L'utilisation de l'essai de formation souple Agar colonie à identifier des inhibiteurs de Tumorigénicité dans les cellules cancéreuses du sein

L’objectif global de cette procédure est de déterminer quantitativement l’effet du traitement sur la capacité des cellules à proliférer dans des matrices semi-solides, car une capacité accrue est une caractéristique de la génicité tumorale cellulaire à l’aide du test de gélose douce. La génicité tumorale est mesurée par la capacité d’une cellule à former des colonies dans un gel AROS semi-solide. Étant donné que les cellules non transformées sont incapables de se propager rapidement dans cet environnement, le gel AROS semi-solide est construit en fabriquant d’abord une couche inférieure AROS à 0,6 %. Ensuite, une cellule contenant 0,3 % de couche de gel AROS est ajoutée au-dessus de la couche inférieure.

Dans ce test, les cellules expérimentales sont traitées avec un inhibiteur de peptidyl, d’arginine, de dase ou d’enzyme pad développé par le Dr Subramanian. Chaque semaine, une couche d’alimentation supplémentaire est ajoutée, qui est un gel à 0,3 % avec ou sans traitement. La dernière étape consiste à compter le nombre de colonies de plus de 70 micromètres pour l’analyse.

En fin de compte, la microscopie inversée est utilisée pour montrer la différence dans le nombre de colonies entre le groupe témoin et le groupe de traitement. Bonjour, je m’appelle Achi Huta. Je suis étudiant diplômé dans le laboratoire du Dr Scott Kros à l’Institut Baker pour la santé animale.

À l’Université Cornell, le test de formation de colonies de tigres mous peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du cancer, telles que l’évaluation de la génicité tumorale d’un large éventail de cellules cancéreuses en ce qui concerne leur sensibilité aux médicaments, aux hormones et à une multitude d’autres conditions de traitement. Commencez cette procédure en préparant 3 % d’hydroxyéthyle aros dans une bouteille en verre propre et sèche de 100 millilitres. Ajoutez 0,9 gramme de deux aros hydroxyéthyles, suivis de 30 millilitres d’eau distillée.

Passez le mélange au micro-ondes pendant 15 secondes et remuez doucement. Répétez cette étape jusqu’à ce que la poudre AROS se dissolve complètement. Ensuite, autoclavez la solution contenant le flacon pendant 15 minutes.

Laissez la solution agros refroidir à température ambiante. Avant d’aller plus loin, utilisez Préchauffer plusieurs pipettes de cinq millilitres et 10 millilitres dans un incubateur à 37 degrés Celsius pour éviter que les aros ne se solidifient dans la pipette. Lors de la manipulation partielle, desserrez le couvercle de la bouteille et passez au micro-ondes la solution préfabriquée d’HYDROXYETHYL aro à 3 % pendant 15 secondes.

Ensuite, agitez doucement la solution et passez au micro-ondes pendant 15 secondes supplémentaires. Soyez prudent lorsque vous faites tourner la solution ARO car la solution remonte lorsqu’elle est exposée à l’air et peut se répandre s’il y a un gel solide résiduel dans le micro-ondes de la bouteille. Pendant quelques secondes de plus, conservez le flacon contenant la solution ARO dans un bain-marie à 45 degrés Celsius pendant les étapes suivantes pour éviter que la solution agricole ne se solidifie prématurément.

Ensuite, transférez 12 millilitres de milieu chauffé à l’aide des pipettes Prewarm dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Ajouter immédiatement trois millilitres de la solution à 3 % d’aros et retourner doucement le tube conique pour mélanger l’aros avec le milieu. Ajoutez ensuite doucement deux millilitres de ce mélange dans chaque puits d’une plaque de culture à six puits sans former de bulles d’air.

Incuber la plaque de culture à six puits horizontalement sur une surface plane à quatre degrés Celsius pendant une heure pour permettre au mélange de se solidifier. Une fois le mélange solidifié, placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. La couche inférieure est maintenant prête à l’emploi.

Un aspect difficile de cette procédure est de s’assurer que toutes les cellules sont réparties uniformément et que la coquille d’agra fondue ne se solidifie pas avant l’ajout à chaque puits pour s’assurer que les seltz sont mélangés dans le milieu avant d’ajouter le gel agricole liquide. De plus, les tuyaux sont préchauffés au préalable pour éviter que les solutions ne se solidifient lors de la manipulation. Pour préparer la cellule contenant la couche, d’abord les yeux de trypsine MCF 10 cellules CCIS et les diluer à une concentration cellulaire de 40 000 cellules par millilitre, puis prélever huit millilitres de milieu à l’aide de pipettes préchauffées et transférer dans un tube conique stérile de 50 millilitres.

Ajoutez immédiatement deux millilitres de 3 % d’aros dans le tube conique et retournez doucement pour mélanger l’aros avec le média. Évitez de former des bulles. Ensuite, prenez deux millilitres de cellules et traitez-les avec deux BB chloramine micromolaires dans du DMSO ou du DMSO seul comme contrôle après le traitement, mélangez les cellules avec les 0,6 % aros dans une dilution un à un pour faire une concentration finale d’une BB chloramine micromolaire.

Ensuite, prenez un millilitre du mélange de cellules aros et ajoutez-le doucement sur la couche inférieure de la plaque de culture à six puits. Placez la plaque de culture à six puits horizontalement sur une surface plane à quatre degrés Celsius pendant au moins 15 minutes pour permettre à la couche supérieure de se solidifier. Une fois que le mélange s’est solidifié, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une semaine avant d’ajouter la couche d’alimentation.

Commencez la préparation des couches d’alimentation en passant au micro-ondes la solution d’hydroxyéthyle aro préfabriquée à 3 % comme précédemment et en équilibrant le flacon de solution agricole dans un bain-marie à 45 degrés Celsius, mélangez un millilitre de solution agricole à 3 % avec neuf millilitres de milieu chaud dans un tube conique de 50 millilitres et retournez doucement pour mélanger l’aros avec le milieu. Évitez de former des bulles d’air. Après avoir traité le mélange avec de la BB chloramine, ajoutez doucement un millilitre du mélange dans chaque puits de la plaque de culture à six puits contenant les couches inférieures et molles.

Placez ensuite la plaque de culture à six puits horizontalement sur une surface plane à quatre degrés Celsius pendant au moins 15 minutes pour permettre au mélange de se solidifier. Une fois que la couche d’alimentation s’est solidifiée, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Bader, répétez cette procédure d’alimentation chaque semaine en superposant un millilitre de solution de traitement agros medium à 0,3 % sur la couche nourricière existante pour reconstituer les cellules avec de nouveaux milieux jusqu’à ce que la formation de colonies soit observée.

Après deux semaines et demie de croissance cellulaire dans la gélose molle, le nombre de colonies dans chaque puits est compté. À l’aide d’un microscope optique pour faciliter la quantification, imprimez une grille sur un transparent et fixez la grille à la plaque à six puits pour aider à localiser l’emplacement des cellules pendant le comptage. La taille de la colonie est quantifiée par le diamètre de chaque colonie et variera avant de définir la taille de la colonie de référence pour déterminer quelles colonies seront notées.

Par exemple, ici, des colonies de 70 micromètres ou plus sont incluses dans l’analyse des données. Après le comptage, scellez la plaque de culture à six puits avec du paraform pour éviter que les gels ne se dessèchent. Conservez les échantillons à quatre degrés Celsius pour éviter la formation d’autres colonies et pour un comptage futur.

Les résultats démontrent que la BB chloramine inhibe significativement la formation de colonies dérivées de cellules CCIS MC 10 en présence d’un inhibiteur de PAD. Il y a eu une réduction de la formation et de la taille de la colonie par rapport au témoin DMSO. La taille des colonies de cellules CCF 10 MCF 10 traitées à la chloramine BB était principalement de l’ordre de 20 à 100 micromètres.

Alors que la taille des colonies pour le contrôle DMSO présentait une plus grande plage de 70 à 150 micromètres, après deux semaines et demie de croissance, les colonies de plus de 70 micromètres ont été comptées et analysées. Il y avait en moyenne environ 3 500 colonies dans le groupe témoin DMSO, alors que seulement environ 2000 colonies ont été observées dans le groupe traité à la BB chloramine. Après deux semaines et demie d’agriculture douce, cela représente une diminution de 44 % de la formation moyenne de colonies en présence d’une BB chloramine micromolaire, indiquant une inhibition tumorogène significative des cellules cancéreuses du sein par l’inhibiteur de coussinet.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de garder à l’esprit de préchauffer tous les réactifs et équipements à l’avance pour éviter que les solutions ne se solidifient lors de la manipulation, et merci de regarder.