Surface Enhanced Raman Spectroscopy Détection de biomolécules Utilisation EBL fabrication des substrats nanostructurés

L’objectif général de l’expérience suivante est de fabriquer et de caractériser des systèmes nanobiologiques conjugués interagissant avec des biomolécules solides nanostructurées. Ceci est réalisé en utilisant la lithographie par faisceau d’électrons à ultra haute résolution ou EBL pour obtenir des réseaux de minuscules nanostructures métalliques sur des supports en silice fondue. Dans un deuxième temps, les substrats sont mis en solution et les biomolécules sont immobilisées à leur surface, produisant les interfaces nanobiologiques.

Ensuite, la spectroscopie de ramen améliorée de surface ou SIRS est utilisée afin de sonder les molécules biologiques aux interfaces. Les spectres sir qui en résultent présentent les caractéristiques du mode ramen des molécules particulières, avec des intensités fortement dépendantes de la conception du substrat. Le principal avantage de notre approche par rapport aux techniques existantes comme la spectroscopie infrarouge est que la sensibilité peut être considérablement améliorée en raison du plasma de surface et de la résonance au sein des nanostructures métalliques.

Notre approche crée des surfaces hautement sélectives qui peuvent être facilement contrôlées en utilisant la combinaison de la fonctionnalisation moléculaire et de la lithographie par faisceau d’électrons. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans de multiples domaines, de l’exploration, de la recherche en biologie structurale ou du service mobilisé par les polymères au développement de divers dispositifs impliquant des interfaces nanobiologiques. Ces méthodes peuvent fournir en science des propriétés structurelles des biomolécules avec des implications allant au diagnostic médical ou à la détection environnementale.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car elle implique des aspects de la nanofabrication, de la fonctionnalisation de surface, de la biochimie et de la spectroscopie, qui n’ont traditionnellement pas été liés à la fabrication de polyméthacrylate de méthyle ou PMMA, de la réserve et des couches conductrices sur les substrats. Pour ce faire, utilisez une toupie à gaufrettes avec un mandrin à vide et placez les échantillons individuellement au centre du mandrin. Placez une goutte de résine PMMA au centre des échantillons à l’aide d’une pipette en verre.

Ensuite, tournez à 3 500 tr/min pendant 60 secondes avec un temps d’accélération de deux secondes. Ensuite, faites cuire les substrats à 180 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes après la cuisson des substrats, refroidissez les échantillons à température ambiante avec les substrats refroidis et retournez-les dans le mandrin tournant. Étalez une goutte de polymère conducteur sur le substrat.

Faites tourner le substrat pendant 40 secondes à 3000 tr/min avec une rampe de deux secondes après l’essorage. Faites cuire les échantillons à 80 degrés Celsius pendant une minute après avoir effectué la lithographie par faisceau d’électrons ou l’exposition EBL comme décrit dans le protocole de texte, préparez un bécher avec l’eau ionisée pour retirer le polymère conducteur. Préparez ensuite un deuxième bécher avec un mélange de révélateur et remuez pendant cinq minutes, réglez la température ambiante.

Enfin, préparez l’isopropanol dans un troisième bécher comme agent de rinçage à l’aide d’une pince à épiler. Placez les échantillons dans l’eau pendant trois secondes pour retirer le film polymère conducteur. Ensuite, placez l’échantillon dans le révélateur et déplacez lentement la pince à épiler de haut en bas pendant 20 secondes, transférez immédiatement les substrats sur l’isopropanol et rincez pendant 10 secondes de plus avant de sécher l’échantillon avec de l’azote, chargez les échantillons à l’envers dans le système d’évaporation à faisceau d’électrons pour permettre au métal évaporé de se déposer sur la face avant des échantillons.

Déposez une couche d’or de 10 nanomètres d’épaisseur sur les échantillons pour les dessins un et trois et une couche d’argent de 10 nanomètres d’épaisseur pour le dessin. Deux à une vitesse d’environ 0,1 nanomètre par seconde. Remplissez ensuite un système de sonication à la hauteur recommandée avec de l’eau et remplissez un bécher séparé avec de l’acétone.

Placez un échantillon face vers le haut au fond du bécher et laissez tremper l’échantillon pendant 10 minutes en tenant le bécher. Placez-le dans le bain-marie et laissez la hauteur de l’acétone correspondre à la hauteur de l’eau. Allumez ensuite le système de sonication.

Laissez la sonication se produire jusqu’à 60 secondes. Préparez d’abord une solution millimolaire de MUA et d’éthanol à température ambiante et sonicate pendant 10 minutes. Immergez le substrat nanostructuré approprié dans la solution de MUA pendant 48 heures.

Ensuite, rincez l’échantillon à l’éthanol trois fois et séchez-le pendant cinq minutes. Réglez la température ambiante. Ensuite, préparez une solution de 75 millimolaires d’EDC et d’eau distillée.

Préparez également une solution de 15 millimolaires de NHS dans de l’eau distillée à l’aide d’un dépôt de micro-pipette, 100 microlitres de NHS sur l’or sur le substrat, et ajoutez immédiatement 100 microlitres d’EDC sur la même surface. Incuber pendant une minute pour activer la monocouche auto-assemblée de MUA. Placez ensuite une goutte de 100 microlitres de protéines, une solution sur la même surface du substrat.

Placez l’échantillon dans un compartiment d’une boîte de Pétri avec un millilitre d’eau distillée dans un autre compartiment. Fermez la boîte de Pétri avec un couvercle et conservez l’échantillon pendant 24 heures à cinq degrés Celsius. Ensuite, rincez l’échantillon à l’eau distillée trois fois en continuant les échantillons dans des béchers séparés pendant 20 secondes dans chaque bécher, ne laissez pas les échantillons sécher après le rinçage ou pendant le rinçage pour la conception deux échantillons.

Préparez une solution de 0,9 millimolaire de protéine de liaison au glucose ou GBP dans un tampon de phosphate de potassium. Préparez également une solution de 100 millimolaires de glucose DG dans le tampon. Mélangez ensuite 30 microlitres de la solution de glucose D et 30 microlitres de la solution GBP.

À l’aide d’un récipient en microtube en plastique d’un millilitre et d’une micropipette, incubez pendant 30 minutes, puis déposez 20 microlitres de la solution GBP sans ligand et 20 microlitres de la solution GBP liée au ligand sur les substrats préparés. À l’aide d’une micro-pipette, conservez les échantillons à cinq degrés Celsius pendant 24 heures dans une boîte de Pétri avec un couvercle scellé. Rincer les échantillons trois fois dans la solution tampon de phosphate de potassium à température ambiante pour préparer.

Concevez trois échantillons : diluez la solution d’apre de liaison à la dopamine ou de DBA à une concentration d’une micromolaire. À l’aide du tampon tris EDTA avec un pH final de 7,4, préparez une solution de dopamine à une concentration de cinq micromolaires en mesurant la poudre de dopamine sur une balance analytique et en la mélangeant dans la solution saline tamponnée au phosphate ou PBS avec un mélange pendant cinq minutes. Déposez ensuite une goutte de 20 microlitres de la solution DBA à la surface de chaque substrat et laissez reposer l’échantillon pendant une heure à température ambiante avec un couvercle sur la boîte de Pétri.

Après avoir rincé les échantillons trois fois dans un tampon de phosphate de potassium, placez les échantillons à la verticale sur une lingette de qualité salle blanche pour sécher l’arrière tout en maintenant un film sur la face avant du substrat. Mettez un échantillon de côté comme contrôle. Ensuite, placez une goutte de cinq microlitres de la solution de dopamine sur la surface du PBS existant.

Déposez les échantillons restants. Incuber les échantillons pendant 10 minutes avant de les rincer trois fois dans la solution tampon de phosphate de potassium. Pour effectuer la spectroscopie de ramen.

Placez chaque échantillon dans une chambre étanche pour éviter l’évaporation par exposition au laser. Remplissez une seringue en plastique avec de la graisse sous vide poussé chimiquement inerte. Placez ensuite les échantillons sur des lames de verre et versez quelques millimètres de graisse autour des échantillons sans toucher les échantillons.

Placez une lamelle de protection de microscope sur les substrats. Appuyez doucement pour former un joint, créant une fine interface liquide entre les substrats et les lamelles sans permettre au tampon d’entrer en contact avec la graisse sous vide. À l’aide d’un système de microscope optique Raman, obtenez une mise au point sur la surface de la région du motif nanométrique métallique à échantillonner sans allumer le laser.

Effectuez l’échantillonnage Raman comme décrit dans le protocole textuel illustré. Voici les réseaux de points nano de nickel doré et argenté sur silice fondue. L’utilisation de la lithographie par faisceau d’électrons ou EBL permet une position et une dimension superbes.

La taille du point de contrôle et la largeur de l’espace sont contrôlées par l’exposition EBL. Des rangées hexagonales de dose d’or et de nickel argenté sont affichées ici. Le comportement de nucléation de ces couches métalliques très minces entraîne des structures discontinues.

Voici le spectre en série de la protéine A immobilisée dans le substrat : dans la conception, l’intensité du signal du premier réseau est beaucoup plus forte que celle du deuxième réseau. Le signal du réseau trois était très faible. L’espacement des espaces est clairement un paramètre critique pour le découplage du plasma et l’amélioration de la surface de la diffusion des ramen.

Voici les spectres de la protéine de liaison au glucose montrant les effets de différents modèles de substrat à l’état sans ligand et lié au ligand. Enfin, les spectres s de l’aptamère de liaison à la dopamine sont montrés pour les molécules sans ligand et liées aux ligands. Un spectre de poudre de dopamine est montré à titre de référence.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’éviter la contamination des substrats. Comme une technique de spectroscopie est très sensible et vous pouvez avoir de fausses lectures en utilisant cette procédure. Des conceptions optimales de substrat source peuvent être identifiées pour des analytes spécifiques.

Ensuite, d’autres méthodes nphy comme la phy non imprimable peuvent être effectuées pour améliorer l’évolutivité de la fabrication du substrat après son développement. Cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la biochimie et de la biodétection de détecter des molécules biologiques sans certaines surfaces en très petites quantités tout en restant en solution. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon de contrôler la taille des nanostructures métalliques et les propriétés du film à l’aide de techniques de fabrication et d’exploiter différentes stratégies de reconnaissance biomoléculaire pour cibler différents analytes.