Analyse quantitative des défauts d'escalade dans un modèle drosophile de maladies neurodégénératives

L'objectif général de cette procédure est de quantifier la capacité d'escalade des mouches de type sauvage et des mouches mutantes pour les gènes impliqués dans la locomotion. Cette étape est réalisée en transférant d'abord les mouches dans un cylindre gradué en verre. La deuxième étape consiste à déplacer les mouches vers le fond du cylindre en tapotant légèrement le cylindre sur un rembourrage en mousse.

Les mouches suivantes traversant la ligne cible sont enregistrées à l'aide d'une caméra vidéo pendant une durée de deux minutes. La dernière étape consiste à analyser les vidéos et à tracer le nombre de mouches au-dessus de la ligne cible toutes les 10 secondes. En fin de compte, le test d'escalade permet d'identifier les défauts de capacité d'escalade chez des lignées mutantes de mouches à fruits.

Le principal avantage de cette technique, ou des techniques existantes telles que la méthode sauvage, est sa capacité à détecter de légères différences dans l'aptitude à grimper. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des troubles neurodégénératifs, comme le rôle de gènes spécifiques dans la paraplégie spastique héréditaire sur l'aggravation progressive des troubles de la marche. L'implication de cette technique tend vers le développement de thérapies.

IP pour les troubles neurologiques car il fournit un test quantitatif simple permettant d'évaluer la réponse aux médicaments et les mutants de gènes candidats impliqués dans les maladies neurodégénératives. Commencez par anesthésier 20 mouches à l'aide de dioxyde de carbone, puis placez toutes les mouches dans un flacon de collecte de 25 millimètres sur 95 millimètres contenant de la nourriture. Ensuite, conservez le flacon contenant les mouches en position horizontale dans un plateau en carton afin d'éviter qu'elles ne restent piégées dans tout liquide pouvant s'accumuler au fond du flacon. Placez les mouches dans un incubateur pendant au moins 21 heures dans un cycle lumineux de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Le lendemain matin, préparez le test de grimpe en transférant les mouches du flacon dans un cylindre gradué en verre de 250 millilitres, puis scellez le haut avec une pellicule de cire afin d'empêcher l'échappement des mouches.

Réalisez l'expérience en lumière ambiante à 22 degrés Celsius et à 40 % d'humidité. Effectuez toujours les expériences à la même heure de la journée afin d'éviter les interférences avec les cycles de sommeil. En outre, marquez l'emplacement du cylindre sur le plan de travail afin de le maintenir constant chaque jour.

Comptez le nombre de mouches mortes au fond du cylindre et dans les fioles de nourriture, puis enregistrez ce nombre comme étant la mortalité. Ensuite, installez la caméra vidéo sur un trépied. Focalisez la caméra sur la graduation de 190 millilitres du cylindre gradué de 250 millilitres très légèrement.

Tapotez le cylindre cinq à dix fois contre un tampon en mousse à cellules closes avec une force suffisante pour déplacer les mouches vers la surface intérieure du fond. Ensuite, utilisez l'autre main pour appuyer sur l'enregistrement de la caméra. Puis, pendant l'enregistrement, tapez six fois sur le cylindre selon un motif nettement non rythmique.

Effectuez chaque essai pendant deux minutes à partir du moment où les mouches sont tapotées pour la dernière fois. Enfin, éliminez les mouches dans de l’éthanol à 95 %. Une fois l’essai terminé, répétez ce test d’escalade 10 fois en utilisant à chaque fois 20 mouches fraîches afin de détecter de légères différences de locomotion entre les groupes.

Lavez les cylindres dans un lave-vaisselle et faites-les sécher toute la nuit afin de pouvoir les réutiliser une fois l'expérience terminée. Pour analyser la performance des mouches, commencez par visionner les vidéos de chaque essai enregistré. Comptez le nombre total de mouches qui franchissent la ligne cible toutes les 10 secondes. Si une mouche redescend ou tombe, enregistrez-la comme moins un et comptez la mouche suivante qui franchit la ligne cible comme le même nombre que la mouche qui est redescendue ou est tombée.

Par exemple, si la 15e mouche se situe en dessous de la ligne cible, la mouche suivante qui franchit la ligne est considérée comme la 15e mouche et non comme la 16e. Ensuite, soustraire la mortalité du nombre total de mouches pour obtenir le nombre de mouches restant dans la parcelle expérimentale. Le pourcentage de mouches situées au-dessus de la ligne cible à chaque point temporel permet, lorsqu'on travaille avec des mutations sévères, d'observer différents degrés de défaut de grimpe à l'aide de différents tests de grimpe.

Ici, le nombre de mouches âgées de huit jours ayant grimpé au sommet d'un flacon vide de milieu alimentaire après 18 secondes a été enregistré, ne montrant aucune différence significative dans le comportement d'escalade entre les deux groupes. En revanche, en utilisant le test d'escalade décrit dans ce protocole, les mouches mutantes Bastin 17 tiret sept sur TM trois présentent un déficit de performance par rapport aux témoins. Étant donné que de nombreux troubles locomoteurs sont progressifs, il est important d'observer l'évolution des mouches au fil du temps.

Au bout de deux jours, on observe une différence significative dans le nombre de mouches qui grimpent au-dessus de la ligne cible, par rapport aux témoins. Cette performance à la montée continue de diminuer au fur et à mesure que les mouches mutantes vieillissent, de deux à plusieurs jours.

Une fois maîtrisés, cet expérience et cette analyse peuvent être réalisés en trois heures. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment quantifier les défauts locomoteurs dans les modèles mutants dola de troubles neurologiques.