Name: Lutilisation de lessai de formation souple Agar colonie à identifier des inhibiteurs de Tumorigénicité dans les cellules cancéreuses du sein (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Découvrez l'essai de formation de colonies en gélose molle pour évaluer la tumorigénicité des cellules cancéreuses du sein. Cette méthode quantifie l'effet de l'inhibiteur BB-Cl-amidine sur la prolifération cellulaire.

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Nous sommes reconnaissants au Dr Richard Cerione, au Dr Marc Antonyak et à Kelly Sullivan, de l’Université Cornell, de nous avoir fourni des conseils techniques, ainsi qu’à la Dre Gerlinde Van de Walle, de l’Université Cornell, qui nous a fait part de leur microscope inversé Olympus CKX41.

1. Préparation de 3% de 2-hydroxyéthyle Agarose <ol><li> Dans un endroit propre, sec 100 ml bouteille en verre, ajouter 0,9 g de 2-hydroxyethyl agarose (Agarose VII), suivie par 30 ml d&#39;eau distillée. </li><li> Micro-ondes le mélange pendant 15 secondes et agiter doucement. Répétez cette étape au moins trois fois jusqu&#39;à ce que la poudre d&#39;agarose dissout complètement. </li><li> Autoclaver la bouteille contenant la solution pendant 15 min-. </li><li> Laisser la solution d&#39;agarose à refroidir à température ambiante avant une nouvelle utilisation. Conserver la solution à la température ambiante. </li></ol> 2. Préparation de la couche inférieure: 0,6% gel d&#39;agarose <ol><li> Pré-réchauffer plusieurs 5 ml et 10 ml de pipettes dans un incubateur à 37 ° C pour empêcher la solidification de l&#39;agarose dans la pipette lors de la manipulation. </li><li> Desserrer partiellement le couvercle de la bouteille et micro-ondes la solution d&#39;agarose à pré-mesure de 3% de 2-hydroxyéthyle pendant 15 s. Ensuite, mélanger doucement la solution et micro-ondes pendant 15 secondes. ATTENTION: Soyez prudent lorsque vous tourner le agarosolution soi parce que la solution se lève lorsqu&#39;il est exposé à l&#39;air et peut déborder. </li><li> Si il ya gel solide résiduel dans la bouteille, micro-ondes quelques secondes de plus. </li><li> Gardez la bouteille contenant la solution d&#39;agarose dans un bain d&#39;eau à 45 ° au cours des prochaines étapes pour empêcher la solution d&#39;agarose de se solidifier prématurément. </li><li> Médias MCF10DCIS chaud dans un bain d&#39;eau à 37 C ° de. Remarque: MCF10DCIS support est constitué de DMEM / F12, de sérum de cheval à 5%, 5% de pénicilline streptomycine. </li><li> Transfert 3 ml de la solution d&#39;agarose à 3% en utilisant les pipettes préchauffées dans un tube conique de 50 ml stérile. </li><li> Immédiatement ajouter 12 ml de milieu de MCF10DCIS chaudes et inverser doucement le tube conique de mélanger l&#39;agarose avec les médias. Essayez de ne pas former des bulles comme il va interférer avec la colonie comptant plus tard. </li><li> Ajouter doucement 2 ml de ce mélange dans chaque puits d&#39;une plaque de culture à 6 puits sans former de bulles d&#39;air. </li><li> Incuber le 6 puits plaque de culture horizontally sur une surface plane à 4 ° C pendant 1 heure pour permettre au mélange de se solidifier. </li><li> Après le mélange se solidifie, placer la plaque dans un incubateur à 37 ° de 30 min. La couche inférieure est maintenant prêt à l&#39;emploi. </li></ol> 3. Préparation de la couche contenant des cellules: 0,3% gel d&#39;agarose <ol><li> Trypsiniser les cellules MCF10DCIS et les diluer à une concentration cellulaire de 4 x 10 4 / ml. </li><li> Prendre 2 ml de l&#39;agarose à 3% en utilisant des pipettes préchauffées et transférer dans un tube conique de 50 ml stérile. </li><li> Immédiatement ajouter 8 ml de MCF10DCIS médias pour le tube conique et inverser doucement pour mélanger l&#39;agarose avec les médias. Éviter la formation de bulles. </li><li> Prendre 2 ml de cellules MCF10DCIS (4 x 10 4 / ml) et traiter avec BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 um). </li><li> Dans une dilution 1: 1, le mélange des cellules avec le 0,6% d&#39;agarose. </li><li> Prélever 1 ml du mélange de cellules-agarose et ajouter doucement sur la couche inférieure de la culture à 6 puits pfin (2 x 10 4 cellules / ml). </li><li> Placer la plaque de culture à 6 puits à l&#39;horizontale sur une surface plane à 4 ° C pendant au moins 15 minutes pour permettre à la couche de recouvrement se solidifier. </li><li> Après le mélange se solidifie, placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant de une semaine avant d&#39;ajouter la couche d&#39;alimentation. </li></ol> 4. Préparation de la couche d&#39;alimentation: 0,3% Agarose Gel <ol><li> Micro-ondes de la solution d&#39;agarose préfabriqué 3% de 2-hydroxyéthyle pendant 15 s. agiter doucement la solution et micro-ondes pendant 15 secondes. </li><li> Equilibrer la bouteille de solution de gélose dans un bain d&#39;eau à 45 ° C. </li><li> Réchauffez les médias MCF10DCIS dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Mélanger 1 ml de solution d&#39;agarose à 3% avec 9 ml de milieu de MCF10DCIS chaud dans un tube conique de 50 ml et inverser doucement pour mélanger l&#39;agarose avec les médias. Éviter la formation de bulles d&#39;air. </li><li> On traite le mélange avec BB-CLA (0 uM (DMSO) ou 1 pM). </li><li> Ajouter délicatement 1 ml de ce mélange (sans pourming bulles) dans chaque puits de la plaque de culture de 6 puits contenant le fond et couches molles. </li><li> Placer la plaque de culture à 6 puits à l&#39;horizontale sur une surface plane à 4 ° C pendant au moins 15 minutes pour permettre au mélange de se solidifier. </li><li> Après la couche d&#39;alimentation se solidifie, placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C. </li><li> Répétez cette procédure hebdomadaire alimentation en superposant 1 ml de solution d&#39;agarose / moyen / traitement de 0,3% sur la couche d&#39;alimentation existante pour reconstituer les cellules avec les nouveaux médias jusqu&#39;à ce que la formation de colonies est observée. Remarque: Agar dans les couches molles et d&#39;alimentation est très doux et, par conséquent, les éléments nutritifs ajoutés à partir de la couche d&#39;alimentation seront facilement diffuser dans la couche contenant des cellules d&#39;atteindre les cellules. </li></ol> 5. Collecte de données <ol><li> Au bout de 2,5 semaines de croissance cellulaire dans la gélose molle, compter le nombre de colonies dans chaque puits en utilisant un microscope optique. Pour faciliter la quantification, imprimer une grille sur une transparence et fixer la grille pour laPlaque de 6 puits pour aider à localiser où les cellules sont en cours de comptage. Étant donné que la taille des colonies (telle que quantifiée par le diamètre de chaque colonie) varie prédéfinir une taille de colonie de référence pour déterminer les colonies qui sera reçu. Par exemple, inclure la taille des colonies de 70 um ou plus dans l&#39;analyse de données. </li><li> Stocker les échantillons à 4 ° C pour empêcher la formation de colonies pour le comptage et futur. Sceller le 6 puits plaque de culture avec du Parafilm pour éviter les gels de se dessécher. </li></ol>

<ol><li>Hamburger, A. W., Salmon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+bioassay+of+human+tumor+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primary bioassay of human tumor stem cells.</a> Science. 197, 461-463 (1977).</li>
<li>Wang, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signaling+regulating+anchorage-independent+growth+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mt+Sinai+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells.</a> Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).</li>
<li>Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD%2C+a+growing+family+of+citrullinating+enzymes%3A+genes%2C+features+and+involvement+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease.</a> Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).</li>
<li>Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+peptidylarginine+deiminase+enzymes+in+disease+and+female+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction.</a> J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).</li>
<li>Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+peptidylarginine+deiminase+enzymes+and+protein+citrullination+in+cancer+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis.</a> Biochem Res Int. , 895343(2012).</li>
<li>McElwee, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PADI2+as+a+potential+breast+cancer+biomarker+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target.</a> BMC Cancer. 12, 500(2012).</li>
<li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidylarginine+deiminase+inhibition+disrupts+NET+formation+and+protects+against+kidney%2C+skin+and+vascular+disease+in+lupus-prone+MRL%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice.</a> Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).</li>
<li>Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF10DCIS.com+xenograft+model+of+human+comedo+ductal+carcinoma+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ.</a> J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).</li>
<li>Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+evaluation+of+human+tumor+chemosensitivity+in+the+soft-agar+assay+and+its+clinical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).</li>
<li>Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+human+tumor+colony+growth+in+soft+agar+by+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+Cloning%22%5BJournal%5D)">Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum.</a> Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).</li>
<li>Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+soft+agar+assay+for+identification+of+anticancer+compound%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound.</a> J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le taux de formation de colonies dans de l&#39;agar mou varie en fonction du type de cellule 9. Par conséquent, le nombre de cellules pour commencer devrait être optimisé et ajusté en conséquence. Une gamme départ suggéré est entre 5 x 10 2 à 1 x 10 4 cellules par puits en utilisant une plaque de 6 puits. En outre, la taille des colonies varie en fonction du taux de croissance de chaque cellule. Par conséquent, un prédéfini une coupure pour la taille des colonies est nécessaire pour anno...

Les cellules non transformées (normales) et transformées peuvent facilement proliférer dans une culture monocouche 2D. Cette forme de croissance cellulaire adhérente est très différente de celle qui se produit in vivo où, en l’absence de stimulation mitogénique, les cellules ne se divisent pas souvent rapidement au sein de leur microenvironnement. Le test de gélose molle, quant à lui, se distingue des systèmes de culture 2D car il quantifie la tumorigénicité en mesurant la capacité d’une cellule à proliférer et à former des colonies en suspension dans un gel d’agarose semi-solide1. Dans ce contexte, les cellules non transformées sont incapables de se propager rapidement en l’absence d’ancrage à la matrice extracellulaire (MEC) et subissent une apoptose, un processus connu sous le nom d’anoïkis. En revanche, les cellules qui ont subi une transformation maligne perdent leur dépendance à l’ancrage en raison de l’activation de voies de signalisation telles que la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt et Rac/Cdc42/PAK. Par conséquent, ces cellules sont capables de croître et de former des colonies dans la matrice de gélose molle semi-solide2.
Une utilisation courante du test de gélose molle est de tester si des composés spécifiques, tels que les inhibiteurs de PADI, sont capables de supprimer la croissance tumorale in vitro. En général, le nombre de colonies ou la taille des colonies sont des lectures quantitatives de l’essai qui peuvent être comparées entre les groupes témoins et les groupes de traitement pour évaluer les différences de tumorigénicité cellulaire. Par conséquent, si l’on constate que la formation de colonies est inversement corrélée à l’augmentation de la concentration du médicament, on pourrait alors conclure que le médicament est un inhibiteur efficace de la tumorigénicité in vitro. D’autre part, si le médicament n’affecte pas la formation des colonies, soit il n’est pas à la dose appropriée, soit il n’est pas un inhibiteur tumorigène efficace. En plus d’utiliser un test de gélose douce pour tester l’effet antitumoral d’un médicament, ce test peut également être utilisé pour sonder la relation entre un gène spécifique et la tumorigenèse. Par exemple, l’effet de la suppression de l’expression de PADI2 sur la tumorigénicité peut être traité par un traitement par siRNA spécifique de PADI2.
Les PADI sont des enzymes dépendantes du calcium qui modifient post-traductionnellement les protéines en convertissant les résidus d’arginine chargés positivement en citrulline chargée neutre dans un processus connu sous le nom de citrullination ou déimination3-5. Nous avons récemment découvert que la peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) peut fonctionner comme un nouveau biomarqueur du cancer du sein et que les inhibiteurs de PADI représentent des thérapies candidates pour les cancers du sein à un stade précoce6. Par exemple, nous avons précédemment démontré qu’un inhibiteur « pan-PADI », la Cl-amidine, supprime la prolifération des cellules cancéreuses du sein à l’aide de monocouches 2D et que l’inhibiteur supprime la croissance des sphéroïdes tumoraux 3D6. Dans ce rapport, nous étendons ces études et soulignons l’utilité du test de la gélose molle, en testant l’efficacité d’un nouvel inhibiteur de PADI, BB-CLA, dans la suppression de la croissance de MCF10DCIS colonies de cancer du sein7. Nous notons que nous avons utilisé MCF10DCIS cellules pour cette expérience parce qu’elles sont des dérivés oncogéniques de cellules humaines MCF10A non transformées et parce qu’elles contiennent des niveaux élevés de la protéine PADI28 à l’état d’équilibre. Nous émettons l’hypothèse que l’activité enzymatique de PADI2 joue un rôle clé dans la tumorigénicité de cette lignée cellulaire et que l’inhibition de l’activité de PADI2 médiée par BB-CLA supprimera la progression du cancer.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Axiopot</td><td>Carl Zeiss Microscopie</td><td>1021859251</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Donor Equine Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30074.03</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycin Life</td><td>Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxyéthylagarose : Type VII, basse température de gélification</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346-81-1</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;utilisation de l&#39;essai de formation souple agar colonie à identifier des inhibiteurs de tumorigénicité dans les cellules cancéreuses du sein

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Étant donné les difficultés inhérentes à l’étude des mécanismes de progression tumorale in vivo, les tests cellulaires tels que le test de formation de colonies de gélose molle (ci-après appelé test de gélose molle), qui mesure la capacité des cellules à proliférer dans des matrices semi-solides, restent une caractéristique de la recherche sur le cancer. L’un des principaux avantages de cette technique par rapport aux tests conventionnels de culture cellulaire monocouche ou sphéroïde 3D est le mimétisme étroit de l’environnement cellulaire 3D avec celui observé in vivo. Il est important de noter que le test de la gélose molle constitue également un outil idéal pour tester rigoureusement les effets de nouveaux composés ou de conditions de traitement sur la prolifération et la migration cellulaires. De plus, ce test permet d’évaluer quantitativement le potentiel de transformation cellulaire dans le contexte de perturbations génétiques. Nous avons récemment identifié la peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) comme un biomarqueur potentiel du cancer du sein et une cible thérapeutique. Nous soulignons ici l’utilité du dosage de la gélose molle pour les études anticancéreuses précliniques en testant les effets de l’inhibiteur de PADI, BB-Cl-amidine (BB-CLA), sur la tumorigénicité des cellules de carcinome canalaire in situ (MCF10DCIS) humain.

Le dosage de formation de colonies sur gélose molle peut être utilisée pour une large gamme d&#39;applications documentant la tumorigénicité des cellules cancéreuses. Un avantage majeur de cette technique est que la matrice semi-solide favorise sélectivement la croissance des cellules qui peuvent proliférer d&#39;une manière indépendante de l&#39;ancrage. Cette caractéristique est principalement exposée par les cellules cancéreuses, mais pas par les cellules normales. Nous utilisons cette technique principalement pour t...

Ici, nous documentons l’utilisation du test de formation de colonie de gélose molle pour tester les effets d’un inhibiteur de l’enzyme peptidylarginine deiminase (PADI), BB-Cl-amidine, sur la tumorigénicité du cancer du sein in vitro.

L&#39;utilisation de l&#39;essai de formation souple Agar colonie à identifier des inhibiteurs de Tumorigénicité dans les cellules cancéreuses du sein

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

L'objectif général de cette procédure est de déterminer de manière quantitative l'effet d'un traitement sur la capacité des cellules à proliférer dans des matrices semi-solides, une capacité accrue étant un critère caractéristique de la tumorigénicité cellulaire. La tumorigénicité est mesurée à l'aide du test d'agar mou par la capacité des cellules à former des colonies au sein d'un gel semi-solide AROS. Étant donné que les cellules non transformées sont incapables de se multiplier rapidement dans cet environnement, le gel semi-solide AROS est préparé en formant d'abord une couche inférieure contenant 0,6 % d'AROS. Ensuite, une couche de gel contenant les cellules et 0,3 % d'AROS est ajoutée au-dessus de la couche inférieure.Dans cet essai, les cellules expérimentales sont traitées avec un inhibiteur de l'enzyme peptidyl, arginine, dase ou pad mis au point par le Dr Subramanian. Chaque semaine, une couche d'alimentation supplémentaire est ajoutée, constituée d'un gel à 0,3 % d'aros, avec ou sans traitement. La dernière étape consiste à compter le nombre de colonies de plus de 70 micromètres pour l'analyse.En fin de compte, la microscopie inversée est utilisée pour montrer la différence du nombre de colonies entre le groupe témoin et le groupe traité. Bonjour, je m'appelle Achi Huta. Je suis étudiant diplômé dans le laboratoire du Dr. Scott Kros à l'Institut Baker pour la santé animale.À l'université Cornell, le test de formation de colonies de type tigre mou peut aider à répondre à des questions clés en biologie du cancer, comme l'évaluation de la tumorigénicité d'un large éventail de cellules cancéreuses en fonction de leur sensibilité aux médicaments, aux hormones et à de nombreuses autres conditions de traitement. Commencez cette procédure en préparant 3 % de deux hydroxyéthyl aros dans un flacon en verre propre et sec de 100 millilitres. Ajoutez 0,9 gramme de deux hydroxyéthyl aros, suivi de 30 millilitres d'eau distillée.Faites chauffer une solution au micro-ondes pendant 15 secondes et faites-la tourbillonner doucement. Répétez cette étape jusqu'à ce que la poudre AROS soit complètement dissoute. Ensuite, stérilisez la solution dans son flacon au moyen d'un autoclave pendant 15 minutes.Laisser la solution d'agros refroidir à température ambiante. Avant toute manipulation ultérieure, préchauffer plusieurs pipettes de cinq millilitres et de 10 millilitres dans un incubateur à 37 degrés Celsius afin d'empêcher l'agros de se solidifier dans la pipette. Lors de la manipulation partielle, desserrer le bouchon du flacon et passer au micro-ondes la solution préparée d'agros à 3 % pendant 15 secondes.Ensuite, agiter doucement la solution et passer au micro-ondes pendant encore 15 secondes. Faire attention lors de l'agitation de la solution ARO, car celle-ci monte en volume lorsqu'elle est exposée à l'air et peut déborder si un gel solide résiduel est encore présent dans le flacon après passage au micro-ondes. Pendant les étapes suivantes, maintenir le flacon contenant la solution ARO dans un bain-marie à 45 degrés Celsius pendant quelques secondes supplémentaires afin d'empêcher la solution agro de se solidifier prématurément.Ensuite, transférez 12 millilitres de milieu préchauffé à l'aide des pipettes préchauffées dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Ajoutez immédiatement trois millilitres de la solution d'aros à 3 % et retournez délicatement le tube conique pour mélanger l'aros avec le milieu. Puis, ajoutez doucement deux millilitres de ce mélange dans chaque puits d'une plaque de culture à six puits sans former de bulles d'air.Incubez la plaque de culture à six puits horizontalement sur une surface plane à quatre degrés Celsius pendant une heure afin de permettre à une solidification du mélange. Une fois le mélange solidifié, placez la plaque dans une étuve à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. La couche inférieure est désormais prête à l'emploi.Un aspecte difficile de cette procédure consiste à s'assurer que toutes les cellules sont réparties uniformément et que la couche d'agar fondu ne se solidifie pas avant son ajout dans chaque puits, afin que les seltz soient mélangés dans le milieu avant d'ajouter le gel d'agar liquide. En outre, les pipettes sont préalablement réchauffées afin d'éviter que les solutions ne se solidifient pendant la manipulation. Pour préparer la couche contenant les cellules, détacher d'abord par la trypsine les cellules MCF 10 DCIS et les diluer à une concentration de 40 000 cellules par millilitre, puis prélever huit millilitres de milieu à l'aide de pipettes préchauffées et transférer dans un tube conique stérile de 50 millilitres.Ajoutez immédiatement deux millilitres de 3 % aros dans le tube conique et retournez doucement pour mélanger les aros avec le milieu. Évitez de former des bulles. Ensuite, prélevez deux millilitres des cellules et traitez-les avec deux micromoles de chloramine BB dans du DMSO ou du DMSO seul comme témoin ; après traitement, mélangez les cellules avec l’aros 0,6 % dans une dilution un-à-un pour obtenir une concentration finale d’une micromole de chloramine BB.Ensuite, prélevez un millilitre du mélange d'aros cellulaires et ajoutez-le délicatement sur la couche inférieure de la plaque de culture à six puits. Placez la plaque de culture à six puits horizontalement sur une surface plane à quatre degrés Celsius pendant au moins 15 minutes afin de permettre la solidification de la couche supérieure. Une fois le mélange solidifié, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une semaine avant d'ajouter la couche nutritive.Commencez la préparation de la couche d'alimentation en chauffant au micro-ondes la solution prête à l'emploi de deux hydroxyéthyl aro à 3 %, comme précédemment, et en équilibrant le flacon de solution d'agro dans un bain-marie à 45 degrés Celsius. Mélangez un millilitre de solution d'agro à 3 % avec neuf millilitres de milieu tiède dans un tube conique de 50 millilitres, puis retournez doucement le tube pour mélanger les aros au milieu. Évitez de former des bulles d'air. Après avoir traité le mélange avec la chloramine BB, ajoutez délicatement un millilitre du mélange dans chaque puits de la plaque de culture à six puits contenant les couches inférieure et molle.Ensuite, placez la plaque de culture à six puits horizontalement sur une surface plane à quatre degrés Celsius pendant au moins 15 minutes afin de permettre au mélange de se solidifier. Une fois la couche d'alimentation solidifiée, placez la plaque dans une étuve à 37 degrés Celsius. Bader, répétez cette procédure d'alimentation chaque semaine en ajoutant un millilitre de solution de milieu de traitement à 0,3 % d'agarose sur la couche d'alimentation existante afin de renouveler le milieu des cellules jusqu'à l'observation de la formation de colonies.Après deux semaines et demie de croissance cellulaire dans l'agar doux, le nombre de colonies dans chaque puits est décompté. Pour faciliter la quantification, imprimez une grille sur une transparence et fixez-la sur la plaque à six puits afin d'aider à localiser les cellules pendant le décompte, en utilisant un microscope optique. La taille des colonies est quantifiée par le diamètre de chaque colonie et varie ; définissez au préalable une taille de référence pour déterminer quelles colonies seront prises en compte.Par exemple, ici, les tailles de colonies de 70 micromètres ou plus sont incluses dans l'analyse des données. Après le comptage, scellez la plaque de culture à six puits avec du paraform pour éviter que les gels ne s'assèchent. Conservez les échantillons à quatre degrés Celsius pour empêcher la formation de nouvelles colonies et pour un comptage ultérieur.Les résultats démontrent que la chloramine BB inhibe de manière significative la formation de colonies dérivées des cellules MC 10 DCIS en présence d'un inhibiteur de pad. On observe une réduction à la fois de la formation des colonies et de leur taille par rapport au témoin DMSO. La taille des colonies des cellules MCF 10 DCIS traitées à la chloramine BB se situait principalement entre 20 et 100 micromètres.Alors que la taille des colonies du témoin DMSO présentait une plage plus étendue de 70 à 150 micromètres après deux semaines et demie de croissance, seules les colonies de plus de 70 micromètres ont été comptées et analysées. On observait en moyenne environ 3 500 colonies dans le témoin DMSO, contre seulement environ 2 000 colonies dans le groupe traité au chloramine BB. Après deux semaines et demie de culture en milieu semi-solide, cela représente une diminution moyenne de 44 % de la formation de colonies en présence d'une micromolaire de chloramine BB, indiquant une inhibition significative de la tumorigénicité des cellules cancéreuses du sein par cet inhibiteur PAD.Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de préchauffer tous les réactifs et équipements à l'avance afin d'éviter que les solutions ne se solidifient pendant la manipulation, et merci d'avoir regardé.

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Un test pour mesurer quantitativement Transforming Growth Factor (TGF)-β-induite invasion dans des gels de collagène en 3 dimensions est décrite. Ce test prend avantage de la série MCF10A de lignées cellulaires, qui représentent les différentes étapes du développement du cancer du sein. Cette méthode peut être adoptée pour être utilisé avec d'autres lignées cellulaires et pourraient être utilisées pour étudier d'autres activateurs ou des inhibiteurs potentiels de l'invasion.

Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion

Cette vidéo décrit un test de formation de colonie de gélose molle pour tester les effets d’un inhibiteur de l’enzyme PADI et de la BB-Cl-amidine sur la tumorigénicité du cancer du sein in vitro. Ce test permet également d’évaluer quantitativement le potentiel de transformation cellulaire dans le contexte de perturbations génétiques.

Essai de formation de colonies de gélose molle : une méthode pour tester les effets de nouveaux composés sur la prolifération des cellules cancéreuses

Cette vidéo décrit le test de formation de colonies, qui aide à déterminer la capacité des cellules cancéreuses du poumon à proliférer indéfiniment et à former des colonies individuelles. Nous pouvons analyser l’effet d’un agent anticancéreux sur les cellules formant des colonies en analysant les changements dans le nombre et/ou la taille des colonies résultantes.

Essai de formation de colonies : évaluation de l’efficacité des agents anticancéreux sur les cellules cancéreuses du poumon formant des colonies

Cette vidéo décrit le protocole de l’unité de formation de colonies à base de méthylcellulose ou test UFC, qui permet d’identifier et de compter le nombre de colonies formées par les cellules leucémiques en réponse au traitement avec des composés anticancéreux.

Dosage de l’UFC à base de méthylcellulose : une méthode pour déterminer l’effet des composés anticancéreux sur la formation de colonies dans les cellules leucémiques

Le test de formation de colonies de gélose molle est une méthode utilisée pour confirmer in vitro la croissance indépendante de l’ancrage cellulaire. L’objectif de ce protocole est d’illustrer une méthode rigoureuse pour la détection du potentiel tumorigène des cellules transformées et des effets suppresseurs de tumeurs des protéines sur les cellules transformées.

La formation de dosage souple Agar Colony

Cette procédure démontrera comment nous avons synthétisé et caractérisé l’activité des cellules souches anti-NFκB et anticancéreuses d’un promédicament à base d’aspirine-fumarate.

Synthèse et caractérisation d&#39;un promédicament Aspirin-fumarate qui inhibe l&#39;activité de NFkB et du sein des cellules souches du cancer

Il est souvent nécessaire d'évaluer la cytotoxicité potentielle d'un ensemble de composés sur les cellules cultivées. Ici, nous décrivons une stratégie pour dépister de façon fiable les composés toxiques dans un format de 96 puits.

Une stratégie visant à identifier les composés qui affectent la croissance et la survie des cellules mammifères cultivées à un débit faible à modéré

L'exemple d'invasion cellulaire in vitro est utilisé pour mesurer le potentiel de la métastes du cancer en quantifiant le potentiel cellulaire d'invasion et de migration à l'aide d'inserts de culture cellulaire contenant de la matrice protéique. Les cellules sont mises au défi de migrer à travers la matrice protéique et une membrane poreuse, vers un chimioattractant, puis quantifiées par microscopie légère.

L'utilisation de cellules de tumeur mammaire de souris dans un analyse d'invasion in vitro comme mesure du comportement cellulaire oncogène

Ce protocole fournit des outils expérimentaux in vitro pour évaluer la transformation des cellules mammaires humaines. Des étapes détaillées pour le taux de prolifération cellulaire de suivi, la capacité de croissance ancre-indépendante, et la distribution des lignées cellulaires dans les cultures 3D avec la matrice de membrane de sous-sol sont décrites.

Évaluation in vitro de la transformation oncogène des cellules épithéliales mammaires humaines

Le présent protocole décrit la génération de modèles de culture tumorale 3D à partir de cellules cancéreuses primaires et l’évaluation de leur sensibilité aux médicaments à l’aide de tests de viabilité cellulaire et d’examens microscopiques.

Établissement de sphéroïdes en 3 dimensions à partir d’échantillons tumoraux dérivés de patients et évaluation de leur sensibilité aux médicaments

Ce protocole expérimental offre une méthode stable, rentable et efficace qui combine le knockdown de l’ARNnc avec des tests formant des colonies afin de quantifier l’effet de l’ARNnc sur la prolifération cellulaire de l’ostéosarcome.

Essai de formation de colonie détectant la capacité proliflective des cellules d’ostéosarcome à élimination d’ARNCn

Découvrez l'essai de formation de colonies en gélose molle pour évaluer la tumorigénicité des cellules cancéreuses du sein. Cette méthode quantifie l'effet de l'inhibiteur BB-Cl-amidine sur la prolifération cellulaire.

Lutilisation de lessai de formation souple Agar colonie à identifier des inhibiteurs de Tumorigénicité dans les cellules cancéreuses du sein (Vidéo) | JoVE Journal

L'utilisation de l'essai de formation souple Agar colonie à identifier des inhibiteurs de Tumorigénicité dans les cellules cancéreuses du sein

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