avec un transducteur de force de résolution nano-newton

L’évaluation du rétablissement de moteur demeure la mesure de résultats de référence dans des études périphériques expérimentales de nerf. La mesure isométrique de force tétanique du muscle antérieur de tibialis chez le rat est un outil inestimable pour évaluer des résultats fonctionnels après reconstruction des défauts de nerf sciatique. Les méthodes et les nuances sont détaillées dans cet article.

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Le présent protocole décrit des détails expérimentaux concis sur l’évaluation et l’interprétation des données de couple in vivo obtenues par stimulation électrique du nerf péronier commun chez les porcs anesthésiés.

In vivo Mesure du couple isométrique du dorsiflexeur des membres postérieurs du porc

Apprenez à mesurer la force isométrique maximale des fibres musculaires perméabilisées. Cette technique permet d'évaluer les propriétés contractiles du muscle squelettique sans la complexité de l'architecture musculaire complète.

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