Name: Surface Enhanced Raman Spectroscopy Détection de biomolécules Utilisation EBL fabrication des substrats nanostructurés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Découvrez la fabrication de substrats nanostructurés par lithographie électronique pour la détection SERS de biomolécules immobilisées. Cette méthode offre une sensibilité accrue pour l'étude des interactions protéine-ligand.

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Les auteurs tiennent à remercier : David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside et Albert Cao pour leur aide dans le développement et la préparation des conjugués de protéines ainsi que de l’aptamère d’ADN ; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar et Trevor Olsen pour leur aide dans la préparation de l’échantillon, Jonathan Mane pour son aide dans la génération d’images des structures moléculaires ; et les sources de financement, y compris le Conseil national de recherches du Canada – L’Institut national de nanotechnologie (INNT-CNRC), le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et l’Université de l’Alberta, pour leur soutien aux travaux.

1. Préparation du support <ol><li> Utilisez une scie de découpe semi-conducteurs pour couper une silice fondue (FS) tranche en 1 cm x 1 cm ou plus petits dés. </li><li> Nettoyer échantillons dans une solution de piranha (H 2 SO 4: H 2 O 2, 3: 1; ATTENTION: oxydant fort) salle de bain 28 pendant 15 minutes, puis rincer les dés dans de l&#39;eau déminéralisée et sec dans de l&#39;azote. </li><li> Placer les échantillons sur une plaque chauffante face vers le haut à 180 ° C pendant 15 min. Refroidir les échantillons après le retrait de la plaque de cuisson à la température ambiante. </li><li> Pour Designs 1 et 3, passez à l&#39;étape 2. </li><li> Pour Design 2, placer l&#39;échantillon dans une chambre d&#39;évaporation par faisceau d&#39;électrons et les enduire d&#39;une couche de 10 nm de Ni. </li></ol> 2. Fabrication de PMMA Masques Nano-motifs Utilisation faisceau d&#39;électrons Lithographie (EBL) <ol><li> Spin-couche résist le PMMA et les couches conductrices sur des substrats. <ol><li> Utilisez un spinner de plaquette avec un mandrin à vide et placer les échantillons individuellement dans le centre sur le mandrin. LieuUne goutte de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) résister au centre des échantillons à l&#39;aide d&#39;une pipette de verre et essorage à 3500 tours par minute pendant 60 s avec un temps de rampe de 2 sec. </li><li> Cuire les substrats à 180 ° C pendant 3-5 min. Après la cuisson, les substrats, refroidir les échantillons à la température ambiante. </li><li> Avec les substrats refroidis et renvoyés au mandrin de filage, étaler une goutte de polymère conducteur sur le substrat. Spin le substrat pendant 40 secondes à 3000 tours par minute avec un temps de rampe 2 sec. Échantillons Cuire au four à 80 ° C pendant 1 min. </li></ol></li><li> Effectuer l&#39;exposition EBL selon le 16,17,18,29 procédure standard. <ol><li> En utilisant les instructions du fabricant, préparer une conception utilisant des doses d&#39;exposition de caractéristique à partir du tableau 1 avec la plus petite taille de pas possible de faisceau. </li><li> Charger l&#39;échantillon dans la chambre de lithographie par faisceau d&#39;électrons. Si le système EBL n&#39;a pas autofocus, utilisez une petite égratignure de l&#39;endroit où le motif doit être exposé et loin du bord de perles de mise au pointing. </li><li> En utilisant les instructions du fabricant, effectuer la nécessaire mise au point et de correction d&#39;astigmatisme ainsi que l&#39;alignement du champ d&#39;écriture, le cas échéant, et d&#39;exposer l&#39;échantillon. Pour permettre profil d&#39;exposition appropriée et la meilleure qualité de modèle, utiliser une énergie de faisceau d&#39;électrons de 30 keV et 7,5 um ouverture pour les expositions. </li></ol></li><li> Retirez le polymère conducteur et développer échantillons exposés. <ol><li> Préparer un bêcher avec désionisée (DI) de l&#39;eau pour éliminer le polymère conducteur et un deuxième bêcher avec un mélange de révélateur (IPA: H 2 O, 7: 3), et on agite pendant 5 min à température ambiante. Préparer isopropanol (pureté élevée) dans une troisième bêcher en tant qu&#39;agent de rinçage. </li><li> Aide de pincettes, placer les échantillons dans l&#39;eau pendant 3 secondes pour enlever le film de polymère conducteur, puis placez l&#39;échantillon dans le développeur et déplacer les pinces lentement de haut en bas pendant 20 sec. Transférer immédiatement les substrats à l&#39;isopropanol et rincer pendant 10 secondes, puis sécher l&#39;échantillon avec de l&#39;azote. </li> &lt;/ Ol&gt; </li></ol> 3. Noble Métal Nanostructures Fabrication <ol><li> Charger les échantillons à l&#39;envers dans le système d&#39;évaporateur à faisceau d&#39;électrons pour permettre le métal évaporé à se déposer sur la face avant des échantillons. Déposer un 10 nm d&#39;épaisseur Au couche sur les échantillons pour les dessins et modèles 1 et 3, et une couche Ag 10 nm d&#39;épaisseur pour le design 2 à un taux d&#39;environ 0,1 nm / sec. </li><li> Remplissez un système de traitement par ultrasons à la hauteur recommandée avec de l&#39;eau et de remplir un bécher séparé avec de l&#39;acétone. Placez un visage de l&#39;échantillon dans le fond du récipient et laisser l&#39;échantillon à tremper pendant 10 min. Tenir le bécher, placez-le dans le bain de l&#39;eau et permettre la hauteur de l&#39;acétone pour correspondre à la hauteur de l&#39;eau et allumer le système de traitement par ultrasons. Laisser sonication de se produire jusqu&#39;à 60 sec. </li><li> En utilisant la même procédure décrite à l&#39;étape 3.1, préparer uniformes Au et Ag substrats de plaquettes par dépôt de 10 nm films métalliques épais sur FS (dessins 1 et 3) et FS Ni-enduits (conception 2) substrAtes sauter l&#39;étape 2. </li></ol> 4. Bio-fonctionnalisation de substrats <ol><li> Préparer une conception échantillons: <ol><li> Préparer une solution à 1 mM d&#39;acide 11-mercaptodecanoic (MUA) dans de l&#39;éthanol à température ambiante. Ultrasons pendant 10 min. </li><li> Plongez substrat nanostructuré appropriée dans la solution des MUA pendant 48 heures. Rincer l&#39;échantillon avec de l&#39;éthanol à trois reprises et sec pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Préparer une solution à 75 mM de N de la N &#39;- (3- (diméthylamino) propyl) carbodiimide (EDC) dans de l&#39;eau DI. Préparer une solution à 15 mM de N-hydroxysuccinimide (NHS) dans de l&#39;eau DI. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un dépôt de micropipette 100 pi de NHS sur le Au sur le substrat, et ajouter immédiatement 100 pi d&#39;EDC sur la même zone. Incuber pendant 1 min pour activer la monocouche auto-assemblée (SAM) des MUA. </li><li> Placer une goutte de 100 pl de solution de protéine A (47 pM) sur la même surface du substrat et stocker l&#39;échantillon pendant 24 heures à 5 ° C dans un environnement multi-compartiment Petri dish avec 1 ml d&#39;eau désionisée dans un autre compartiment, et avec un couvercle étanche. </li><li> Rincer l&#39;échantillon dans de l&#39;eau DI 3 fois par remuant continuellement les échantillons dans des béchers séparés pendant 20 secondes dans chaque bécher. Ne laissez pas les échantillons sécher après rinçage ou pendant le rinçage. </li><li> Passez à l&#39;étape 5. </li></ol></li><li> Préparer deux échantillons de conception: <ol><li> Préparer une solution à 0,9 mM de protéine de liaison glucose (GBP) en tampon phosphate de potassium (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5). Préparer une solution de 100 mM de D-glucose dans le tampon. </li><li> Mélanger 30 ul de solution 100 mM de D-glucose et 30 ul d&#39;une solution 0,9 mM de GBP en utilisant un récipient de plastique microtube de 1 ml et d&#39;une micropipette. Incuber pendant 30 min. </li><li> Dépôt de 20 pi de la solution de GBP ligand libre et de la solution de GBP ligand lié chacun sur les substrats préparés à l&#39;aide d&#39;une micropipette. Conserver les échantillons à 5 ° C pendant 24 heures dans une boîte de Pétri avec un couvercle étanche. </li><li> Rincer les échantillons trois fois dans leune solution tampon de phosphate de potassium à température ambiante. </li><li> Passez à l&#39;étape 5. </li></ol></li><li> Préparer trois échantillons de conception: <ol><li> Diluer le (DBA) solution aptamère de liaison de la dopamine à une concentration de 1 uM en utilisant le tampon Tris EDTA à un pH final de 7,4. </li><li> Préparer une solution de la dopamine à une concentration de 5 uM, en mesurant la poudre de la dopamine sur une balance analytique et en le mélangeant dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec un bourrelet d&#39;agitation pendant 5 min. </li><li> Déposer une baisse de 20 ul de la solution de DBA sur la surface de chaque substrat et laisser les échantillons reposer pendant 1 heure à température ambiante avec un couvercle sur la boîte de Pétri. </li><li> Rincer les échantillons trois fois dans un tampon de phosphate de potassium (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5). </li><li> Placer les échantillons en position verticale au-dessus de la note de salle blanche lingette pour sécher l&#39;arrière tout en maintenant un film sur la face avant du substrat. Définir un échantillon de côté comme un contrôle. </li><li> Placer une goutte de 5 pi de la solution de dopamine on la surface existante de la goutte de la solution de tampon PBS sur les échantillons restants avec les concentrations souhaitées de la dopamine. Incuber l&#39;échantillon pendant 10 min. </li><li> Placez une goutte de la solution de la dopamine sur la surface du tampon Au sans aptamère. Incuber pendant 10 min. </li><li> Rincer les échantillons dans la solution de tampon de phosphate de potassium 3 fois. </li></ol></li></ol> 5. spectroscopie Raman <ol><li> Placer chaque échantillon dans une chambre étanche à l&#39;eau pour éviter l&#39;évaporation par exposition au laser. <ol><li> Remplir une seringue en plastique avec de la graisse à vide élevé chimiquement inerte, placer les échantillons sur des lames de verre et distribuer quelques millimètres de graisse entourant les échantillons sans toucher les échantillons. </li><li> Déposer une lamelle de microscope au-dessus des substrats et appuyez doucement pour former un joint, créant une interface liquide mince entre les substrats et les lamelles sans permettre au tampon de venir en contact avec la graisse à vide. </li></ol></li><li> Utilisation d&#39;unSystème de microscope optique Raman, d&#39;obtenir une mise au point sur la surface de la région de la nano-métal à motifs à échantillonner sans avoir à allumer le laser. </li><li> Effectuer Raman échantillonnage 18,19 avec une intensité laser entre 2.4 à 3.1 mW avec une durée totale de moins de 20 sec pour éviter d&#39;endommager l&#39;échantillon avec un objectif de grossissement 10X. Acquérir les spectres Raman pour des échantillons de dessins et modèles 1, 2 et 3 en utilisant les longueurs d&#39;onde d&#39;excitation comme indiqué dans le tableau 1. Acquérir également les spectres de Raman de commande pour des solutions de protéine A, GBP, et le D-glucose, et de la poudre de dopamine employant des lames de verre sans métal nanostructures soutient que pour la comparaison. </li></ol>

<ol><li>Sapsford, K. E., Tyner, K. M., Dair, B. J., Deschamps, J. R., Medlintz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Nanomaterial+Bioconjugates%3A+A+Review+of+Current+and+Emerging+Purification+and+Characterization+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analyzing Nanomaterial Bioconjugates: A Review of Current and Emerging Purification and Characterization Techniques.</a> Anal. Chem. 83, 4453-4488 (2011).</li>
<li>Walcarius, A., Minteer, S. hD., Wang, J., Yu, L., Merkoçi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+for+Bio-Functionalized+Electrodes%3A+Recent+Trends%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials for Bio-Functionalized Electrodes: Recent Trends.</a> J. Mater. Chem. B. 1, 4878-4908 (2013).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications%2C+Techniques%2C+and+Microfluidic+Interfacing+for+Nanoscale+Biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Applications, Techniques, and Microfluidic Interfacing for Nanoscale Biosensing.</a> Microfluid. Nanofluid. 7, 149-167 (2009).</li>
<li>Rassaei, L., Singh, P. S., Lemay, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithography-Based+Nanoelectrochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lithography-Based Nanoelectrochemistry.</a> Anal. Chem. 83, 3974-3980 (2011).</li>
<li>Wong, L. S., Khan, F., Micklefield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Covalent+Protein+Immobilization%3A+Strategies+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Selective Covalent Protein Immobilization: Strategies and Applications.</a> Chem. Rev. 109, 4025-4053 (2009).</li>
<li>Ley, C., Holtmann, D., Mangold, K. -M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Histidine-Tagged+Proteins+on+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Histidine-Tagged Proteins on Electrodes.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 88, 539-551 (2011).</li>
<li>Kim, D., Herr, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Immobilization+Techniques+for+Microfluidic+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Protein Immobilization Techniques for Microfluidic Assays.</a> Biomicrofluidics. 7, 041501(2013).</li>
<li>Anker, J. N., Hall, W. P., Lyandres, O., Shah, N. C., Xhao, J., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensing+with+Plasmonic+Nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Biosensing with Plasmonic Nanosensors.</a> Nature Materials. 7, 442-453 (2008).</li>
<li>Bantz, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Progress+in+SERS+Biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.Chem%22%5BJournal%5D)">Recent Progress in SERS Biosensing.</a> Phys.Chem. 13, 11551-11567 (2011).</li>
<li>Sharma, B., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Ringe, E., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERS%3A+Materials%2C+Applications%2C+and+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Today%22%5BJournal%5D)">SERS: Materials, Applications, and the Future.</a> Mater. Today. 15, 16-25 (2012).</li>
<li>Kleinman, S. L., Frontiera, R. R., Henry, A. -I., Dieringer, J. A., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating%2C+Characterizing%2C+and+Controlling+Chemistry+with+SERS+Hot+Spots%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.Chem.Chem.Phys%22%5BJournal%5D)">Creating, Characterizing, and Controlling Chemistry with SERS Hot Spots.</a> Phys.Chem.Chem.Phys. 15, 21-36 (2013).</li>
<li>Fan, M., Andrade, F. S., Brolo, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+on+the+Fabrication+of+Substrates+for+Surface+Enhanced+Raman+Spectroscopy+and+their+Applications+in+Analytical+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">A Review on the Fabrication of Substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy and their Applications in Analytical Chemistry.</a> Anal. Chim. Acta. 693, 7-25 (2011).</li>
<li>Cao, Y., Li, D., Jiang, F., Yang, Y., Zh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Metal+Nanostructure+for+SERS+Application%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanomater%22%5BJournal%5D)">Engineering Metal Nanostructure for SERS Application.</a> J. Nanomater. 123812, 1-12 (2013).</li>
<li>Glembocki, O., Rendell, R., Alexson, D., Prokes, S., Fu, A., Mastro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectric-Substrate-Induced+Surface-Enhanced+Raman+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+B%22%5BJournal%5D)">Dielectric-Substrate-Induced Surface-Enhanced Raman Scattering.</a> Phys. Rev. B. 80, 085416(2009).</li>
<li>Merlen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Enhanced+Spectroscopy+with+Gold+Nanostructures+on+Silicon+and+Glass+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci%22%5BJournal%5D)">Surface Enhanced Spectroscopy with Gold Nanostructures on Silicon and Glass Substrates.</a> Surf. Sci. 605, 1214-1218 (2011).</li>
<li>Muhammad, M., Buswell, S. C., Dew, S. K., Stepanova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopatterning+of+PMMA+on+Insulating+Surfaces+with+Various+Anticharging+Schemes+Using+30+keV+Electron+Beam+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.+B%22%5BJournal%5D)">Nanopatterning of PMMA on Insulating Surfaces with Various Anticharging Schemes Using 30 keV Electron Beam Lithography.</a> J. Vac. Sci. Technol. B. 29, 06F304(2011).</li>
<li>Peters, R., Fito, T., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+Multilayer+Systems+in+Electron+Beam+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.+B%22%5BJournal%5D)">Study of Multilayer Systems in Electron Beam Lithography.</a> J. Vac. Sci. Technol. B. 31, 06F407(2013).</li>
<li>Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+EBL+Fabricated+Nanostrucutred+Substrates+for+SERS+Detection+of+Protein+A+in+Aqueous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vac.+Sci.+Technol.B%22%5BJournal%5D)">Application of EBL Fabricated Nanostrucutred Substrates for SERS Detection of Protein A in Aqueous Solution.</a> J. Vac. Sci. Technol.B. 31, (2013).</li>
<li>Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-Enhanced+Raman+Spectroscopy+Detection+of+Protein-Ligand+Binding+Using+D-glucose+and+Glucose+Binding+Protein+on+Nanostructured+Plasmonic+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Protein-Ligand Binding Using D-glucose and Glucose Binding Protein on Nanostructured Plasmonic Substrates.</a> , (2014).</li>
<li>Peters, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Fabrication+and+Testing+of+Surface-Enhanced+Raman+Spectroscopy+Substrates+for+the+Detection+of+Biomolecules+%5BMSc+%5D%22">Fabrication and Testing of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Substrates for the Detection of Biomolecules [MSc Thesis]</a>. , University of Alberta. (2014).</li>
<li>Gouda, H., Torigoe, H., Saito, A., Sato, M., Arata, Y., Shimada, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dmensional+Solution+Structure+of+the+B+Domain+of+Staphylococcal+Protein+A%3A+Comparisons+of+the+Solution+and+Crystal+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Three-Dmensional Solution Structure of the B Domain of Staphylococcal Protein A: Comparisons of the Solution and Crystal Structures.</a> Biochemistry. 31, 9665-9672 (1992).</li>
<li>Cuneo, M. J., Johnson, S. J., Beese, L. S., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Structure+of+E.+Coli+Glucose%2FGalactose+Binding+Protein+Bound+with+Glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Collaboratory+for+Structural+Bioinformatics+%28RCSB%29+Protein+Data+Bank%22%5BJournal%5D)">High Resolution Structure of E. Coli Glucose/Galactose Binding Protein Bound with Glucose.</a> Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank. , (2009).</li>
<li>Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VMD+-+Visual+Molecular+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molec.+Graphics%22%5BJournal%5D)">VMD - Visual Molecular Dynamics.</a> J. Molec. Graphics. 14, 33-38 (1996).</li>
<li>Walsh, R., DeRosa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+Function+in+the+DNA+Homolog+of+the+RNA+Dopamine+Aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">Retention of Function in the DNA Homolog of the RNA Dopamine Aptamer.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 388, 732-735 (2009).</li>
<li>Akitomi, J., Kato, S., Yoshida, Y., Horii, K., Furuich, M., Waga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ValFold%3A+Program+for+the+Aptamer+Truncation+Process%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Inf%22%5BJournal%5D)">ValFold: Program for the Aptamer Truncation Process.</a> Biomed. Inf. 7, 38-40 (2011).</li>
<li>Han, K., Lee, Y., Kim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PseudoViewer%3A+Automatic+Visualization+of+RNA+Pseudoknots%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PseudoViewer: Automatic Visualization of RNA Pseudoknots.</a> Bioinformatics. 18, S321-S327 (2002).</li>
<li>Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+Binding+Proteins%3A+a+Versatile+Superfamily+for+Protein+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic Binding Proteins: a Versatile Superfamily for Protein Engineering.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 495-504 (2004).</li>
<li>Benson, D. E., Conrad, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+Bioelectronic+Interfaces+by+Exploiting+Hinge-Bending+Motions+in+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Design of Bioelectronic Interfaces by Exploiting Hinge-Bending Motions in Proteins.</a> Science. 293, 1641-1644 (2001).</li>
<li>Bozic, S., Chorzempa, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozic%2C+S+%22Pirahna+Cleaning%22">Pirahna Cleaning</a>. , University of Alberta. (2011).</li>
<li>Mohammad, M. A. Raith 150TWO SOP. , University of Alberta. (2011).</li>
<li>Schmidt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Atomic+and+Molecular+Electronic+Structure+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Chem%22%5BJournal%5D)">General Atomic and Molecular Electronic Structure System.</a> J. Comput. Chem. 14, 1347-1363 (1993).</li>
<li>Bode, B. M., Gordon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MacMolPlt%3A+a+Graphical+User+Interface+for+GAMESS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Mol.+Graph.+Mod%22%5BJournal%5D)">MacMolPlt: a Graphical User Interface for GAMESS.</a> J. of Mol. Graph. Mod. 16, 133-138 (1998).</li>
<li>Bright, A., Devi, T. S. R., Gunasekaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopical+Vibrational+Band+Assignment+and+Qualitative+Analysis+of+Biomedical+Compounds+with+Cardiovascular+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Chem.+Tech.+Res%22%5BJournal%5D)">Spectroscopical Vibrational Band Assignment and Qualitative Analysis of Biomedical Compounds with Cardiovascular Activity.</a> Int. J. Chem. Tech. Res. 2, 379-388 (2010).</li>
<li>Bandekar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+Modes+and+Protein+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Amide Modes and Protein Conformation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1120, 123-243 (1992).</li>
<li>Barth, A., Zscherp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+Vibrations+Tell+About+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">What Vibrations Tell About Proteins.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 35, 369-340 (2002).</li>
<li>Chrimes, A. F., Khoshmanesh, K. h, Stoddart, P. R. M. itchellA., Kalantar-Zadeh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+and+Raman+Microscopy%3A+Current+Applications+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microfluidics and Raman Microscopy: Current Applications and Future Challenges.</a> Chem. Soc. Rev. 42, 5880-5906 (2013).</li>
<li>Park, S. -K., Lee, N. -S., Lee, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+Analysis+of+Dopamine+Neutral+Base+based+on+Density+Functional+Force+Field%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.-Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Vibrational Analysis of Dopamine Neutral Base based on Density Functional Force Field.</a> Bull.-Korean Chem. Soc. 21, 959-968 (2000).</li>
<li>Briand, E., Salmain, M., Compère, C., Pradier, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Protein+A+on+SAMs+for+the+elaboration+of+immunosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Coll.+Surf.+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Protein A on SAMs for the elaboration of immunosensors.</a> Coll. Surf. B: Biointerfaces. 53, 215-224 (2006).</li>
<li>Lakowicz, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiative+decay+engineering%3A+2.+Effects+of+Silver+Island+Films+on+Fluorescence+Intensity%2C+Lifetimes%2C+and+Resonance+Energy+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Radiative decay engineering: 2. Effects of Silver Island Films on Fluorescence Intensity, Lifetimes, and Resonance Energy Transfer.</a> Analytical biochemistry. 301, 261-277 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

SERS gagne la reconnaissance comme une technique extrêmement puissante de la bio-détection offrant de nombreux avantages uniques. La relation avec les vibrations moléculaires permet d&#39;identifier des «empreintes» de manière sélective d&#39;analytes spécifiques des spectres de SERS, alors que la très grande sensibilité permet la détection de très faibles quantités de l&#39;analyte 9,10,11,35. En outre, la SERS est une technique non destructive qui est aussi relativement insensible à l&#39;eau, et donc il est très bien adapté pour sonder les matériaux biologiques dans leur environnement naturel 9 aqueuse. Les résultats présentés mettent l&#39;accent sur ces avantages ainsi que montrent encore un fort potentiel de SERS comme une technique très souple sans étiquette de la bio-détection. Dans trois modèles différents utilisant des monocouches de biomolécules de substrat immobilisé, modes Raman ont été détectés qui pourrait être attribuée en toute confiance aux analytes particuliers. Que la détection de ces biomolécules, or leurs ligands respectifs, ont été démontrées en utilisant des surfaces planes de silice fondue comme support de substrats SERS, rend les modèles compatibles avec l&#39;électronique et les réglages actuels microfluidique, promettant de nombreuses applications en relation avec les architectures bio-électroniques d&#39;interfaçage matériaux biologiques avec des surfaces de électronique émergente et des dispositifs électrochimiques 2,3. Fait important, dans deux des trois conceptions de détection SERS a été démontrée pour la liaison spécifique de petites molécules, telles que le glucose et la dopamine, en utilisant des monocouches de la protéine de surface aptamère immobilisé et, respectivement, les éléments de reconnaissance. Cependant, plusieurs aspects doivent être pris en charge dans le but de parvenir à un SERS bio-détection efficace dans le cadre &quot;sur puce&quot;. Tout d&#39;abord, une difficulté bien connue qui est commun à la plupart des biomolécules est leur tendance à se dégrader, en particulier lorsqu&#39;il est exposé à des conditions non naturelles telles que envi secronnement ou de la lumière laser intense. Tout au long du protocole, nous avons souligné l&#39;importance de toujours garder les échantillons bio-fonctionnalisé immergés dans des solutions appropriées au cours de l&#39;ensemble de l&#39;expérience, de la préparation des échantillons à l&#39;acquisition de spectres Raman. Pour ces derniers, une chambre étanche à l&#39;eau sur mesure a été conçu (figure 7) pour éviter l&#39;évaporation du liquide au cours de l&#39;exposition au laser. La durée de l&#39;exposition et l&#39;intensité du laser doit également être limitée comme décrit dans l&#39;étape 5.3 du protocole pour éviter d&#39;endommager les échantillons. Les résultats de la détection de la SERS se trouvent sensible à la géométrie du substrat utilisé, et en particulier la séparation inter-élément des nanostructures métalliques. Comme il résulte des figures 8 et 9, l&#39;intensité de la SERS une conception échantillons dépend fortement de la largeur des espaces entre des Au nano-points sur silice fondue. Sur trois tableaux de Au nanoplots testés in ce motif (figure 8), l&#39;intensité Raman de la plus élevée est obtenue avec tableau I, qui présente les plus étroits espaces entre les éléments Au et il offre donc l&#39;amélioration de champ électromagnétique plus efficace. Comme la figure 9 illustre, le contrôle de l&#39;inter-longs séparations au niveau de 10-20 nm ou moins est nécessaire. Employant EBL pour la fabrication de substrats SERS, comme démontré ici, fournit une résolution efficace spécifiquement pour contrôler les largeurs des inter-longs lacunes. Avec une EBL-ton positif résister tel que le PMMA, la taille des trous dans les masques PMMA peut être modifiée en changeant simplement les doses d&#39;exposition. Après le décollage cela se traduit dans différentes tailles de points métalliques, et la largeur des écarts entre les points peut être réglé comme souhaité en sélectionnant l&#39;exposition EBL appropriée des doses 18. L&#39;autre défi est l&#39;optimisation de la géométrie du substrat SERS pour l&#39;application bio-détection spécifique. Bien que l&#39;effet de l&#39;amélioration increases avec une diminution des écarts inter-longs, la taille relativement importante de molécules biologiques impose des restrictions sur la façon de réduire les écarts peuvent être. Ceci est évident à partir des résultats pour la conception 2, où le procédé d&#39;immobilisation est telle que la protéine se lie de manière efficace seulement à la surface entre les points de métal noble, mais pas pour les points eux-mêmes (voir la figure 3B). Comme il ressort de la figure 10, les spectres de SERS pour les plaquettes Ag non structurées ne montrent pas de bandes de l&#39;analyte. Bien que les plaquettes présentent une structure nano-cristallin très minces écarts inter-îles (voir Figure 6F), ces lacunes sont trop étroites pour accueillir une molécule de protéine. Encore une autre dimension de complexité est ajoutée lorsque la protéine-ligand de liaison doit être détecté. Sur la figure 10, les bandes SERS CH sont plus prononcées dans les spectres de ligand lié GBP que dans le ligand une connexion, ce qui peut se expliquer par hypothèse un changement dans la conformation GBPlors de la liaison du D-glucose 2 7,27, résultant en une structure plus rigide avec une activité accrue Raman. Si l&#39;on compare les deux substrats nanostructurés, la bande de CH de protéine libre ligand est plus forte dans les spectres de SERS obtenue avec le substrat nano-points, tandis que les deux bandes de protéines et le glucose CH de protéine de ligand lié sont plus prononcées avec les nano-hexagones substrat. Deux facteurs devraient se traduire dans ces différences, la disponibilité d&#39;espace entre Ag dispose d&#39;où le GBP pourrait se lier à Ni, et de la sensibilité de la protéine liée à un ligand et le ligand libre à l&#39;amélioration électromagnétique de la diffusion Raman dans &quot;points chauds&quot; entre ces caractéristiques. D&#39;une part, le modèle de nano-points offre une surface relativement plus grande inter-fonction où revêtement Ni est disponible pour la protéine de se lier, ce qui peut expliquer une bande de CH plus prononcée observée pour GBP sans glucose sur Ag nanopoints substrat. D&#39;autre part, en raison de leur struc non uniformeture (voir Figure 6D), Ag nano-hexagones pourrait être enclin à montrer une amélioration électromagnétique forte dans les espaces étroits entre les îles Ag dans des nano-hexagones résultant de fortes bandes de vibration CH à partir du glucose lié GBP sur le substrat nano-hexagones. Certains détails de cette interaction exigent une vérification plus poussée, et l&#39;optimisation des substrats SERS pour analytes complexes impliquant de grandes protéines telles que la livre sterling est encore dans le pipeline. De toute évidence, la détection de la liaison en utilisant la SERS biomolécules immobilisées en tant qu&#39;élément de reconnaissance ligand est facilité lorsque le ligand est seulement actif Raman dans une région sélectionnée, alors que les autres composants ne sont pas. Ce est le cas de la conception 3, où sont obtenus SERS prononcées bandes de dopamine aptamère lié (figure 11). La paire aptamère-dopamine présente une excellente spécificité et le spectre de SERS comprend des bandes marquées sans signal de fond important. <p class="jove_content"&gt; Avance avenir de la technologie de la SERS étiquette taxe impliquerait des tests approfondis de la SERS amélioration du signal de biomolécules avec une large gamme de modèles différents de nanostructures de surface. L&#39;utilisation de écriture directe lithographie par faisceau d&#39;électrons pour fabriquer divers nanostructures avec un superbe niveau de contrôle sur la taille, la forme et inter-fonction séparation, combinée avec les protocoles de préparation des échantillons présentés ici, serait de faciliter la comparaison et la validation croisée des résultats obtenus par différents groupes de recherche. Cela permettrait de répondre au défi majeur de reproductibilité lors SERS substrats sont fabriqués employant alternatif &quot;bottom up&quot; méthodes 11,12,13, permettant un meilleur contrôle de la taille et la position de nanostructure métallique vers une identification fiable de la conception de substrat optimale pour un large éventail de applications. L&#39;évolutivité de ces techniques peut ensuite être améliorée par combinaison avec des méthodes de EBL nanolithographie complémentaires tels que nanolithographie par impression 19 vers le futur la production de masse de conceptions nanométriques optimisé en utilisant les techniques EBL accordables.

Capacités pour développer et caractériser les systèmes de nano-biologiques conjugués interfaçage nanostructures solides et polymères biologiques sont de plus en plus important de nouvelles avancées dans la prochaine génération de bio-détection et de bio-technologies actionnement 1,2. Cela implique des études multidisciplinaires dans un certain nombre de domaines de recherche, tels que la fabrication de composants pertinents à l&#39;état solide (micro ou nano-électrodes, revêtements nano-ingénierie, les nanofils ou nanoparticules) 2,3,4; immobilisation de biomolécules sur les surfaces à créer bioconjugués souhaités 5,6,7; et le suivi des interfaces nano-biologiques 1. Dans la plupart des cas, la sélection de la fabrication optimale, bio-fonctionnalisation, et les méthodes de caractérisation est fortement interdépendants. Il est clair que le choix des techniques de nanofabrication serait entraîné par les exigences des composants à l&#39;état solide du système, étant en grande partie dépendante de la méthode de détection, dans lequel turn est déterminée par la nature des biopolymères qui participent et afin de contrôler l&#39;interface. Sur un large éventail de techniques appliquées pour caractériser les systèmes de bioconjugués 1,3, spectroscopie Raman de surface améliorée (SERS) a émergé comme une méthode très prometteuse pour la détection d&#39;espèces chimiques et biologiques sur des surfaces 8,9,10,11. SERS emploie diffusion inélastique de la lumière monochromatique par les biomolécules à la surface immobilisé (figure 1) permettant la capture de signatures uniques correspondant à des vibrations moléculaires. Cette capacité de faire la distinction entre les différentes molécules étiquettes, sans faire intervenir la chimie complexe, ou des étapes fastidieuses, fait SERS une méthode potentiellement très efficace de la bio-détection. Un autre avantage important de la SERS est sa grande sensibilité. L&#39;excitation de plasmons de surface localisés par la lumière interagissant avec nanostructures de métaux nobles (substrats SERS) augmente considérablement l&#39;intensité de diffusion Raman par l&#39;analyte, ce qui permet la détection de très petites quantités de molécules, de monocouches jusqu&#39;à la limite seule molécule 8,9,10,11. Enfin, la plupart des biomolécules nécessitent des solutions aqueuses stables. Parce que l&#39;eau a souvent l&#39;activité Raman limitée, signal de fond à partir d&#39;échantillons aqueux est minimisé neuf. Applications de la SERS ont affiché une augmentation exponentielle au cours de la dernière décennie 10. Cependant, un défi beaucoup discuté de la SERS est que l&#39;amélioration électromagnétique de diffusion Raman dépend essentiellement de la taille, la forme, et l&#39;espacement des nanostructures métalliques où les ondes plasmoniques sont induites 11,12,13. Pour atteindre SERS efficace et reproductible des mesures, un contrôle sur la géométrie du substrat est nécessaire aux dimensions nanométriques. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig1.jpg" /> Figure 1. Schème de la spectroscopie Raman de surface améliorée. De nombreuses méthodes employées pour fabriquer des substrats SERS 11,12,13 peuvent être grossièrement classés en bottom-up et top-down méthodes. Méthodes du premier type utilisent divers processus d&#39;auto-assemblage ou la synthèse chimique dirigée pour produire des nanostructures. Souvent adressées exemples comprennent l&#39;immobilisation de nanoparticules monodispersées sur des supports solides, 11,12,13 thermique, pulvérisation cathodique ou dépôt électrochimique de films métalliques rugueuses 11,12, et divers procédés de synthèse chimique 13. Bien que ces techniques ont tendance à être relativement simple et peu coûteux, la plupart d&#39;entre eux sont mis au défi par un manque de contrôle sur l&#39;emplacement des structures, et la reproductibilité limitée échantillon à échantillon. En revanche, les techniques de lithographie top-down emploient instruments manipulables tels que des faisceaux de particules pour créer des motifs désirés sur surfaces. L&#39;un des plus fréquemment utiliséméthodes de nanolithographie, la lithographie par faisceau d&#39;électrons (EBL), offre de superbes contrôle sur les caractéristiques en dessous de 10 nm et aussi une flexibilité pour permettre différents modèles de substrat sur ​​des supports solides 11,12. Dans EBL, un faisceau d&#39;électrons concentré jusqu&#39;à un endroit de quelques nanomètres de diamètre dans les analyses sur une surface d&#39;un matériau sensible à électrons (résister) provoquant un changement chimique dans les régions exposées. Pour résiste à ton positif tel que le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), électrons résultats d&#39;exposition de faisceau de scission des chaînes polymères constituant le résist, ce qui conduit à une solubilité accrue dans un solvant approprié (développeur). Procédé de lithographie par faisceau d&#39;électrons comprend de revêtement par centrifugation d&#39;une couche uniforme de résist sur un substrat; l&#39;exposition du matériau de réserve ciblée dans une chambre à vide avec un faisceau d&#39;électrons; et le développement de l&#39;échantillon pour éliminer les zones solubles. Supports diélectriques en dessous de nanostructures métalliques, tels que de la silice fondue, ont been montré une augmentation significative de l&#39;intensité en raison de la localisation SERS d&#39;ondes plasmoniques par rapport à d&#39;autres matériaux tels que le silicium 14,15. Cependant structuration EBL sur des substrats diélectriques, en particulier à l&#39;échelle nanométrique, implique des défis importants en raison de facturer accumulation pendant l&#39;exposition. Précédemment, nous avons montré 16,17 que ces difficultés peuvent être surmontées en plaçant des couches de polymère conducteur au-dessus de la résistance. La figure 2 montre un schéma de l&#39;ensemble du processus de fabrication en utilisant l&#39;exposition et le développement EBL suivie par le dépôt de métal et de décollage pour produire des nanostructures métalliques sur fusionné supports de silice. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig2.jpg" /> Figure 2. Schéma de eLectron lithographie par faisceau, dépôt de métal, et le processus de décollage des étapes utilisées pour fabriquer des nanostructures métalliques sur des substrats diélectriques 16-19. Dans cet article, nous présentons la totalité de la séquence d&#39;étapes de processus impliquant SERS substrats fabrication par EBL, bio-fonctionnalisation des substrats, et la collecte des spectres Raman. Trois modèles explorés dans nos œuvres récentes 18,19 sont abordés (voir figures 3 et 4, et tableau 1). Dans une conception, la protéine recombinante est immobilisée sur une bio-fonctionnalisées Au nanostructures sur une silice fondue (FS) support 18, et la détection de SERS de la protéine est mise en évidence. Dans ce modèle 2, recombinante la protéine de liaison glucose 21,26,27 avec et sans ligand (D-glucose) est immobilisé au moyen d&#39;étiquettes d&#39;histidine dans les espaces entre les nanostructures sur FS Ag Ni-revêtues, et la liaison du glucose à la protéine est détectée. In Design 3, thiolaté dopamine contraignant DNUn aptamère 19,23 est immobilisé sur Au nanostructures sur FS, et la liaison de la dopamine par aptamère immobilisé est démontrée. Inclusive de toutes les étapes expérimentales pertinentes de la préparation du substrat à l&#39;acquisition de spectres Raman, et représentatifs des différentes biomolécules et les stratégies d&#39;immobilisation, ces exemples sont utiles pour une large variété d&#39;applications, de la recherche d&#39;exploration interroger interfaces nano-biologiques par la SERS au développement de la SERS biocapteurs de petites molécules employant protéino ou la liaison comme une méthode de reconnaissance aptamère-ligand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig3.jpg" /> Figure 3. Schémas de trois modèles représentatifs utilisant différentes biomolécules, les méthodes de immobilization, et de substrat matériaux: (A) la protéine A immobilisée sur le métal noble nanopoints fonctionnalisés par une monocouche auto-assemblée (SAM) d&#39;acide 11-mercaptodecanoic (MUA) dans de l&#39;eau DI; (B) la protéine de liaison glucose marqué à l&#39;histidine (GBP) complexé avec du D-glucose immobilisée sur la surface du substrat entre les métaux nobles des nano-points; (C) à terminaison thiol liaison dopamine aptamère complété par la dopamine (DBA) immobilisé sur métal noble nanopoints. Voir plus de détails dans le tableau 1. In Design 2 illustré par panneau (B), un échantillon sans le ligand correspondant a également été préparé pour la comparaison. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig4.jpg" /> Figure 4.Biomolécules utilisées en trois modèles: (A) la protéine A; (B) la protéine de liaison du glucose et du D-glucose; (C) la liaison de l&#39;aptamère ADN dopamine et la dopamine. Les protéines structures tertiaires en (a) et (b) sont tirées de Protein Data Bank, PDB ID 1BDD 20 et 2HPH 21, respectivement, et dessiné avec VMD pour LinuxAMD64, la version 1.9.1 22. La structure secondaire de l&#39;aptamère en (c) est prédit à partir de la séquence 23 en utilisant le logiciel 24 ValFold et dessinée avec PseudoViewer 3,0 25. Les lettres G, A, T, C et correspondent à la guanine, l&#39;adénine, la thymine, la cytosine et les nucléotides, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig4large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="0" fo:keep-together.within-page="always" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Design 1 </td&gt; <td> Design 2 </td><td> Design 3 </td></tr><tr><td> Biopolymère </td><td> La protéine A </td><td> Protéine de liaison glucose (GBP) </td><td> aptamère de liaison de dopamine (DBA) </td></tr><tr><td> Liant </td><td> L&#39;acide 11-mercaptoundécanoïque (MUA) monocouche auto-assemblée (SAM) </td><td> tags histidine </td><td> Linkers thiol </td></tr><tr><td> Ligand </td><td> Aucun </td><td> D-glucose </td><td> Dopamine </td></tr><tr><td> Solution </td><td> Déminéralisée (DI) </td><td> tampon phosphate de potassium </td><td> Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (TRIS) et de l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) tampon; Une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) </td></tr><tr><td> Substrat </td><td> Au structures sur FS </td><td> Structures Ag sur FS revêtement Ni </td><td> Au structures sur FS </td></tr><tr><td> Ar motifsea </td><td> 4 um x 10 um </td><td> 4 um x 8 um </td><td> 4 um x 10 um </td></tr><tr><td rowspan="3"> Motif </td><td rowspan="3"> Au points, 50 nm terrain </td><td> Ag points, 40 nm terrain </td><td> Au hexagones, terrain de 200 nm </td></tr><tr><td> Hexagones Ag, terrain de 200 nm </td><td> Au tampons non structurées </td></tr><tr><td> Ag tampons non structurées </td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"> Doses d&#39;exposition EBL </td><td> Dots: </td><td> Dots: 105 uC / cm 2 </td><td rowspan="4"> Hexagones: 180 uC / cm 2 </td></tr><tr><td> Tableau I 120 uC / cm 2 </td><td> Hexagones: 170 uC / cm 2 </td></tr><tr><td> Tableau II 96 uC / cm 2 </td><td></td></tr><tr><td> Tableau III 72uC / cm 2 </td><td></td></tr><tr><td> Laser onde d&#39;excitation </td><td> 532 nm </td><td> 532 nm </td><td> 780 nm </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Trois projets des systèmes de nano-biologiques.

<table><tbody><tr><td>11-mercaptoundécaneacide (MUA)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>450561&amp;nbsp; ALDRICH</td><td>Utilisé pour la fonctionnalisation de surface dans la conception 1</td></tr><tr><td>Polymère conducteur</td><td><a href="http://www.mrc.co.jp" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Mitsubishi Rayon</a></td><td>aquaSAVE-57xs</td><td>Une couche de 70 nm d'épaisseur est utilisée comme revêtement anti-chargement pour les expositions en lithographie par faisceau d'électrons (EBL)</td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Laboratoire collaborateur</td><td></td><td>Ligand dans la conception 2</td></tr><tr><td>Dopamine</td><td>Laboratoire collaborateur</td><td></td><td>Ligand dans la conception 3</td></tr><tr><td>Aptamère de liaison à la dopamine (DBA)</td><td><a href="http://www.idtdna.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Integrated DNA Technologies Inc.</a></td><td>5'- /Modificateur thiol C6 S-S/&amp;nbsp;AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3'&amp;nbsp;</td><td>Biopolymère en conception 3</td></tr><tr><td>Tranches de silice fondue</td><td><a href="http://www.markoptics.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Mark Optics&lt;br/&gt;</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protéine de liaison au glucose (GBP)</td><td><a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi%7C145579532" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Laboratoire collaborateur</a></td><td>&lt;a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi|145579532"&gt;ID PDB 2HPH&lt;/a&gt;</td><td>Biopolymère en conception 2</td></tr><tr><td>Graisse pour vide élevé</td><td><a href="http://www.dowcorning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Dow Corning</a></td><td></td><td>Utilisé pour sceller une chambre étanche à l'eau</td></tr><tr><td>Peroxyde d'hydrogène 30 %, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td>Utilisé pour la solution de piranha</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-éthyl-&lt;em&gt;N'&lt;/em&gt;-(3-(diméthylamino)propyl)carbodiimide (EDC)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>03450 FLUKA</td><td>Utilisé pour l'immobilisation du biopolymère dans la Conception 1</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>130672 ALDRICH</td><td>Utilisé pour l'immobilisation du biopolymère dans la Conception 1</td></tr><tr><td>Tampon de phosphate de potassium</td><td>Laboratoire collaborateur</td><td></td><td>Tampon utilisé lors de l'échantillonnage Raman</td></tr><tr><td>Tamponné au phosphate&amp;nbsp; soluté physiologique (PBS)</td><td>Laboratoire collaborateur</td><td></td><td>Solvant dans la conception 3</td></tr><tr><td>Polyméthylméthacrylate (PMMA) 950 A2</td><td><a href="http://www.microchem.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> MicroChem&amp;nbsp;</a></td><td></td><td>Une couche de 90 nm d'épaisseur est utilisée comme résine positive pour la lithographie par faisceau d'électrons (EBL)</td></tr><tr><td>Protéine A recombinante</td><td><a href="http://www.proteinmods.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Protein Mods Inc</a></td><td>&lt;a href="http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd"&gt;ID PDB 1BDD&lt;/a&gt;</td><td>Biopolymère dans la conception 1</td></tr><tr><td>Acide sulfurique 96 %, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td>Utilisé pour la solution de piranha</td></tr><tr><td>Tampon Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (TRIS) et acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma Aldrich</a></td><td>T9285 SIGMA</td><td>Tampon dans la conception 3
&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Équipement&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Nom&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Entreprise&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Numéro de catalogue&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Commentaires&lt;/strong&gt;&lt;br /&gt;</td></tr><tr><td>Scie à tronçonner</td><td>Diamond Touch Technology Inc.&lt;br /&gt;(17301 W Colfax Ave #&amp;nbsp;152, Golden, CO</td><td></td><td>Utilisé pour couper la plaquette FS</td></tr><tr><td>Évaporateur par faisceau d'électrons</td><td><a href="http://www.lesker.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Kurt J. Lesker</a></td><td></td><td>Utilisé pour l'évaporation de l'or (Au) et de l'argent (Ag)</td></tr><tr><td>Évaporateur par faisceau d'électrons</td><td><a href="http://www.ultrahivac.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Johnsen Ultravac (JUV)</a></td><td>JuV E-gun</td><td>Utilisé pour l'évaporation du Ni</td></tr><tr><td>Coverslips pour microscope (25 mm)</td><td><a href="http://www.fishersci.ca" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td>12-545-102</td><td>Utilisé dans une chambre étanche à l'eau</td></tr><tr><td>Lames à microscope (3&amp;times;1 po.</td><td><a href="http://www.fishersci.ca" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td></td><td>Utilisé dans une chambre étanche à l'eau</td></tr><tr><td>Raith 150&lt;sup&gt;DEUX&lt;/sup&gt; Système d'exposition à l'EBL</td><td><a href="http://www.raith.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Raith Inc.</a></td><td>Raith 150&lt;sup&gt;DEUX&lt;/sup&gt;&amp;nbsp; système</td><td>Utilisé pour les expositions en lithographie par faisceau d'électrons (EBL)</td></tr><tr><td>microscope Raman</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>Nicolet Almega XR</td><td>Utilisé pour la spectroscopie Raman</td></tr><tr><td>Système sonicateur</td><td><a href="http://www.bransonic.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Branson</a></td><td></td><td>Utilisé pour le décollage et le mélange des solutions</td></tr><tr><td>Spinner</td><td><a href="http://www.brewerscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Bain-marie magnétique chauffant et plaque chauffante</a></td><td>Cee 200X et Cee 1300X</td><td>Utilisé pour le dépôt par centrifugation de PMMA et de polymère conducteur</td></tr></tbody></table>

surface enhanced raman spectroscopy détection de biomolécules utilisation ebl fabrication des substrats nanostructurés

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Fabrication et caractérisation des systèmes de nano-biologiques conjugués interfaçage nanostructures métalliques sur des supports solides avec des biomolécules immobilisées est signalé. La totalité de la séquence d&#39;étapes expérimentales pertinentes est décrite, impliquant la fabrication de substrats nanostructurés en utilisant la lithographie par faisceau d&#39;électrons, l&#39;immobilisation de biomolécules sur les substrats, et leur caractérisation utilisant surface améliorée spectroscopie Raman (SERS). Trois modèles différents de systèmes de nano-biologiques sont employés, y compris la protéine A, la protéine de liaison de glucose, et un ADN aptamère de liaison de la dopamine. Dans les deux derniers cas, la liaison de ligands respectifs, le D-glucose et de la dopamine, est également inclus. Les trois types de biomolécules sont immobilisées sur des substrats nanostructurés par différentes méthodes et les résultats de l&#39;imagerie sont présentés SERS. Les capacités de SERS de détecter les modes de vibration à partir de protéines de surface immobilisé, ainsi que pour capturer l&#39;une protéine-ligandd aptamère-liaison du ligand est démontrée. Les résultats illustrent également l&#39;influence de la géométrie de la surface de nanostructure, stratégie d&#39;immobilisation de biomolécules, l&#39;activité Raman des molécules et la présence ou l&#39;absence de la liaison sur les spectres de SERS acquis ligand.

Collecte spectres Raman de contrôle pour les principales composantes, y compris les protéines libres en solution et des ligands libres en solution ou sous forme de poudre sans l&#39;aide de substrats contenant des métaux, est important pour permettre une comparaison valable, ainsi que pour des fins d&#39;interprétation. La figure 5A présente une Raman typique spectre pour protéine libre A dans l&#39;eau DI sur une lame de verre sans substrats nanostructurés. Deux bandes avec l&#39;intensité Raman plus haut, la bande à 2931 cm -1 et à 1091 cm -1, correspondent à des vibrations impliquant respectivement liaisons CH et CS. D&#39;autres bandes avec une réduction de l&#39;intensité Raman tels que 563 cm -1, 1 450 cm -1, 1 653 cm -1 et 2426 cm -1, peuvent être attribués à une superposition de modes de vibration 18,32,33,34. Spectres Raman de contrôle pour le GPB sans ligand dans une solution tampon avec trois concentrations différentes, 0,3, 0,9 et 1,3 mm, sont présentés dans la figure 5B. Dans t<html> il figure, la bande large autour de 3400 cm -1 correspond au solvant 35, alors que la bande à 2935 cm -1 représente vibrations des liaisons de la protéine CH 32,33. Figure 5C montre la grande longueur d&#39;onde du spectre Raman pour D-glucose dans une solution tampon pour différentes concentrations: 1, 6, 100, 200 et 400 mM. Lorsque la concentration en glucose augmente, les bandes de vibration des liaisons CH surviennent à 2890 cm -1 et 2960 cm -1. Les spectres Raman de contrôle de la dopamine dans la forme cristalline obtenue avec les deux 532 nm et 780 nm longueur d&#39;onde d&#39;excitation sont présentés sur la figure 5D. Une grande partie du spectre Raman provient du noyau benzénique de cintrage et se étend de liaison de la molécule CH 19,36. Certaines des bandes à environ 3000 cm -1 ne sont observés au 532 nm mais pas 780 nm d&#39;onde d&#39;excitation. pload / 52712 / 52712fig5.jpg &quot;/&gt; Figure 5. Contrôle spectre Raman de la protéine A dans de l&#39;eau DI obtenue à 532 nm longueur d&#39;onde d&#39;excitation 18 (A); Les spectres Raman de la protéine de liaison glucose libre au ligand dans une solution tampon obtenue à 532 nm longueur d&#39;onde d&#39;excitation (B); Les spectres Raman de D-glucose dans une solution tampon obtenue à 532 nm longueur d&#39;onde d&#39;excitation (C); et par le spectre de poudre de dopamine obtenue à 532 nm et des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation 780 nm 19 (D). Tous les spectres sont des spectres de Raman normal de solutions (a, b, c) et de poudre (d) sur des lames de verre sans substrats nanostructurés. En (D), l&#39;affectation des régimes de décalage Raman à différentes vibrations moléculaires a été faite en utilisant le système général atomique et électronique moléculaire Structure (GAMESS) 30 et le logiciel MacMolPlt 31 comme détaillé ailleurs 19. Reproduit panneau (a) avec l&#39;autorisation de 18 Americune société à vide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig5large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Pour obtenir les spectres de SERS de biomolécules à la surface immobilisée, des substrats comprenant des nanostructures métalliques sur des supports en verre de silice sont fabriquées de la manière décrite dans les étapes 1-3. La qualité des substrats fabriqués est contrôlée en microscopie électronique à balayage (MEB). Les procédures SEM standard sont décrits ailleurs 16,17,18, 19 et ne figurent pas dans le présent protocole. La figure 6 montre des images MEB représentatifs de Au et Ag nanopoints et nano-structures comme hexagone (panneaux ad), ainsi que non -structured Au et Ag plots (panneaux e et f, respectivement). Les prochaines étapes impliquent l&#39;immobilisation de matériel biologique sur les substrats nanostructurés employant trois modèles figurant au tableau 1, et l&#39;acquisition de leurs spectres de SERS. En o<html> RDONNANCE de maintenir un environnement aqueux pendant l&#39;imagerie Raman, chaque échantillon est placé dans la solution correspondante (voir tableau 1), coiffé d&#39;un couvercle en verre mince et étanche, comme illustré sur la figure 7. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig6.jpg" /> Figure 6. microscope électronique à balayage (MEB) images de dix épais Au et Ag nanostructures de surface nm utilisés comme substrats SERS: (A, B) des tableaux de nanoplots; (C, D) des tableaux de nano-hexagones; (E, F) tampons non structurées. Substrats avec l&#39;UA structures (à gauche) emploient des supports de FS, alors que les substrats avec des structures AG (droite) utilisent un revêtement Ni 10 nm d&#39;épaisseur sur la FS. Les images ont été obtenues comme décrit ailleurs 16,17,18.pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig7.jpg" /> Figure 7. Schéma de la chambre étanche à l&#39;eau pour l&#39;imagerie Raman d&#39;échantillons bio-fonctionnalisé en solution. Dans une conception, une protéine recombinante est immobilisée sur des substrats fonctionnalisés par une monocouche auto-assemblée de l&#39;acide 11-mercaptodecanoic (MUA) dans de l&#39;eau DI 18. Les substrats dans cette conception comprennent trois ensembles de points Au avec un pas de 50 nm et des distances variables entre points sur silice fondue (voir les figures 6A et 8). Le procédé de l&#39;immobilisation des protéines commence par la formation d&#39;une SAM sur les substrats. Pour obtenir la liaison entre la SAM et la protéine covalente, des groupes acide carboxylique de SAM sont transformés en amine réactif NHS-ester par traitement avec un mélange de N </em&gt; -éthyl- N &#39;- (3- (diméthylamino) propyl) carbodiimide (EDC) et la solution N-hydroxysuccinimide (NHS) solution dans l&#39;eau DI. L&#39;immobilisation de la protéine A se effectue par déplacement du groupe NHS par des résidus lysine de la protéine 37. Un exemple d&#39;échantillons d&#39;imagerie pour la conception 1 avec la protéine A immobilisée sur Au nanostructures est illustré à la figure 9. Figure 9A présente une image de microscope optique des échantillons, qui comprennent trois réseaux de bio-fonctionnalisé Au nanoplots avec différents écarts entre points (voir Les figures 8 et également 3Aa), et la figure 9B montre la cartographie spectrale Raman sur ces tableaux. On peut voir que les intensités Raman plus élevés se trouvent Array I dans laquelle les écarts entre points sont les plus étroite, tandis que des intensités plus faibles sont obtenues pour tableau III avec les plus grands écarts entre les points. Ceci peut se expliquer par un effet de couplage plasmonique fort produit par FIE électrique supérieurelds dans les espaces étroits entre les points 18. La figure 9C montre les spectres de SERS forte obtenue pour des tableaux I et II. Les spectres présentent plusieurs bandes (1630 cm -1, 1964 cm -1, 2280 cm -1, 2577 cm -1 et 2916 cm -1) à proximité des modes Raman de protéine libre dans une solution vu sur la figure 5A. Attribuable aux vibrations de diverses obligations trouvés dans les protéines, ces bandes soit apparaissent à des endroits similaires dans les deux protéine immobilisée et en solution, ou sont légèrement décalé vers nombres d&#39;onde un peu plus élevés lorsque immobilisé. En revanche, les spectres SERS de substrats nanostructurés similaires fonctionnalisé par MUA SAM sans la protéine montrer un modèle entièrement différent 18, confirmant que la figure 9 représente la cartographie de la SERS de la surface immobilisée la protéine A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig7large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une</a><html> plus grande version de ce chiffre. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig8.jpg" /> Figure 8. images SEM de trois tableaux de Au nanoplots sur substrat de FS utilisés dans Design 1 18. Les tableaux ont la même hauteur de 50 nm et légèrement différents rayons de points résultant en différentes largeurs de lacunes entre points. Ce résultat est obtenu en appliquant différentes doses d&#39;exposition EBL pour produire des masques PMMA pour les trois tableaux (voir le tableau 1). Doses d&#39;exposition plus élevées produisent dans des trous plus larges dans les masques PMMA, permettant de plus grandes tailles de points Au après métallisation et le décollage. Reproduit avec la permission de 18 American Vacuum Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig8large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> les / ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg &quot;/&gt; Figure 9. SERS imagerie du substrat-protéine A immobilisée en Design 1 18. (A) Image en microscopie optique de l&#39;échantillon, comprenant trois tableaux de Au nanoplots avec pas de 50 nm et différents écarts entre points sur un substrat de silice fondue (voir aussi la figure 6), la bio-fonctionnalisées comme le montre la figure 3A. (B) Raman cartographie de l&#39;échantillon. (C) SERS spectres du tableau points I et II. Dans le panneau (B), l&#39;axe vertical représente la distance à travers le substrat, l&#39;axe horizontal représente le décalage Raman, et la barre de légende indique les intensités Raman. Vertical lignes pointillées dans les panneaux (B) et (C) représentent bandes de Raman de référence de protéine libre A en solution et (*) dans le panneau (C) indique bandes de SERS de tableau I. Les spectres Raman ont été obtenus 532 nm excitationlongueur d&#39;onde. Reproduit avec la permission de 18 American Vacuum Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig9large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Dans ce modèle 2, la protéine recombinante de liaison au glucose (GBP) 21 complexé avec du D-glucose (ligand) est immobilisé sur les substrats appropriés dans une solution de tampon de phosphate de potassium. Les échantillons ayant immobilisé GBP ligand libre-sont également préparés pour la comparaison. Dans cette conception, la protéine de liaison glucose-est attaché à la surface au moyen d&#39;une étiquette d&#39;histidine, qui se lie bien à Ni mais pas de métaux nobles 6. Depuis les substrats comprennent des réseaux de Ag nano-points, nano-hexagones, et plaquettes de Ag non structurées sur les FS Ni-enduits (figures 6B, 6D et 6F, respectivement), on peut se attendre plus de molécules de protéine immobilisée à être situées dans les écarts entre Ag nanostructures où revêtement Ni est available. Les spectres Raman obtenu pour immobilisée sans glucose et le glucose lié GBP sont présentés dans les figures 10A et 10B, respectivement. Tous ces spectres présentent une large bande à environ 3300 cm -1, ce qui correspond à la 35 solution tampon. Les spectres obtenus avec un tampon Ag non structurées ne contiennent que cette bande unique et ne montre pas de modes de vibration de la protéine, ce qui confirme que la protéine immobilisée est introuvable sur la surface Ag comme prévu. En revanche, le spectre obtenu avec des matrices de Ag nanopoints et les bandes présentent des nano-hexagones autour de 1550 cm -1 et 2900 cm -1, qui représentent l&#39;analyte 32,33. En particulier, le large bande autour de 1550 cm -1, dite bande amide II, est attribuable aux liaisons peptidiques dans des protéines 33,34 vibrations. Dans le cas considéré, ce groupe représente une superposition des modes de vibration à partir de GBP immobilisés sur la surface Ni entre fonctionnalité Ags, et est indicatif de la SERS amélioration de ces modes dans les environs de nanostructures de métaux nobles lorsque les substrats contenant des nano-points ou des nano-hexagones sont utilisés. Cette bande est très faible pour la protéine en solution en l&#39;absence d&#39;amélioration SERS (Figure 5B) et absentes sur des plots sans Ag Ni surface disponible pour la liaison aux protéines, mais il est bien prononcé pour certains substrats nanostructurés avec Ni surface accessibles pour la protéine à lier. Cependant, encore plus important pour la présente étude sont les autres, des bandes étroites autour d&#39;environ 2900 cm -1 qui peuvent être attribués à la liaison CH wibrations 32,33. Le spectre de GBP exempt de glucose présente une bande marquée à 2933 cm -1 avec le substrat nano-points, et une bande faible mais discernable à une longueur d&#39;onde comparable avec le substrat nano-hexagones (Figure 10A). Distinct de l&#39;affaire de la protéine sans glucose, les spectres de SERS de glucose lié GBP indiqué dans Figu<html> re 10B présentent deux bandes correspondant à CH obligations vibrations régimes, à 2850 cm -1 et 2910 cm -1. Les bandes sont bien prononcés dans le spectre de glucose lié GBP substrat nano-hexagones, et ils peuvent également être vu dans le spectre de GBP sur substrat nanopoints. La bande à 2850 cm -1 est raisonnablement proche des 2890 cm -1 une dans le spectre Raman de contrôle de D-glucose dans la solution, et par conséquent il peut être attribué à glucose lié à la protéine, tandis que l&#39;autre bande (à 2910 cm -1) est attribuable à des vibrations de liaison CH de fois la protéine et du glucose. On peut conclure que la différence de signatures SERS partir sans glucose et le glucose lié substrat immobilisé GBP est observable dans cette région, et les vibrations de liaison CH de glucose lié à une protéine sont détectables en utilisant la conception décrite. 10.jpg &quot;/&gt; Figure 10. SERS spectres de (A) sans ligand et le ligand lié (B) protéines de glucose liaison immobilisé sur trois substrats différents en design 2. Les spectres ont été obtenus avec 780 nm d&#39;onde d&#39;excitation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig10large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> Dans ce modèle 3, l&#39;aptamère de liaison de la dopamine personnalisé (DBA) à terminaison thiol 23 est immobilisé sur le substrat en tris (hydroxyméthyl) aminométhane (TRIS) de l&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de la solution tampon, et la dopamine est alors lié à l&#39;aptamère immobilisé 19. Les substrats pour cette conception contiennent des tableaux de Au nano-hexagones sur FS (Figure 6C). Au tampons non structurées (Figure 6E) sont également utilisés à des fins de contrôle. Comme l&#39;ADN est intrinsèquement fluorescente 38, 780 nm excitation waveleng<html> e est utilisé dans la conception 3 pour réduire ce facteur. Dans cette conception, l&#39;élément de reconnaissance (aptamère) ne est pas actif Raman dans la région de décalages Raman pris en compte dans la figure 11, alors que la dopamine montre une activité Raman significative dans cette région. Etant donné que le signal à partir d&#39;échantillons exposés à seulement dopamine sans aptamère immobilisé montre aucune bande de la dopamine résultantes 19, les bandes de SERS observés sont censés provenir de la dopamine aptamère lié. La figure 11 compare les spectres de SERS de l&#39;aptamère immobilisé sur nanostructures d&#39;or avant et après l&#39;addition de la dopamine. Comme prévu, immobilisé aptamère gratuitement dopamine ne présente pas de bandes Raman. En revanche, un certain nombre de bandes Raman prononcées sont observées pour les récepteurs dopaminergiques lié aptamère immobilisé. Les positions de la plupart des bandes de la Figure 11 sont proches de ceux de la dopamine cristalline, mais avec des différences dans les amplitudes. igure 11 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg &quot;/&gt; Figure 11. SERS spectres de ligand libre (ligne violette) et lié à un ligand (ligne bleue) dopamine contraignant aptamère immobilisé sur Au substrats nano-hexagonaux en design 3 19. La ligne rouge montre un spectre de poudre de dopamine contrôle de la SERS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig11large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Nous décrivons la fabrication et la caractérisation de systèmes nano-biologiques intercalant des substrats nanostructurés avec des protéines immobilisées et des aptamères. Les étapes expérimentales pertinentes impliquant la fabrication lithographique de substrats nanostructurés, la biofonctionnalisation et la caractérisation par spectroscopie Raman améliorée de surface (SERS) sont rapportées. La détection SERS des protéines immobilisées en surface, et le sondage de la liaison protéine-ligand et aptamère-ligand sont démontrés.

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Détection de biomolécules Utilisation EBL fabrication des substrats nanostructurés

Fabrication and characterization of conjugate nano-biological systems interfacing metallic nanostructures on solid supports with immobilized biomolecules ...

L’objectif général de l’expérience suivante est de fabriquer et de caractériser des systèmes nanobiologiques conjugués interagissant avec des biomolécules solides nanostructurées. Ceci est réalisé en utilisant la lithographie par faisceau d’électrons à ultra haute résolution ou EBL pour obtenir des réseaux de minuscules nanostructures métalliques sur des supports en silice fondue. Dans un deuxième temps, les substrats sont mis en solution et les biomolécules sont immobilisées à leur surface, produisant les interfaces nanobiologiques.Ensuite, la spectroscopie de ramen améliorée de surface ou SIRS est utilisée afin de sonder les molécules biologiques aux interfaces. Les spectres sir qui en résultent présentent les caractéristiques du mode ramen des molécules particulières, avec des intensités fortement dépendantes de la conception du substrat. Le principal avantage de notre approche par rapport aux techniques existantes comme la spectroscopie infrarouge est que la sensibilité peut être considérablement améliorée en raison du plasma de surface et de la résonance au sein des nanostructures métalliques.Notre approche crée des surfaces hautement sélectives qui peuvent être facilement contrôlées en utilisant la combinaison de la fonctionnalisation moléculaire et de la lithographie par faisceau d’électrons. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans de multiples domaines, de l’exploration, de la recherche en biologie structurale ou du service mobilisé par les polymères au développement de divers dispositifs impliquant des interfaces nanobiologiques. Ces méthodes peuvent fournir en science des propriétés structurelles des biomolécules avec des implications allant au diagnostic médical ou à la détection environnementale.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode peuvent avoir des difficultés car elle implique des aspects de la nanofabrication, de la fonctionnalisation de surface, de la biochimie et de la spectroscopie, qui n’ont traditionnellement pas été liés à la fabrication de polyméthacrylate de méthyle ou PMMA, de la réserve et des couches conductrices sur les substrats. Pour ce faire, utilisez une toupie à gaufrettes avec un mandrin à vide et placez les échantillons individuellement au centre du mandrin. Placez une goutte de résine PMMA au centre des échantillons à l’aide d’une pipette en verre.Ensuite, tournez à 3 500 tr/min pendant 60 secondes avec un temps d’accélération de deux secondes. Ensuite, faites cuire les substrats à 180 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes après la cuisson des substrats, refroidissez les échantillons à température ambiante avec les substrats refroidis et retournez-les dans le mandrin tournant. Étalez une goutte de polymère conducteur sur le substrat.Faites tourner le substrat pendant 40 secondes à 3000 tr/min avec une rampe de deux secondes après l’essorage. Faites cuire les échantillons à 80 degrés Celsius pendant une minute après avoir effectué la lithographie par faisceau d’électrons ou l’exposition EBL comme décrit dans le protocole de texte, préparez un bécher avec l’eau ionisée pour retirer le polymère conducteur. Préparez ensuite un deuxième bécher avec un mélange de révélateur et remuez pendant cinq minutes, réglez la température ambiante.Enfin, préparez l’isopropanol dans un troisième bécher comme agent de rinçage à l’aide d’une pince à épiler. Placez les échantillons dans l’eau pendant trois secondes pour retirer le film polymère conducteur. Ensuite, placez l’échantillon dans le révélateur et déplacez lentement la pince à épiler de haut en bas pendant 20 secondes, transférez immédiatement les substrats sur l’isopropanol et rincez pendant 10 secondes de plus avant de sécher l’échantillon avec de l’azote, chargez les échantillons à l’envers dans le système d’évaporation à faisceau d’électrons pour permettre au métal évaporé de se déposer sur la face avant des échantillons.Déposez une couche d’or de 10 nanomètres d’épaisseur sur les échantillons pour les dessins un et trois et une couche d’argent de 10 nanomètres d’épaisseur pour le dessin. Deux à une vitesse d’environ 0,1 nanomètre par seconde. Remplissez ensuite un système de sonication à la hauteur recommandée avec de l’eau et remplissez un bécher séparé avec de l’acétone.Placez un échantillon face vers le haut au fond du bécher et laissez tremper l’échantillon pendant 10 minutes en tenant le bécher. Placez-le dans le bain-marie et laissez la hauteur de l’acétone correspondre à la hauteur de l’eau. Allumez ensuite le système de sonication.Laissez la sonication se produire jusqu’à 60 secondes. Préparez d’abord une solution millimolaire de MUA et d’éthanol à température ambiante et sonicate pendant 10 minutes. Immergez le substrat nanostructuré approprié dans la solution de MUA pendant 48 heures.Ensuite, rincez l’échantillon à l’éthanol trois fois et séchez-le pendant cinq minutes. Réglez la température ambiante. Ensuite, préparez une solution de 75 millimolaires d’EDC et d’eau distillée.Préparez également une solution de 15 millimolaires de NHS dans de l’eau distillée à l’aide d’un dépôt de micro-pipette, 100 microlitres de NHS sur l’or sur le substrat, et ajoutez immédiatement 100 microlitres d’EDC sur la même surface. Incuber pendant une minute pour activer la monocouche auto-assemblée de MUA. Placez ensuite une goutte de 100 microlitres de protéines, une solution sur la même surface du substrat.Placez l’échantillon dans un compartiment d’une boîte de Pétri avec un millilitre d’eau distillée dans un autre compartiment. Fermez la boîte de Pétri avec un couvercle et conservez l’échantillon pendant 24 heures à cinq degrés Celsius. Ensuite, rincez l’échantillon à l’eau distillée trois fois en continuant les échantillons dans des béchers séparés pendant 20 secondes dans chaque bécher, ne laissez pas les échantillons sécher après le rinçage ou pendant le rinçage pour la conception deux échantillons.Préparez une solution de 0,9 millimolaire de protéine de liaison au glucose ou GBP dans un tampon de phosphate de potassium. Préparez également une solution de 100 millimolaires de glucose DG dans le tampon. Mélangez ensuite 30 microlitres de la solution de glucose D et 30 microlitres de la solution GBP.À l’aide d’un récipient en microtube en plastique d’un millilitre et d’une micropipette, incubez pendant 30 minutes, puis déposez 20 microlitres de la solution GBP sans ligand et 20 microlitres de la solution GBP liée au ligand sur les substrats préparés. À l’aide d’une micro-pipette, conservez les échantillons à cinq degrés Celsius pendant 24 heures dans une boîte de Pétri avec un couvercle scellé. Rincer les échantillons trois fois dans la solution tampon de phosphate de potassium à température ambiante pour préparer.Concevez trois échantillons : diluez la solution d’apre de liaison à la dopamine ou de DBA à une concentration d’une micromolaire. À l’aide du tampon tris EDTA avec un pH final de 7,4, préparez une solution de dopamine à une concentration de cinq micromolaires en mesurant la poudre de dopamine sur une balance analytique et en la mélangeant dans la solution saline tamponnée au phosphate ou PBS avec un mélange pendant cinq minutes. Déposez ensuite une goutte de 20 microlitres de la solution DBA à la surface de chaque substrat et laissez reposer l’échantillon pendant une heure à température ambiante avec un couvercle sur la boîte de Pétri.Après avoir rincé les échantillons trois fois dans un tampon de phosphate de potassium, placez les échantillons à la verticale sur une lingette de qualité salle blanche pour sécher l’arrière tout en maintenant un film sur la face avant du substrat. Mettez un échantillon de côté comme contrôle. Ensuite, placez une goutte de cinq microlitres de la solution de dopamine sur la surface du PBS existant.Déposez les échantillons restants. Incuber les échantillons pendant 10 minutes avant de les rincer trois fois dans la solution tampon de phosphate de potassium. Pour effectuer la spectroscopie de ramen.Placez chaque échantillon dans une chambre étanche pour éviter l’évaporation par exposition au laser. Remplissez une seringue en plastique avec de la graisse sous vide poussé chimiquement inerte. Placez ensuite les échantillons sur des lames de verre et versez quelques millimètres de graisse autour des échantillons sans toucher les échantillons.Placez une lamelle de protection de microscope sur les substrats. Appuyez doucement pour former un joint, créant une fine interface liquide entre les substrats et les lamelles sans permettre au tampon d’entrer en contact avec la graisse sous vide. À l’aide d’un système de microscope optique Raman, obtenez une mise au point sur la surface de la région du motif nanométrique métallique à échantillonner sans allumer le laser.Effectuez l’échantillonnage Raman comme décrit dans le protocole textuel illustré. Voici les réseaux de points nano de nickel doré et argenté sur silice fondue. L’utilisation de la lithographie par faisceau d’électrons ou EBL permet une position et une dimension superbes.La taille du point de contrôle et la largeur de l’espace sont contrôlées par l’exposition EBL. Des rangées hexagonales de dose d’or et de nickel argenté sont affichées ici. Le comportement de nucléation de ces couches métalliques très minces entraîne des structures discontinues.Voici le spectre en série de la protéine A immobilisée dans le substrat : dans la conception, l’intensité du signal du premier réseau est beaucoup plus forte que celle du deuxième réseau. Le signal du réseau trois était très faible. L’espacement des espaces est clairement un paramètre critique pour le découplage du plasma et l’amélioration de la surface de la diffusion des ramen.Voici les spectres de la protéine de liaison au glucose montrant les effets de différents modèles de substrat à l’état sans ligand et lié au ligand. Enfin, les spectres s de l’aptamère de liaison à la dopamine sont montrés pour les molécules sans ligand et liées aux ligands. Un spectre de poudre de dopamine est montré à titre de référence.Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’éviter la contamination des substrats. Comme une technique de spectroscopie est très sensible et vous pouvez avoir de fausses lectures en utilisant cette procédure. Des conceptions optimales de substrat source peuvent être identifiées pour des analytes spécifiques.Ensuite, d’autres méthodes nphy comme la phy non imprimable peuvent être effectuées pour améliorer l’évolutivité de la fabrication du substrat après son développement. Cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la biochimie et de la biodétection de détecter des molécules biologiques sans certaines surfaces en très petites quantités tout en restant en solution. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon de contrôler la taille des nanostructures métalliques et les propriétés du film à l’aide de techniques de fabrication et d’exploiter différentes stratégies de reconnaissance biomoléculaire pour cibler différents analytes.

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