Name: Analyse quantitative des défauts descalade dans un modèle drosophile de maladies neurodégénératives (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Découvrez l'analyse quantitative des défauts d'escalade chez Drosophila melanogaster pour étudier les maladies neurodégénératives. Cette méthode détecte les déficits locomoteurs légers et aide à identifier les interactions génétiques et cibles thérapeutiques.

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Ce travail est soutenu par une subvention d’équipe de l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC) au Dr Bolduc (co-chercheur) et au Dr Guy Rouleau (CP). Nous tenons à remercier la Dre Oksana Suchowersky, la Dre Kathryn Todd, les membres du club de vol de l’Université de l’Alberta et le Dr Clayton Dickson pour leur aide dans l’élaboration de la méthode et l’analyse statistique.

Recherche sur Drosophila melanogaster était en conformité avec l&#39;Université des lignes directrices de recherche de l&#39;Alberta. 1. Fly Collection <ol><li> Recueillir 20 mouches utilisant le CO 2 (g) l&#39;anesthésie et le placer dans un flacon de collection 25 mm x 95 mm contenant de la nourriture. </li><li> Entreposer les flacons contenant des mouches horizontalement pour éviter le piégeage des mouches dans les liquides qui peuvent accumuler dans le fond du flacon. </li><li> Incuber mouches pendant au moins 21 heures à 22 ° C à 45% d&#39;humidité dans un incubateur pendant environ pendant 15 heures. Régler l&#39;incubateur avec une lumière de 12 h: cycle d&#39;obscurité. </li></ol> 2. Escalade Assay <ol><li> Le lendemain matin, transférer 20 mouches d&#39;un seul flacon en verre de 250 ml graduée. Marquer la position du cylindre pour le maintenir constant de tous les jours. Utilisez un cylindre de verre par génotype pour éviter la contamination croisée entre les génotypes. Laver à la fin de chaque expérience et roliter eux entre les génotypes. <ol><li> Mener des expériences à la lumière ambiante (ou la lumière rouge si il ya un défaut potentiel de la vision) à la température et l&#39;humidité de 22 ° C et 40% respectivement. Pour éviter rythme circadien confondre, toujours effectuer des expériences dans le même temps de la journée. </li></ol></li><li> Sceller la partie supérieure du cylindre avec un film barrière (film de cire) pour empêcher la fuite de tout vol (figure 2). </li><li> Mettre en place la caméra vidéo sur un trépied. appareil photo Focus sur la ligne 190 ml de 250 ml graduée (17,5 cm). </li><li> Compter le nombre de mouches mortes au fond du cylindre et dans les flacons de produits alimentaires. Inscrire ce numéro que le taux de mortalité. </li><li> Très tapoter légèrement le cylindre contre un coussin en mousse à cellules fermées à plusieurs reprises avec une force suffisante pour déplacer les mouches à la surface inférieure intérieure. Appuyez sur 5 - 10 fois tout en utilisant l&#39;autre main pour appuyer dossier sur l&#39;appareil photo. </li><li> Appuyez sur le bouton &quot;Enregistrer&quot; sur la caméra. </li><li> Lancer la video enregistrement de la caméra et tapez sur le cylindre à six reprises dans un modèle non-rythmique distincte. </li><li> Mener chaque essai pendant 2 min à partir du moment les mouches sont exploitées dernière et enregistrer le nombre de mouches qui traversent la hauteur de 17,5 cm (190 ml) à chaque point de temps choisi (de quantifier toutes les 10 secondes). Remarque: Le marquage sur le cylindre ml variera d&#39;un modèle de cylindre à l&#39;autre en fonction du diamètre. Pour éviter toute erreur, mesurer la hauteur sur chaque bouteille utilisée. </li><li> Une fois le procès terminé, disposer de mouches dans 95% d&#39;éthanol. </li><li> Répétez les étapes 2.1 à 2.9 jusqu&#39;à ce que toutes les répétitions ont été testés avec des mouches frais à chaque fois. Note: Bien que 5 répétitions peuvent être assez avec une mutation ayant un effet important sur la locomotion, 10 répétitions biologiques de 20 200 mouches (mouches) est recommandée pour détecter des différences plus petites. </li><li> À la fin de l&#39;expérience, se laver les cylindres dans le lave-vaisselle de laboratoire et O sec / N pour être réutilisé. </li></ol> 3. Analyse <ol><li> Analyze vidéos de chaque volent procès. Chaque 10 secondes, enregistrer le nombre total de mouches qui passent la ligne de cible. <ol><li> Si une mouche redescend ou tombe, fiche qui volent comme -1 et compter la prochaine volée de franchir la ligne de cible que le même numéro que la mouche qui est remonté vers le bas ou est tombé. Par exemple, si le 15 ème mouche tombe en dessous de la ligne de cible, la prochaine volée à franchir la ligne (16 e volent) est considéré comme le 15 ème volée et non pas le 16 ème. </li></ol></li><li> Soustraire la mortalité à partir du nombre total de mouches (20) pour obtenir le nombre de mouches qui restent dans le procès. A chaque point de temps, obtenir la fraction de mouches au-dessus de la ligne de cible. </li><li> Complot chaque pourcentage à chaque point de temps (voir Figure 3). </li><li> Analyser la performance au point de données 120 sec et effectuer test t de Student lorsque 2 groupes sont présents ou ANOVA et un post-test pour les comparaisons multiples (avec modification de Bonferroni pour planifiées et non planifiées Tukey pour comparisons). Le Kolmogorov-Smirnov teste 17 est également effectuée pour vérifier la normalité et variance égale, mais aussi de comparer les distributions du groupe mutant à la commande. </li><li> Pour présenter les données sur le vieillissement, tracer le pourcentage de mouches grimper à 120 sec avec des mouches de différents âges (2 jours, 1 semaine, 2 semaines) pour voir si il ya un déficit progressif (Figure 4). </li></ol>

<ol><li>Auluck, P. K., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+prevention+of+Parkinson+disease+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila.</a> Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Drosophila a déjà prouvé être un excellent modèle dans la maladie 14 et d&#39;autres conditions neurodégénératives de 1,2 de Parkinson. En plus des outils génétiques disponibles chez la drosophile, son génome est hautement conservé de gènes impliqués dans des troubles neurologiques 19. L&#39;avènement des méthodes de dépistage génétique larges génome (y compris le séquençage de l&#39;exome ensemble) est susceptible de continuer à fournir une plus grande liste de gènes c...

Maladies neurodégénératives dévastatrices telles que la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, et paraplégie spastique familiale sont de plus en plus reconnus. Malheureusement, la plupart de ces maladies neurodégénératives sont encore sans traitements. L&#39;utilisation clinique généralisée de tests génétiques impartiales pangénomiques comme le séquençage de l&#39;exome ensemble a conduit à un nombre croissant de gènes étant impliqué dans les troubles locomoteurs humaines. Malgré ces progrès, la progression pathologique du début à la fin des étapes, reste insaisissable dans ces troubles. Drosophila fournit un avec les outils génétiques pour étudier exigence de gènes d&#39;une manière spatio-temporelle contrôlée. En outre, la drosophile est avéré utile pour le criblage de médicaments pour les troubles neurologiques comme la maladie de Parkinson 1, la maladie d&#39;Alzheimer 2, déficience intellectuelle et l&#39;épilepsie 3,4 5,6 entre autres. Notre objectif était de développer une solution rentableet le dosage fiable qui permettrait analyse à haut débit qui serait encore assez sensible pour détecter de petits changements dans les performances du moteur. Il existe plusieurs tests utilisés pour quantifier les effets de la mutation génétique et / ou de l&#39;état de l&#39;environnement sur ​​le comportement d&#39;escalade drosophile. La plupart des essais capitaliser sur la tendance naturelle de mouches à grimper, connus sous le nom géotaxie négative, ou le dosage de l&#39;escalade. 7 Benzer suggéré en 1967 que l&#39;appareil à contre-courant utilisé pour l&#39;étude de phototaxie pourrait également être utilisé pour étudier gravitaxis. Depuis lors, Ganetsky 8 et beaucoup d&#39;autres 9 -12 ont construit sur ​​le dosage initial. Le principe est de placer un nombre connu de mouches dans un flacon et appuyez sur le flacon fermement contre une surface dure, provoquant les mouches tombent au fond du flacon. Comme il est un comportement inné, vol tenteront de grimper au sommet de la fiole, par opposition à la gravité. Cet essai est quantitative et mesures combien de mouches ont grimpé passé un marqueur sur le flacon pendant une période de temps allouée. Mesure de la vitesse à la place du nombre total de mouches escalade est devenue un paramètre fiable et montré des défauts dans les cas où le nombre de critères de mouches était non significatif 13. Le test d&#39;escalade se sont révélées utiles dans l&#39;étude de nombreux troubles neurodégénératifs, y compris la maladie de Parkinson 14. Cependant, nous avons constaté que les défauts de locomotive peuvent ne pas être détectable au moment où la neurodégénérescence est déjà considérée dans les études pathologiques 14. Ainsi, l&#39;utilisation du dosage traditionnel peut limiter la capacité d&#39;étudier les stades précoces de la pathogenèse de la maladie. L&#39;apparition de défauts de locomotives durant les derniers stades de la pathologie peut refléter une maladie dont la progression est trop avancé pour le sauvetage complète. Cela soulève un problème potentiel avec la sensibilité de l&#39;essai d&#39;escalade traditionnelle. L&#39;incapacité potentielle de la traditiontional escalade test pour détecter les défauts de locomotives doux peut être attribuée à la hauteur à laquelle les mouches sont tenus de grimper. Les traditionnels dosage 15,16 mesures le nombre de mouches à monter avec succès sur une hauteur de 2 à 5 cm dans 10 à 20 sec.

<table><tbody><tr>Souches <td></td><td></td><td>de drosophile</td><td>Les souches sont sélectionnées en fonction des expériences. La température et l’humidité dans la pièce et dans l’incubateur doivent être contrôlées et constantes pour éviter que les mouches ne soient trop statiques ou trop humides.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>N’importe quel caméscope numérique fera l’affaire. Assurez-vous qu’ils peuvent faire la mise au point sur un objet proche.</td><td></td></tr><tr><td>Cylindre gradué</td><td>Kimble</td><td>20028W</td><td>Différents modèles de cylindre gradué peuvent avoir un diamètre différent. Il est donc important de mesurer la hauteur.</td></tr><tr><td>Ordinateur N’importe</td><td></td><td></td><td>quel modèle fera l’affaire. Nous avons utilisé l’ordinateur pour surveiller l’escalade des mouches et enregistrer le nombre de mouches à chaque point temporel.</td></tr></tbody></table>

analyse quantitative des défauts d&#39;escalade dans un modèle drosophile de maladies neurodégénératives

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive défauts résultant de maladies neurodégénératives peut être un symptôme d&#39;apparition tardive de la maladie, après des années de dégénérescence infraclinique, et des stratégies ainsi actuels de traitement thérapeutique ne sont pas curatifs. Grâce à l&#39;utilisation de séquençage d&#39;exome ensemble, un nombre croissant de gènes ont été identifiés à jouer un rôle dans la locomotion humaine. Malgré l&#39;identification de ces gènes, on ne sait pas comment ces gènes sont essentiels pour le fonctionnement de la locomotive normale. Par conséquent, un test fiable, qui utilise des organismes modèles pour élucider le rôle de ces gènes afin d&#39;identifier de nouvelles cibles d&#39;intérêt thérapeutique, est plus que jamais nécessaire. Nous avons conçu une version sensibilisée de l&#39;essai de géotaxie négatifs qui permet la détection de défauts plus douces antérieure et a la capacité d&#39;évaluer ces défauts au cours du temps. Le dosage est réalisé dans un cylindre gradué de verre, qui est scellée avec un film de barrière cire. En augmentant la distance de seuil pour être grimpé à 17,5 cm et en augmentant la durée de l&#39;expérience à 2 min, nous avons observé une plus grande sensibilité dans la détection des dysfonctionnements de mobilité douces. Le dosage est rentable et ne nécessite pas une formation approfondie pour obtenir des résultats hautement reproductibles. Cela en fait une excellente technique pour le criblage de médicaments candidats dans des mutants de drosophile avec des défauts de locomotion.

Escalade est un comportement solide et reproductible. En effet, un jour de vieilles mouches de type sauvage atteindre la performance d&#39;escalade de distance de la cible rapidement (25 - 30 sec). Mouches mutantes présentent une gamme de performances de légère (ou retardée) pour compléter l&#39;incapacité de monter à la cible. Nous illustrons cette ici avec deux allèles mutants différents. Le premier est un allèle sévère de la spastin génique provoquée par une deletion complète du gène de spas spastin (5,75) 18.</...

Nous présentons un test de géotaxie négative optimisé, peu coûteux et fiable chez Drosophila melanogaster comme modèle pour les troubles neurodégénératifs. Étant plus sensible aux anomalies locomotrices bénignes, ce test aidera à dépister les interactions génétiques potentielles et les cibles médicamenteuses.

Analyse quantitative des défauts d&#39;escalade dans un modèle drosophile de maladies neurodégénératives

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier la capacité d'escalade des mouches de type sauvage et des mouches mutantes pour les gènes impliqués dans la locomotion. Cette étape est réalisée en transférant d'abord les mouches dans un cylindre gradué en verre. La deuxième étape consiste à déplacer les mouches vers le fond du cylindre en tapotant légèrement le cylindre sur un rembourrage en mousse.Les mouches suivantes traversant la ligne cible sont enregistrées à l'aide d'une caméra vidéo pendant une durée de deux minutes. La dernière étape consiste à analyser les vidéos et à tracer le nombre de mouches au-dessus de la ligne cible toutes les 10 secondes. En fin de compte, le test d'escalade permet d'identifier les défauts de capacité d'escalade chez des lignées mutantes de mouches à fruits.Le principal avantage de cette technique, ou des techniques existantes telles que la méthode sauvage, est sa capacité à détecter de légères différences dans l'aptitude à grimper. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des troubles neurodégénératifs, comme le rôle de gènes spécifiques dans la paraplégie spastique héréditaire sur l'aggravation progressive des troubles de la marche. L'implication de cette technique tend vers le développement de thérapies.IP pour les troubles neurologiques car il fournit un test quantitatif simple permettant d'évaluer la réponse aux médicaments et les mutants de gènes candidats impliqués dans les maladies neurodégénératives. Commencez par anesthésier 20 mouches à l'aide de dioxyde de carbone, puis placez toutes les mouches dans un flacon de collecte de 25 millimètres sur 95 millimètres contenant de la nourriture. Ensuite, conservez le flacon contenant les mouches en position horizontale dans un plateau en carton afin d'éviter qu'elles ne restent piégées dans tout liquide pouvant s'accumuler au fond du flacon. Placez les mouches dans un incubateur pendant au moins 21 heures dans un cycle lumineux de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Le lendemain matin, préparez le test de grimpe en transférant les mouches du flacon dans un cylindre gradué en verre de 250 millilitres, puis scellez le haut avec une pellicule de cire afin d'empêcher l'échappement des mouches.Réalisez l'expérience en lumière ambiante à 22 degrés Celsius et à 40 % d'humidité. Effectuez toujours les expériences à la même heure de la journée afin d'éviter les interférences avec les cycles de sommeil. En outre, marquez l'emplacement du cylindre sur le plan de travail afin de le maintenir constant chaque jour.Comptez le nombre de mouches mortes au fond du cylindre et dans les fioles de nourriture, puis enregistrez ce nombre comme étant la mortalité. Ensuite, installez la caméra vidéo sur un trépied. Focalisez la caméra sur la graduation de 190 millilitres du cylindre gradué de 250 millilitres très légèrement.Tapotez le cylindre cinq à dix fois contre un tampon en mousse à cellules closes avec une force suffisante pour déplacer les mouches vers la surface intérieure du fond. Ensuite, utilisez l'autre main pour appuyer sur l'enregistrement de la caméra. Puis, pendant l'enregistrement, tapez six fois sur le cylindre selon un motif nettement non rythmique.Effectuez chaque essai pendant deux minutes à partir du moment où les mouches sont tapotées pour la dernière fois. Enfin, éliminez les mouches dans de l’éthanol à 95 %. Une fois l’essai terminé, répétez ce test d’escalade 10 fois en utilisant à chaque fois 20 mouches fraîches afin de détecter de légères différences de locomotion entre les groupes.Lavez les cylindres dans un lave-vaisselle et faites-les sécher toute la nuit afin de pouvoir les réutiliser une fois l'expérience terminée. Pour analyser la performance des mouches, commencez par visionner les vidéos de chaque essai enregistré. Comptez le nombre total de mouches qui franchissent la ligne cible toutes les 10 secondes. Si une mouche redescend ou tombe, enregistrez-la comme moins un et comptez la mouche suivante qui franchit la ligne cible comme le même nombre que la mouche qui est redescendue ou est tombée.Par exemple, si la 15e mouche se situe en dessous de la ligne cible, la mouche suivante qui franchit la ligne est considérée comme la 15e mouche et non comme la 16e. Ensuite, soustraire la mortalité du nombre total de mouches pour obtenir le nombre de mouches restant dans la parcelle expérimentale. Le pourcentage de mouches situées au-dessus de la ligne cible à chaque point temporel permet, lorsqu'on travaille avec des mutations sévères, d'observer différents degrés de défaut de grimpe à l'aide de différents tests de grimpe.Ici, le nombre de mouches âgées de huit jours ayant grimpé au sommet d'un flacon vide de milieu alimentaire après 18 secondes a été enregistré, ne montrant aucune différence significative dans le comportement d'escalade entre les deux groupes. En revanche, en utilisant le test d'escalade décrit dans ce protocole, les mouches mutantes Bastin 17 tiret sept sur TM trois présentent un déficit de performance par rapport aux témoins. Étant donné que de nombreux troubles locomoteurs sont progressifs, il est important d'observer l'évolution des mouches au fil du temps.Au bout de deux jours, on observe une différence significative dans le nombre de mouches qui grimpent au-dessus de la ligne cible, par rapport aux témoins. Cette performance à la montée continue de diminuer au fur et à mesure que les mouches mutantes vieillissent, de deux à plusieurs jours.Une fois maîtrisés, cet expérience et cette analyse peuvent être réalisés en trois heures. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment quantifier les défauts locomoteurs dans les modèles mutants dola de troubles neurologiques.

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Comportement des dosages pour mesurer des fonctions locomotrices, l'apprentissage et les capacités de...

Déficits locomoteur Dosage, apprentissage et mémoire dans Drosophile Modèles de la neurodégénérescence

Cette vidéo décrit une méthode simple pour quantifier la locomotion des mouches et montre le test d’escalade effectué. Le test de montée à la mouche est un test général de la fonction motrice qui repose sur une réponse négative de la géotaxie.

Essai d’escalade à la mouche : une méthode pour tester la locomotion générale chez Drosophila melanogaster

Nous décrivons ici deux essais qui ont été mis en place pour étudier la neurodégénérescence liée à l'âge des neurones dopaminergiques (DA)...

Évaluer phénotypes neurodégénératives en<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurones dopaminergiques par des tests d&#39;escalade et IMMUNOCOLORATION du cerveau entier

Drosophile est largement utilisé en tant que système modèle pour étudier la neurodégénérescence. Ce protocole décrit un procédé par lequel une dégénérescence, comme déterminé par la formation de vacuoles dans le cerveau, peuvent être quantifiés. Il minimise également les effets dus à la procédure expérimentale par le traitement et le contrôle sectionner et les mouches expérimentales comme un échantillon.

Mass histologie à Quantifier neurodégénérescence<em&gt; Drosophila</em

Ce protocole étape par étape analyse le comportement de géotaxie négative de drosophile à l’aide d’un système automatisé de multicylindre qui héberge des centaines de mouches et synchronise leur action par un moteur électrique. Lors de la synchronisation, comportement de la mouche géotaxie négative est analysé, enregistrés numériquement et analysées en utilisant le logiciel RflyDetection individu-conçu.

Un dosage automatisé rapide géotaxie négative itérative pour analyser le comportement d’escalade adultes dans un modèle drosophile de la neurodégénérescence

Ce protocole met l’accent sur l’analyse quantitative de la complexité de l’arborisation dendritique neuronale (NDAC) chez la drosophile, qui peut être utilisé pour l’étude de la morphogenèse dendritique.

Analyse quantitative de la complexité d’arborisation dendritique neuronale chez la drosophile

Nous avons développé un workflow simple et adaptable pour extraire des données quantitatives d’études biologiques de fluorescence dotés d’imagerie cellulaire d’agrégation des protéines et du flux autophagie dans le système nerveux central de Drosophila modèles de neurodégénérescence.

Biologie cellulaire quantitative de neurodégénération chez la drosophile grâce à l’analyse impartiale des protéines fluorescent étiquetées à l’aide de ImageJ

Le but de cette procédure est de disséquer le tissu longitudinal dorsal (DLM) pour évaluer l’intégrité structurelle des jonctions neuromusculaires DLM (NMJs) dans les modèles de maladies neurodégénératives utilisant Drosophila melanogaster.

Visualisation de la dégénérescence synaptique chez les adultes Drosophila en association avec la neurodégénérescence

Le présent protocole évalue l’activité locomotrice de la drosophile en suivant et en analysant le mouvement des mouches dans une arène faite à la main à l’aide du logiciel open source Fiji, compatible avec des plugins pour segmenter les pixels de chaque image sur la base d’un enregistrement vidéo haute définition pour calculer des paramètres de vitesse, de distance, etc.

Une technique simple pour doser l’activité locomotrice chez la drosophile

Ce protocole présente un test de modélisation de la constipation dans un modèle de drosophile de la maladie de Parkinson à base d’alpha-synucléine.

Mesure de la constipation dans un modèle de la maladie de Parkinson chez la drosophile

Le protocole présente une méthode à haut débit et rentable pour évaluer la neurotoxicité chez la mouche des fruits grâce à la quantification de la dysfonction locomotrice comme alternative aux modèles traditionnels de mammifères. Il vise à évaluer les effets neurotoxiques de composés pharmaceutiques, d’agents environnementaux ou de modifications génétiques à l’aide d’un modèle sensible, reproductible et éthiquement favorable.

Analyse comportementale de la dysfonction locomotrice chez Drosophila melanogaster comme lecture de la neurotoxicité

Découvrez l'analyse quantitative des défauts d'escalade chez Drosophila melanogaster pour étudier les maladies neurodégénératives. Cette méthode détecte les déficits locomoteurs légers et aide à identifier les interactions génétiques et cibles thérapeutiques.

Analyse quantitative des défauts d'escalade dans un modèle drosophile de maladies neurodégénératives

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