Name: HPLC: Mesure de loxydation des biomarqueurs ADN, 8-oxo-7,8-dihydro-2-désoxyguanosine, dans des cellules cultivées et des tissus animaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 12 s
Description: Apprenez à quantifier l'oxydation de l'ADN par HPLC-ED en détectant le biomarqueur 8-oxo-dGuo dans des cellules cultivées et des tissus animaux. Cette méthode sensible évalue l'intégrité de l'ADN et le stress oxydatif cellulaire.

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Cette recherche a été financée par l&#39;Initiative de Santé Canada de recherche en génomique et le développement (GRDI) et la Stratégie canadienne de réglementation de la biotechnologie (SCRB). Les auteurs ne sont pas de conflit d&#39;intérêts.

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<li>Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+7%2C8-dihydro-8-oxo-2%27-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).</li>
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<li>Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+rescue+of+integrated+shuttle+vectors+from+transgenic+mice%3A+A+model+for+studying+mutations+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).</li>
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<li>Badouard, C., Ménézo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+new+types+of+DNA+lesions+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">Determination of new types of DNA lesions in human sperm.</a> Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).</li>
<li>Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+to+DNA%3A+formation%2C+measurement+and+biochemical+features%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features.</a> Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).</li>
<li>Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH), 2015 Mar 1, San Diego, CA, , Available at: <a target="_blank" href="http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf">http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts ou intérêts financiers concurrents n’a été déclaré.

Bien que 8-oxo-dGuo a été rapporté comme un biomarqueur utile de l&#39;oxydation de l&#39;ADN, sa quantification fiable peut représenter un défi. Bien que plusieurs méthodes publiées existent, il ya une nécessité d&#39;une approche globale, aperçu descriptif du protocole pour permettre aux chercheurs de déployer la méthode dans leurs laboratoires. Ici, nous présentons un aperçu détaillé d&#39;un protocole fondé HPLC-qui ​​permettra aux nouveaux utilisateurs d&#39;établir une méthode efficace pour la détection 8-oxo-dGuo...

Espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS), dont les niveaux de l&#39;état d&#39;équilibre peut augmenter pendant de nombreuses conditions pathologiques et le métabolisme xenotoxic, contribuent à une augmentation de la fréquence des dommages oxydatifs à l&#39;ADN. Parmi plusieurs produits d&#39;oxydation possibles de nucléobases, des dommages oxydatifs de l&#39;ADN peut être facilement mesurée en utilisant le marqueur stable 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo), qui est l&#39;une des formes oxydées de 2 &#39; -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo ADN est le plus abondant lésion 2 et, par conséquent, a été étudiée de façon plus détaillée en tant que biomarqueur de l&#39;oxydation de l&#39;ADN malgré l&#39;existence de produits d&#39;oxydation de l&#39;ADN multiple 3. Chez l&#39;homme, ces dommages peuvent être réparé via la base réparation par excision de 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1) 4. Si laissé non réparés, 8-oxo-dGuo peut contribuer à la formation de base de mutations paire de substitution (ie, G à T transversions) 4. Fait important, la 8-oxo-dGuo est un marqueur établi for dommages à l&#39;ADN par rapport à l&#39;initiation et à la promotion de la cancérogenèse 2. Par conséquent, la quantification précise de la 8-oxo-dGuo est un biomarqueur utile et souhaitable de dommages oxydatifs de l&#39;ADN 5. Il ya une grande confusion dans la littérature concernant les noms corrects pour les formes oxydante endommagées de 2-désoxyguanosine et, d&#39;ailleurs, le nom correct du composé (s) régulièrement mesurés en tant que biomarqueur de lésions oxydatives de l&#39;ADN 6. Les 8-céto-6,8-dicéto-énol et 6, les formes tautomères des 8-oxo-dGuo (représenté sur la figure 1) sont les deux plus importants tautomères décrits dans la littérature 5,7. La forme 6,8-dicéto est la forme la plus importante au pH physiologique de 7,4, et est le produit d&#39;oxydation de l&#39;ADN le plus important 7. Par conséquent, 8-oxo-dGuo, plutôt que 8-hydroxy-dGuo est le nom le plus approprié pour ce produit d&#39;oxydation 6. Il est également important de noter que le 2-désoxyguanosine (dGuo), plutôt que nucleobase guanine (GUA) ribonucléoside ou guanosine (Guo), respectivement, sont détectés par la plupart des méthodes 6. Détection précise et la quantification de 8-oxo-dGuo est difficile en raison de: i) la variabilité dans la digestion de l&#39;échantillon d&#39;ADN, ii) l&#39;oxydation accidentelle de dGuo à 8-oxo-dGuo qui peut se produire lors de la préparation de l&#39;échantillon, et iii) la nécessité pour la validation effective de la méthode HPLC-ED analytique 8. Dans ce protocole, nous avons cherché à obtenir i) en fournissant des conditions, favorables à la digestion complète de l&#39;ADN et ii) par le chélateur inclusion de métal et des solutions de chélateur-traitée et un réactif d&#39;ADN isolation spéciale, tandis que iii) n&#39;a été que partiellement abordées par l&#39;inclusion de Des témoins positifs et fournissent ainsi que la méthode est capable de détecter des 8-oxo-dGuo dans des échantillons biologiques. En outre la validation est au-delà de la portée de ce document. Cependant, nous sommes convaincus que ce protocole aidera la prospectiveles utilisateurs à déterminer la mesure dans laquelle ils ont besoin de valider formellement le protocole, en fonction de leurs besoins. Une liste des étapes nécessaires à la validation formelle de la méthode est fournie plus loin. Pendant le développement et le déploiement d&#39;une méthode de détection 8-oxo-dGuo, méthodes publiées ont été revues et consolidées. Ainsi, cette méthode élimine le besoin de recueillir des informations de plusieurs sources publiées qui manquent souvent d&#39;importants détails expérimentaux tout en fournissant également des moyens rapides et simples de tester si la méthode pour la détection et la quantification de 8-oxo-dGuo a été adoptée avec succès. Ce procédé a été adapté avec succès utilisé pour analyser des échantillons d&#39;ADN à partir de cellules en culture et le tissu murin. Cet article vidéo aidera les autres groupes à établir une méthode efficace pour la détection et la quantification fiable de 8-oxo-dGuo par HPLC-ED.

<table><tbody><tr><td>8-oxo-dGuo standard</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>89320</td><td>Désigné de manière inappropriée comme « 8-hydroxy-2'-désoxy guanosine » ; voir Fig. 1 et le texte pour plus de détails.</td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5931</td><td>De E. coli</td></tr><tr><td>Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td>Chélate de métaux lourds</td></tr><tr><td>Mésylate de déféroxamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>dGuo standard</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7145</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>ADN de spermatozoïdes de saumon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td>Sel de sodium</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>TypeII, provenant du pancréas bovin</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Invitrogen</td><td>10503-27</td><td></td></tr><tr><td>Éthylènediamineacide tétraacétique sel disodique dihydraté (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>Le composé ne se dissoudrait pas complètement tant que le pH de la solution n’est pas ajusté à 8,0 (par ex. avec NaOH)</td></tr><tr><td>Milieu F12-K</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de garde</td><td>Spécialités chromatographiques</td><td>YBA 99S03 0204GC</td><td>Protège le colum de la contamination, peut également entraîner une accumulation de pression</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate</td> <td>de sodium monobasiqueSigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Invitrogen</td><td>15190-250</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme phosphodiestérase I&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3243</td><td>Type II à partir de venin de Crotalus adamaneus</td></tr><tr><td>Homogénéisateur de téflon</td><td>Thomas Scientific</td><td>7724T-1 ou 7724T-5 pour 1 ou 5 ml, respectivement</td> Le <td>volume (capacité de rétention) dépend de la quantité d’échantillon à traiter.</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Invitrogen</td><td>15050-065</td><td></td></tr><tr><td>YMC-BASIC colonne avec silice sphérique collée</td><td>Spécialités chromatographiques</td><td>YBA 99S03 1546WT</td><td></td></tr></tbody></table>

hplc: mesure de l&#39;oxydation des biomarqueurs adn, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-désoxyguanosine, dans des cellules cultivées et des tissus animaux

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Le stress oxydatif est associé à de nombreux processus physiologiques et pathologiques, ainsi que le métabolisme des xénobiotiques, conduisant à l&#39;oxydation des macromolécules biologiques, y compris l&#39;ADN. Par conséquent, la détection efficace de l&#39;oxydation de l&#39;ADN est important pour une variété de disciplines de recherche, y compris la médecine et de la toxicologie. Un biomarqueur commun par oxydation de l&#39;ADN endommagé est le 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo; souvent appelée à tort comme 8-hydroxy-2&#39;-désoxyguanosine (8-OH-dGuo ou 8 oxo-dG)). Plusieurs protocoles de mesure 8-oxo-dGuo par chromatographie liquide à haute pression avec détection électrochimique (HPLC-ED) ont été décrites. Toutefois, ceux-ci ont été principalement appliquées à l&#39;ADN purifié traité avec pro-oxydants. En outre, en raison de différences méthodologiques entre les laboratoires, principalement en raison de différences dans l&#39;équipement analytique, l&#39;adoption de méthodes publiées pour la détection de la 8-oxo-dGuo par HPLC-ED nécessite une optimisation soignée par chaque laboratoire. UNprotocole complet, décrivant un tel processus d&#39;optimisation, est absente. Ici, un protocole détaillé est décrit pour la détection de 8-oxo-dGuo par HPLC-DE, en ADN à partir de cellules en culture ou des tissus animaux. Elle illustre comment la préparation d&#39;échantillons d&#39;ADN peut être facilement et rapidement optimisée pour minimiser l&#39;oxydation indésirable de l&#39;ADN qui peut se produire au cours de la préparation des échantillons. Ce protocole montre comment détecter 8-oxo-dGuo dans des cellules humaines en culture d&#39;adénocarcinome alvéolaire (par exemple, des cellules A549) traités avec l&#39;agent oxydant KBrO 3, et à partir de la rate des souris exposées à la dibenzo d&#39;hydrocarbure aromatique polycyclique (DEF, p) chrysène (DBC, anciennement connu sous le dibenzo (a, l) pyrène, Dalp). Dans l&#39;ensemble, ce travail illustre comment une méthode HPLC-ED peut être facilement optimisée pour la détection de la 8-oxo-dGuo dans des échantillons biologiques.

dGuo a été observé à un temps de rétention de 4,7 min alors que les 8-oxo-dGuo avait un temps de rétention d&#39;environ 6,4 min (Figure 2A et B). Il n&#39;y a de différence sur 1000 fois dans les hauteurs de pics entre les deux analytes, comme on le voit sur ​​la figure 2C. Voltammogrammes pour 8-oxo-dGuo et dGuo ont été obtenus par les normes en cours d&#39;exécution à un potentiel de travail dans la gamme de 0,2 à 1,1 V. Le potentiel de travail optimal pour les 8-oxo...

Le but de ce protocole est la détection du marqueur de l&#39;oxydation de l&#39;ADN, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-désoxyguanosine (8-oxo-dGuo) par CLHP-DE, en ADN à partir de cellules en culture ou des tissus animaux.

HPLC: Mesure de l&#39;oxydation des biomarqueurs ADN, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-désoxyguanosine, dans des cellules cultivées et des tissus animaux

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter et de quantifier le produit d'oxydation de l'ADN, huit OXO DG, dans des échantillons biologiques par chromatographie liquide à haute pression couplée à une détection électrochimique ou H-P-L-C-E-D. Cela est réalisé par l'isolement d'un échantillon d'ADN à partir d'échantillons biologiques, suivi d'une digestion complète de l'ADN selon un protocole qui minimise l'oxydation indésirable de l'ADN pouvant survenir lors de la préparation des échantillons, grâce à l'inclusion d'un chélateur de métaux et d'un réactif spécial d'isolement de l'ADN. Ensuite, les conditions d'analyse par H-P-L-C-E-D sont optimisées et des courbes standards sont établies pour huit OXO DG et pour la deux primed dioxazine.La dernière étape consiste à analyser l'ADN digéré en série avec du DG à huit OD et de la désoxyguanine 2' prime par HPLC afin de déterminer les rapports entre le DG à huit OD et la désoxyguanine 2' prime dans les échantillons d'ADN digérés étudiés. En fin de compte, la détection et la quantification du DG à huit OD par HPLC-ED sont utilisées pour quantifier le degré d'oxydation de l'ADN dans des échantillons biologiques. Oui, le principal av

hplc-measurement-dna-oxidation-biomarker-8-oxo-78-dihydro-2

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Radical basé sur la chimie biomimétique a été appliquée à la construction-up bibliothèques nécessaires pour le développement de biomarqueurs.

Radicaux libres en biologie chimique: de Comportement chimique au développement de biomarqueurs

Nous décrivons ici les méthodes de quantification sensible et précise des lésions 8-oxo-7,8-dihydro-2 '-désoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-étheno-2 '-désoxyadénosine (1,n6-Dado) et 1,n2- étheno-2 '-désoxyguanosine (1,N-2dguo) dans l’ADN. Les méthodes ont été appliquées à l’évaluation des effets des particules fines ambiantes (PM2,5) dans les tissus (poumons, foie et rein) des souris A/J exposées.

Quantification de trois lésions de l’ADN par spectrométrie de masse et évaluation de leurs niveaux dans les tissus de souris exposés à des particules fines ambiantes

Ce protocole décrit une méthode efficace pour détecter quantitativement les dommages oxydatifs de l’ADN dans les cellules MCF-7 par la technologie ELISA.

Quantification du niveau de 8-oxo-dG à l’aide d’un test ELISA pour évaluer les dommages oxydatifs à l’ADN dans les cellules MCF-7

des plages de temps pour l'activité glycosylase de 8-oxoguanine ADN glycosylase sont biphasique présentant une salve de formation de produit et une phase de régime permanent linéaire. Utilisant des techniques de trempe de trésorerie, l'éclatement et les taux de régime permanent peut être mesurée, qui correspondent à l'excision de 8 oxoguanine et la libération de la glycosylase de l'ADN du produit, respectivement.

L&#39;état d&#39;équilibre des mesures cinétiques, pré-état stationnaire, et un seul chiffre d&#39;affaires de l&#39;activité de ADNglycosylase

L’origami d’ADN est une méthode puissante pour fabriquer des objets précis à l’échelle nanométrique en programmant l’auto-assemblage de molécules d’ADN. Nous décrivons ici un protocole pour le pliage d’un robot bio-réactif à partir d’origami d’ADN, sa purification et sa coloration négative pour l’imagerie au microscope électronique à transmission (MET).

Pliant et caractérisation d&#39;un Robot Bio-sensible de l&#39;ADN Origami

Le protocole décrit ici représente une méthode simple et reproductible qui utilise la chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) pour mesurer le métabolisme des purines sur des cellules de leucémie lymphoïde chronique (LLC) cultivées dans différentes conditions.

base HPLC-Assay pour surveiller extracellulaires Nucleotide / nucléosidiques Métabolisme dans les chroniques cellules leucémie lymphocytaire humaines

Un protocole pour éviter l’oxydation des substrats métalliques lors du transfert d’échantillons d’une solution acide inhibée vers un spectromètre photoélectronique à rayons X est présenté.

Détermination de la composition chimique de corrosion Inhibiteur Interfaces / métal avec XPS: Minimiser Poster Immersion Oxydation

Les auteurs décrivent le processus de fabrication et les essais des thermomètres photoniques.

Fabrication et essai de thermomètres photoniques

La présente méthode sert à identifier les inhibiteurs de l’isoforme spécifique des histones désacétylases (HDAC) dans les cellules HeLa par l’analyse UHPLC-MS de plusieurs substrats. Il s’agit d’une méthode sans anticorps mis au point afin de tenir compte de l’activité HDAC1 et HDAC6 dans la vie cellule environnement, contrairement à l’isoforme unique acellulaire dosages.

Mesure simultanée de HDAC1 et de HDAC6 activité en HeLa cellules utilisant UHPLC-MS

Ce protocole décrit la synthèse de particules magnétiques et évaluation de leurs propriétés de liaison à l’ADN par l’intermédiaire de diffusion de la lumière dynamique et électrophorétique. Cette méthode met l’accent sur la surveillance des changements dans la taille des particules, leur polydispersité et major de potentiel zêta de surface de particules qui jouent rôle dans la fixation des matières telles que l’ADN.

ADN-magnétoscopie liaison analyse par diffusion de la lumière dynamique et électrophorèse

Apprenez à quantifier l'oxydation de l'ADN par HPLC-ED en détectant le biomarqueur 8-oxo-dGuo dans des cellules cultivées et des tissus animaux. Cette méthode sensible évalue l'intégrité de l'ADN et le stress oxydatif cellulaire.

HPLC: Mesure de loxydation des biomarqueurs ADN, 8-oxo-7,8-dihydro-2-désoxyguanosine, dans des cellules cultivées et des tissus animaux (Vidéo) | JoVE Journal

HPLC: Mesure de l'oxydation des biomarqueurs ADN, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine, dans des cellules cultivées et des tissus animaux

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