Isolement d'anticorps murins péritonéale macrophages pour effectuer Analyse expression génique Sur Toll-like récepteurs Stimulation

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les macrophages péritonéaux murins et d’effectuer une analyse de l’expression génique lors de la stimulation de récepteurs de type Toll. Ceci est accompli en injectant d’abord. 3,8 % de Brewer Thi Glyco milieu dans la cavité péritonéale de la souris pour augmenter la migration des monocytes dans le péritoine et donc augmenter le rendement en macrophages après trois jours, euthanasier la souris et injecter une solution saline tampon de phosphate ECCOs froid dans la cavité péritonéale pour récolter les cellules.

Après un massage doux sur la cavité péritonéale, le liquide péritonéal est soigneusement aspiré. Ensuite, les cellules obtenues sont cultivées et les macrophages péritonéaux provoqués sont caractérisés par cytométrie en flux. La dernière étape consiste à stimuler ces macrophages avec différents ligands de récepteur de type Toll ou TLR et à isoler l’ARN des échantillons.

En fin de compte, la réaction en chaîne de la polymérase quantitative par transcriptase inverse est utilisée pour mesurer l’expression du gène d’intérêt. Le but de la procédure suivante est d’isoler, en miroir des microphages péritonéaux, à l’aide du milieu de brassage TIO glycol. Ce milieu augmentera la migration des monocytes dans le péritoine et augmentera donc le rendement en microphages.

Une fois isolés, les microphages seront stimulés avec différents ligands de récepteurs de type Toll pour étudier la régulation moléculaire de l’hepcidine en tant que gène de Pinterest. Pour commencer, préparez le milieu bio glyco huit à 3,8 % de brasseur comme décrit dans le protocole textuel à l’aide de seringues d’un millilitre attachées à des aiguilles de calibre 23. Injectez un millilitre de milieu bio glycol eight à 3,8 % dans la cavité péritonéale de chaque souris et attendez trois jours.

Utilisez une nouvelle seringue et une nouvelle aiguille pour chaque souris après l’anesthésie et l’euthanasie de la souris comme décrit dans le protocole de texte, trempez l’abdomen de chaque souris avec de l’éthanol à 70 %. Effectuez une incision latérale le long de la ligne médiane inférieure du péritoine avec des ciseaux. À l’aide d’une pince, tirez la peau abdominale vers l’arrière et exposez la peau péritonéale transparente.

Injectez ensuite cinq millilitres de solution saline tamponnée au phosphate ECCO froid dans la cavité péritonéale de chaque souris avec des seringues de cinq millilitres attachées à des aiguilles de calibre 20. Effectuez un massage doux sur la cavité péritonéale puis aspirez soigneusement le liquide sans perforer aucun organe. Retirez l’aiguille et distribuez le liquide péritonéal dans des tubes à centrifuger coniques de 50 millilitres.

Ensuite, centrifugez le liquide péritonéal collecté pendant 10 minutes à 400 fois G ou 1500 RPM dans une centrifugeuse réfrigérée, les cellules doivent être maintenues froides tout au long de la procédure. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans le milieu RPMI 1640. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules et ajustez les échantillons à une densité cellulaire de 1 million de cellules par millilitre.

Caractériser le phénotype des cellules isolées par cytométrie en flux pour confirmer l’enrichissement en macrophages. En utilisant 1 million de cellules par souris et des anticorps contre le F quatre 80, qui est un antigène de surface exprimé directement sur les macrophages. Après l’isolement, ajoutez 1 million de cellules dans chaque puits d’un six.

Assiette de puits. Laissez les macrophages péritonéaux murins adhérer aux puits en les cultivant pendant une à deux heures à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, retirez les cellules non adhérentes en observant doucement trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate chaud.

Ajoutez ensuite 900 microlitres de DMEM sans sérum aux cellules. Préparez 10 x solutions mères de chaque récepteur de type Toll ou ligand TLR comme indiqué dans le protocole de texte. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solutions mères dans chaque puits, effectuant ainsi une culture de dilution décuplée.

Les cellules pendant 24 heures en présence des ligands TLR. Pour effectuer d’abord l’isolement de l’ARN, retirez tout le milieu et lycez les cellules directement dans les plaques à six puits. En ajoutant un millilitre de réactif de triol dans chaque puits et en passant plusieurs fois le lysat cellulaire à l’aide d’une pipette.

Ensuite, incubez les échantillons homogénéisés pendant cinq à 10 minutes à température ambiante pour permettre la dissociation complète des complexes de protéines nucléaires. Après l’incubation, transférez le lysat dans des microtubes à centrifuger de 1,5 millilitre d’ARN et d’ADN, et ajoutez 0,2 millilitre de chloroforme pour un millilitre de réactif de triol. Secouez vigoureusement les tubes à la main pendant 15 secondes avant de les incuber à température ambiante pendant cinq à 10 minutes.

Ensuite, centrifugez à 12 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Observez le mélange se séparer en une phase inférieure de phénol chloroforme rouge, une interphase et une phase aqueuse supérieure incolore. L’ARN reste exclusivement en phase aqueuse.

Transférez soigneusement la phase aqueuse supérieure dans un tube frais sans perturber la phase interphase. Faites précipiter l’ARN de celui-ci en le mélangeant avec 0,5 millilitre d’alcool isopropylique après avoir incubé les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Centrifuger à 12 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

L’ARN précipite en formant une pastille blanche sur le côté et le fond du tube. Retirez le surnageant et lavez la pastille d’ARN une fois avec un millilitre d’éthanol à 75 %. Mélanger les échantillons par vortex, puis centrifuger à 7 500 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Après avoir retiré le surnageant, faites sécher brièvement l’ARN à l’air libre pendant 10 minutes. Dissoudre ensuite l’ARN dans 100 microlitres d’eau libre d’ARN et incuber pendant 10 minutes à 55 degrés Celsius. Ensuite, quantifiez l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre.

Diluez les échantillons 100 fois dans de l’eau exempte d’ARN et lisez-les à des longueurs d’onde de 260 nanomètres, égalisez les concentrations d’ARN et synthétisez le CD NA selon les instructions du fabricant. Utilisation du système R-T-P-C-R pour le kit de synthèse NA CD premier brin. Mesurez ensuite les niveaux de Mr.NA génique par PCR en temps réel dans un système de détection d’ADN en temps réel, en normalisant les niveaux d’expression génique avec deux gènes de maintenance.

Les macrophages péritonéaux isolés en miroir ont été caractérisés par cytométrie en flux afin de déterminer le pourcentage de macrophages isolés et de les distinguer parmi les cellules obtenues au cours du processus d’isolement. Le pourcentage de cellules exprimant l’antigène F quatre 80 s’est toujours avéré supérieur à 95 %. Les cellules isolées ont ensuite été traitées avec plusieurs ligands TLR et de l’ARNm. Les niveaux d’hepcidine ont été mesurés par les récepteurs R-T-P-C-R tolike un et deux, le récepteur tolike quatre.

Un récepteur olique à six et deux ligands étaient capables de stimuler l’ARNm de l’hepcidine dans les macrophages miroirs. L’ensemble de ces résultats démontre l’utilité de ce protocole pour isoler avec succès les macrophages péritonéaux et pour étudier précisément la régulation moléculaire de l’expression des gènes. Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la façon d’isoler, d’identifier et de cultiver des macrophages péritonéaux miroirs.