Mesure de la force maximale isométrique généré par perméabilisées fibres du muscle squelettique

L'objectif général de cette procédure est de mesurer la capacité maximale de production de force isométrique de fibres individuelles provenant d'échantillons de muscles squelettiques rendus perméables chimiquement. Cela est réalisé en exposant d'abord les membranes des fibres musculaires à un détergent chimique, éliminant ainsi la barrière entre les contenus extracellulaire et intracellulaire. La deuxième étape consiste à extraire une fibre individuelle d'un petit faisceau de fibres et à l'attacher à l'appareil expérimental.

Ensuite, des motifs d'interférence laser sont utilisés pour régler la longueur optimale du sarcomère pour la fibre individuelle. Enfin, du calcium est administré afin de provoquer la force maximale de contraction isométrique. En définitive, la technique de la fibre unique perméabilisée permet d'évaluer les propriétés contractiles du muscle squelettique sans les complexités associées à l'architecture musculaire globale.

La démonstration visuelle de cette méthode est utile, car les étapes clés permettant d'exécuter correctement le protocole peuvent être difficiles à apprendre. Commencez par préparer les solutions de dissection, de stockage et de test, comme décrit dans le protocole textuel accompagnant. Ensuite, utilisez une pince pour préparer des boucles de suture à partir de brins de suture en nylon monofilament USP 10-0.

À l’aide de la technique du nœud double par-dessus, préparez quatre boucles pour chaque fibre à tester. Une fois formé, placez le nœud sous un microscope et réduisez sa taille à un diamètre d’environ 750 micromètres, en utilisant les marquages IPS GTI comme guide.

Ensuite, coupez tout excès de suture, en ne laissant que la boucle et de petites extrémités de 500 micromètres de chaque côté. Transférez une petite quantité de tissu musculaire obtenue par biopsie ouverte ou par aiguille dans une boîte contenant une solution de dissection froide et ajoutez davantage de solution de dissection pour s'assurer que le tissu reste immergé. Examinez l'échantillon au microscope et manipulez-le de manière à aligner l'axe longitudinal des fibres vers l'épaule droite de l'expérimentateur.

Ensuite, fixer l'échantillon sur la boîte en le maintenant aux coins avec la pince dans la main gauche et les ciseaux de microdissection dans la main droite. Commencer délicatement à disséquer un faisceau le long des marges longitudinales entre les fibres. Retirer et jeter tout tissu endommagé par la pince ou les épingles.

À la suite du processus de dissection, transférez les faisceaux depuis la solution de dissection vers un flacon de trois millilitres contenant 2,5 millilitres de solution de dissection fraîche et refroidie, à laquelle un détergent non ionique a été ajouté. Incubez l'échantillon sur glace pendant 30 minutes, avec une agitation douce occasionnelle, en veillant à ce que les faisceaux restent immergés pendant toute la durée de l'incubation. Transférez ensuite les faisceaux dans un flacon contenant de la solution de dissection fraîche et agitez doucement et brièvement pour éliminer tout détergent résiduel.

Une fois rincés, transférez les faisceaux dans un flacon contenant la solution de conservation refroidie et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez le flacon du stockage à quatre degrés Celsius et transférez tous les faisceaux dans un gobelet médicinal ou une boîte de dissection. En prévision du stockage, transférez les faisceaux dans des cryotubes individuellement étiquetés, remplis de 200 à 400 microlitres de solution de conservation fraîche, et veillez à ce que le faisceau ne soit ni collé sur la paroi du tube ni en surface.

Ensuite, fermer le tube et conserver l'échantillon à moins 80 degrés Celsius. Mettre en place un dispositif expérimental semblable à celui illustré ici et décrit dans le protocole accompagnant. Puis remplir la première chambre expérimentale avec la solution relaxante, la deuxième chambre avec la solution pré-activante et la troisième avec la solution activante.

Régler la température dans la chambre jusqu'à ce qu'elle soit stable à 15 degrés Celsius avec l'appareil dans la solution relaxante. Enfiler deux des boucles de suture préparées sur les surfaces d'attache en acier inoxydable qui se prolongent à la fois depuis le transducteur de force et depuis le contrôleur de longueur. Ensuite, décongeler un faisceau de fibres d'intérêt sur de la glace pendant environ 15 minutes, puis le transférer dans une boîte de Pétri recouverte d'élastomère de silicone remplie de solution relaxante fraîche et froide.

Fixez le faisceau en place à l'aide d'épingles aux deux extrémités et assurez-vous qu'il est immergé à l'aide de la pince. Saisissez une fibre à une extrémité et commencez à l'extraire régulièrement selon son axe longitudinal. Une attention particulière doit être portée lors de l'extraction des fibres du faisceau, car des adhérences entre les fibres et la matrice extracellulaire peuvent entraîner une tension excessive, conduisant finalement à des lésions induites par l'étirement.

Une fois extraite, introduisez la fibre dans une pipette modifiée accompagnée d'une petite quantité de solution relaxante, puis transférez-la dans la chambre expérimentale contenant la solution relaxante en la guidant délicatement avec la pince. Retirez la fibre de la pipette et fixez-la au contrôleur de longueur. À l'aide de la première boucle de suture, amenez l'autre extrémité de la fibre vers le transducteur de force et fixez-la en suivant la même procédure.

Retirez tout excès de suture à l’aide des ciseaux de dissection microchirurgicaux. Ensuite, passez la deuxième boucle par-dessus la première et fixez la fibre à un point situé à moins de 0,2 millimètre de l’extrémité de la surface d’attachement du contrôleur de longueur. Répétez l’opération avec la deuxième boucle à l’extrémité de la fibre fixée au transducteur de force.

Régler la position du contrôleur de longueur dans la direction de l'axe Y afin d'aligner la fibre parallèlement aux parois latérales de la chambre expérimentale. Ensuite, examiner la fibre à l’aide de la vue latérale du prisme et ajuster la position du contrôleur de longueur dans la direction de l’axe Z jusqu’à ce que la fibre soit parallèle au fond de la chambre. Si la fibre est endommagée de quelque manière que ce soit, elle doit être jetée et une nouvelle fibre doit être fixée.

Activeer le laser et ajustez la position de la platine de manière à ce que le laser traverse le centre de la fibre. Ensuite, réglez la longueur du sarcomère en augmentant ou en diminuant la tension appliquée à la fibre à l’aide du micromètre du conducteur sur l’axe X du contrôleur de longueur, jusqu’à ce que l’espacement souhaité de la lumière diffractée soit observé sur l’écran cible. Une fois la longueur optimale du sarcomère réglée, mesurez la distance entre les deux sutures les plus internes.

Positionner la chambre de manière que le fil vertical du réticule de l'oculaire soit aligné sur la bordure interne la plus proche d'une suture intérieure, puis effectuer le zéro. L'affichage numérique du micromètre commande le déplacement de la platine le long de l'axe des x par rapport au microscope, jusqu'à ce que le fil vertical du réticule de l'oculaire soit aligné avec la suture la plus interne. L'affichage numérique indiquera alors la longueur de la fibre ; maintenir la fibre à la longueur mesurée et utiliser la caméra montée sur le microscope pour acquérir une image à fort grossissement de la partie centrale de la fibre, selon les vues supérieure et latérale.

Utilisez ces images pour calculer la surface transversale de la fibre. Utilisez le logiciel de commande de la chambre pour déplacer la fibre vers la chambre contenant la solution de pré-activation et incubez pendant trois minutes. Pendant que la fibre est dans la solution d'inactivation, mesurez sa tension passive, puis déplacez la fibre vers la chambre contenant la solution d'activation et laissez se développer la force isométrique maximale, indiquée par un plateau de force précédé d'une augmentation rapide.

Ensuite, utilisez le contrôleur de longueur pour appliquer une réduction brève et rapide de grande amplitude de la distance entre les points d'attache de la fibre, suivie d'un retour rapide à la longueur initiale, afin d'identifier la sortie du transducteur de force correspondant à zéro. Les forces illustrées ici correspondent aux vues supérieure et latérale d'une fibre de forme elliptique provenant de ces observations. La section transversale a été déterminée en mesurant les diamètres en cinq points le long de la longueur de la fibre, puis en calculant la moyenne des cinq surfaces obtenues.

Les tracés de force provenant de fibres musculaires humaines, lentes et rapides illustrent que les fibres rapides génèrent la force à un rythme plus élevé que les fibres lentes, selon la technique présentée dans cette vidéo. Les caractéristiques typiques des fibres musculaires humaines, de souris et de rat ont été mesurées et sont présentées ici. La plage indiquée correspond aux quartiles 25e à 75e et N représente le nombre de fibres testées.

Remarquez la grande variation de la force spécifique entre les différentes espèces. Les procédures décrites ici permettent d'évaluer la capacité maximale intrinsèque de génération de force d'une fibre musculaire squelettique unique, en ajoutant des interventions supplémentaires, ainsi que des aspects importants de la physiologie du muscle squelettique, notamment entre autres, la relation longueur-force, la relation force-vitesse et les relations force-calcium, qui peuvent être mises en évidence.