Name: Analyse des fonctions des mastocytes in vivo à l’aide de sourisknock-inde mastocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Découvrez l'analyse des fonctions des mastocytes in vivo par génération de mastocytes dérivés de la moelle osseuse et greffe dans des souris déficientes. Cette méthode permet d'évaluer leur phénotype et distribution.

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N.G. est récipiendaire de bourses de la Français Fondation pour la Recherche Médicale FRM et de la Fondation Philipp ; R.S. est soutenu par la Fondation Lucile Packard pour la santé des enfants et le numéro de prix CTSA nih/NCRR de Stanford UL1 RR025744; P.S. est soutenu par une bourse Max Kade de la Fondation Max Kade et de l’Académie autrichienne des sciences et une bourse Schroedinger du Fonds autrichien pour la science (FWF): J3399-B21; S.J.G. remercie le soutien des national institutes of health subventions U19 AI104209, NS 080062 et du programme de recherche sur les maladies liées au tabac de l’Université de Californie; L.L.R. reconnaît le soutien de la Fondation nationale de la recherche sur l’arthrite (ANRF) et de la subvention K99AI110645 des National Institutes of Health.

Tous les soins et expérimentations sur les animaux ont été menés conformément aux directives des National Institutes of Health et avec l’approbation spécifique du Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université Stanford.
1. Génération et caractérisation de mastocytes cultivés dérivés de la moelle osseuse (BMCMC).
Remarque : Les BMCMC donneurs doivent être générés à partir de cellules de moelle osseuse du même fond génétique que les souris mc-déficientes réceptrices. Les BMCMC de donneurs d’origine mâle ne conviennent pas à la greffe de souris femelles. les BMCMC donneurs d’origine féminine se grefferont avec succès dans les receveurs masculins et féminins.
<ol><li>Extraction de la moelle osseuse.<ol>
<li>Verser une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) dans une plaque de culture de 6 puits (1 puits par souris) et la placer sur de la glace.</li>
		<li>Trempez les instruments de dissection dans de l’éthanol à 70% pour la stérilisation.</li>
		<li>Euthanasier les souris donneuses par inhalation de dioxyde de carbone (CO2)suivie d’une luxation cervicale, puis vaporiser de l’éthanol à 70% sur les sites de manipulation.</li>
		<li>Utilisez des instruments de dissection stériles pour extraire les os du fémur, du tibia et du péroné sans couper les épiphyses osseuses.</li>
		<li>Tout en fixant les os avec une pince, grattez tout le tissu des os (et jetez le péroné) à l’aide de ciseaux stériles (ou de lames de scalpel). Placer les os dans le PBS sur de la glace jusqu’à ce que tous les os soient recueillis.</li>
		<li>Effectuez toutes les étapes restantes dans la hotte de culture de tissus stériles. À l’aide d’instruments stériles, fixez les os avec une pince et coupez les deux épiphyses pour exposer la cavité médullaire.</li>
		<li>À l’aide de seringues de 3 ml et d’aiguilles de 30 G, et d’un milieu de rinçage à froid (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] complété par 10 % de sérum de veau fœtal [FCS, inactivé par la chaleur], de L-glutamine à 2 mM, de solution antibiotique-antimycostique à 1 %, de 50 μM de B-mercaptoéthanol), rincer la moelle osseuse rouge dans une boîte de Petri.</li>
		<li>Utilisez la même seringue pour dissocier les grappes de cellules de moelle osseuse rincées par aspiration douce répétée et éjection.</li>
		<li>Regrouper la moelle osseuse fémorale et tibiale de chaque souris dans un tube de centrifugation de 15 ml. Remplissez le tube d’un milieu de rinçage à froid pour laver les cellules de la moelle osseuse et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Culture BMCMC.<ol>
<li>Enlever le surnageant et récupérer les cellules granulées de la moelle osseuse dans 10 ml de milieu de culture (DMEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal [FCS, inactivé par la chaleur], 2 mM de L-glutamine, 1 % de solution antibiotique-antimycotique, 50 μM de B-mercaptoéthanol et 20 % de milieu cellulaire WEHI-3 [comme source d’IL-3; utilisez alternativement l’IL-3 recombinant de souris à 10 ng/ml]).</li>
		<li>Placer les cellules dans une fiole de culture tissulaire de taille appropriée(p. ex.T25 pour 1 souris, T75 pour 2 souris, etc.).</li>
		<li>1 à 2 jours après le placage des cellules, transférer le milieu et les cellules de suspension (laissant les débris et les cellules adhérentes coller au fond du ballon) dans une nouvelle fiole et ajouter du milieu de culture frais (10 ml/souris).</li>
		<li>Au cours des semaines suivantes, les cellules d’alimentation tous les 3-4 jours (ajouter 10 ml de milieu de culture par souris). Maintenir la densité cellulaire entre 2,5 x 105-1 x 106 cellules/ml. Transférer les cellules non adhérentes dans une nouvelle fiole une fois par semaine jusqu’à ce qu’aucune cellule adhérente ne soit présente dans la fiole de culture. Tester la maturité des cellules (voir ci-dessous) avant utilisation pour des essais in vitro ou une greffe chez des souris déficientes en MC. REMARQUE: La différenciation complète des BMCMC prendra 4-6 semaines.</li>
	</ol></li>
	<li>Évaluation de la maturité de la BMCMC.<ol>
<li>
Utilisation de la cytométrie de flux.
		<ol>
<li>Cellules de lavage (5 x 104-5 x 105 cellules/condition) avec tampon FACS glacé (PBS, 0,5% FCS) dans un tube de fond rond en polystyrène de 5 ml. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Surnageant aspiré.</li>
			<li>Diluer les anticorps monoclonaux anti-souris CD16/32 (clone 93 ou 2.4G2) 1:200 (2,5 μg/ml) dans le tampon FACS. Ajouter 10 μl à chaque pastille et la remise en suspension par un bref vortex. Incuber 5 min sur la glace pour bloquer la liaison Fc. Remarque : Protégez les échantillons de la lumière directe pour toutes les étapes restantes.</li>
			<li>Diluer la phycoérythrine (PE) conjuguée anti-souris Fc εRI α (clone MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) et isothiocyanate de fluorescéine (FITC) conjuguée contre la souris KIT (CD117; clone 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) (« solution de coloration »), ou les anticorps de contrôle d’isotype marqués respectifs dans le tampon FACS (« solution de contrôle d’isotype »).</li>
			<li>Diviser la moitié des cellules bloquées de l’étape 1.3.1.2) dans un tube de fond rond supplémentaire en polystyrène et ajouter 20 μl de « solution de coloration » dans un tube et 20 μl de « solution de contrôle d’isotype » dans l’autre tube. Incuber 30 min sur la glace.</li>
			<li>Ajouter 3 ml de tampon FACS glacé et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et le ressusciter dans un tampon FACS de 300 μl contenant 1 μg/ml d’iodure de propidium (IP, pour l’identification des cellules mortes). Procéder à l’analyse de cytométrie de flux (voir figure 2A).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilisation de coloration bleue à la toluidine.<ol>
<li>Laver 1 x 105 cellules une fois avec du PBS par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à température ambiante, puis aspirer et ressusciter les cellules dans 200 μl de PBS.</li>
			<li>Transférer la suspension cellulaire dans un cytofunnel préparé attaché à une lame de microscope et procéder à la cyto-centrifugation à l’aide d’une cytocentrifugation (40 x g pendant 5 min).</li>
			<li>Lames sèches à l’air pendant 10 min et dessinez un cercle de cire autour des cellules à l’aide d’un stylo PAP. Ajouter 0,1% de solution bleue de toluidine pour couvrir les cellules. Incuber pendant 1 min. Lavez les lames dans l’eau courante du robinet pendant 1 min, puis les toboggans secs à l’air pendant 10 min.</li>
			<li>Cellules de lamelle de couverture utilisant un support de montage. Procéder à l’analyse au microscope optique (voir figure 2B)</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Greffe de souris mastocytaires déficientes avec BMCMC.
<ol><li>Greffe d’oreille par injection intradermique (i.d.). REMARQUE: Pour le transfert adoptif de BMCMC dans les pennes d’oreille de souris déficientes en MC, nous vous recommandons d’effectuer deux injections de 1 x10 6 cellules chacune (pour un total de 2 x 106 cellules) par penne d’oreille. L’engraftment intradermique de BMCMC dans les pennes d’oreille de souris mc-déficientes a été employé par de nombreux investigateurs dans plusieurs modèles, y compris des modèles d’anaphylaxie cutanée passive (PCA)24,27, défense de l’hôte contre des venins28, et des réactions d’hypersensibilité chronique (CHS)29,30.<ol>
<li>Compter et ressusciter les cellules à 4 x 107 BMCMC/ml (1 x 106 BMCMC/25 μl) dans le DMEM froid. Transférer la solution BMCMC dans une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de 30 G. Conserver sur la glace jusqu’à l’injection.</li>
		<li>Anesthésier des souris MC-déficientes de 4 à 6 semaines à l’aide d’isoflurane (2,5 % v/v). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par pincement des pieds, ajustez l’isoflurane si cela est indiqué et continuez à surveiller la respiration et la réponse au pincement des pieds tout au long de la procédure. Appliquez une pommade ophtalmique avec un Q-tip pour prévenir la sécheresse des yeux.</li>
		<li>Avec l’index, créez une pression verticale sur la face dorsale du penne de l’oreille pour exposer et étirer la face ventrale.</li>
		<li>Effectuer deux injections de 25 μl i.d. de solution BMCMC dans deux sites différents de la face ventrale du penne de l’oreille, la première injection au milieu de l’oreille et la deuxième injection vers l’extrémité du penne de l’oreille. Attendez 4-6 semaines après la greffe d’i.d. avant d’effectuer des expériences in vivo. Remarque: Dans notre expérience, à ce moment-là, le nombre de MCs/mm2 de derme dans la partie centrale du penne de l’oreille est généralement similaire à celui de l’emplacement correspondant chez les souris de type sauvage, tandis que le nombre de MCs/mm2 dans la périphérie des pennes de l’oreille sont généralement sensiblement inférieurs à ceux des souris de type sauvage correspondantes 27,28. Ceci devrait être gardé à l’esprit lors de la conception des expériences avec de telles souris MC-greffées(par exemple,des agents avec des effets possibles sur la fonction mc devraient être injectés dans la partie centrale des pennes d’oreille, et l’analyse des effets de tels traitements devrait également se concentrer sur cette zone).</li>
	</ol></li>
	<li>Engraftment péritonéal de cavité par l’injection intrapéritonéale (i.p.). REMARQUE: Le transfert adoptif de BMCMC dans la cavité péritonéale des souris déficientes en MC nécessitera une injection de 2 x 106 cellules par souris. De telles injections i.p. de BMCMC chez des souris déficientes en MC ont été utilisées par de nombreux groupes pour étudier les rôles des MC dans divers modèles, y compris des modèles de défense de l’hôte contre les venins31 ou la septicémie bactérienne32,33.<ol>
<li>Comptez le nombre approprié de cellules et ressuscitez à 1 x 107 BMCMC/ml (2 x 106 BMCMC/200 μl) dans du DMEM froid. Transférer la solution BMCMC dans une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de 25 G. Conserver sur la glace jusqu’à l’injection.</li>
		<li>Effectuer 1 injection de solution bmcmc de 200 μl dans la cavité péritonéale de souris déficientes en MC de 4 à 6 semaines. Attendez 4-6 semaines après la greffe d’i.p. avant d’effectuer des expériences in vivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Greffe par injection intraveineuse (i.v.). REMARQUE: Le transfert adoptif de BMCMC par injection i.v. dans des souris déficientes en MC nécessitera une injection de 5 x 106 cellules par souris. Des injections intraveineuses (i.v.) de BMCMC chez des souris déficientes en MC ont été utilisées par de nombreux groupes pour étudier les rôles des MC dans divers modèles de maladies, y compris les modèles d’infection de la vessie34,d’asthme35,de fibrose pulmonaire36et d’arthrite médiée par les anticorps37.<ol>
<li>Comptez le nombre approprié de cellules et ressuscitez à 2,5 x 107 BMCMC/ml (5 x 106 BMCMC/200 μl) dans le DMEM froid. Transférer la solution BMCMC dans une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de 30 G. Conserver sur la glace jusqu’à l’injection.</li>
		<li>Anesthésier des souris MC-déficientes de 4 à 6 semaines à l’aide d’isoflurane (2,5 % v/v). Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par pincement des pieds, ajustez l’isoflurane si cela est indiqué et continuez à surveiller la respiration et la réponse au pincement des pieds tout au long de la procédure. Appliquez une pommade ophtalmique avec un Q-tip pour prévenir la sécheresse des yeux.</li>
		<li>Effectuer une injection de 200 μl de solution BMCMC dans la veine caudale (ou, alternativement, la veine rétro-orbitale) d’une souris déficiente en MC. Attendez 12 semaines après la greffe d’i.v. avant d’effectuer des expériences in vivo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analyse des souris déficientes en mastocytes greffées.
<ol><li>Analyse d’engraftment d’oreille.<ol>
<li>À la fin de l’expérience, euthanasier les souris par inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale.</li>
		<li>Isoler les pennes de l’oreille et fixer dans 10 % (vol/vol) de forcine tamponnée pendant la nuit à 4 °C. Incorporez des pennes d’oreille fixes dans de la paraffine, coupez des sections de pennes d’oreille de 4 μm et montez sur des lames de verre.</li>
		<li>Colorer les lames avec une solution bleue de toluidine à 0,1% pendant 1 min à température ambiante. Lavez les lames à l’eau du robinet pendant 1 min, puis les lames sèches à l’air pendant 10 min à température ambiante.</li>
		<li>Lames de couverture à l’aide d’un support de montage, puis comptez le nombre de MC greffés par sections de pennes à l’aide d’un microscope optique. Évaluer l’efficacité de l’engraftment en comparant le pourcentage et la distribution des MC dans la peau de l’oreille des souris greffées par rapport aux souris de type sauvage.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse péritonéale d’engraftment de cavité.<ol>
<li>Évaluation du nombre de mastocytes dans la cavité péritonéale.<ol>
<li>À la fin de l’expérience, euthanasier les souris par inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale. Retirez soigneusement la peau ventrale des souris sans casser la cavité péritonéale.</li>
			<li>Injecter 5 ml de PBS froid ou à température ambiante dans la cavité péritonéale à l’aide d’une seringue de 5 ml équipée d’une aiguille de 25 G. Utilisez le PBS froid pour réduire le risque d’activation des cellules péritonéales (ceci est très important lors de l’évaluation de la dégnulation péritonéale de MC ou des niveaux de certains produits dérivés de MC dans le liquide de lavage péritonéal). Effectuez un massage de l’abdomen pendant 20 secondes pour récolter les cellules péritonéales.</li>
			<li>Aspirer lentement le lavage péritonéal à l’aide d’une seringue de 5 ml équipée d’une aiguille de 22 G. Enregistrer le volume de lavage aspiré (attendez-vous à récupérer jusqu’à 80% du volume injecté).</li>
			<li>Transférer le liquide de lavage péritonéal dans un tube de fond rond en polystyrène de 5 ml et centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Surnageant aspiré. Récupérer la pastille dans du PBS froid de 400 μl.</li>
			<li>Comptez le nombre total de cellules péritonéales à l’aide d’une chambre d’hémocytomètre. Utiliser la moitié de la suspension cellulaire pour une analyse cytométrique en flux (comme décrit à l’étape 1.3.1), afin d’évaluer le pourcentage et l’expression marqueur des MC greffés dans la cavité péritonéale. Multipliez le nombre total de cellules péritonéales par le pourcentage de MC pour obtenir le nombre absolu de MC péritonéaux.</li>
			<li>Effectuer une cytocentrifugation avec les cellules restantes comme décrit à l’étape 1.3.2.2. Sécher à l’air les lames pendant 10 min à température ambiante et dessiner un cercle de cire autour des cellules à l’aide d’un stylo PAP.</li>
			<li>Couvrir les cellules avec une solution de coloration May-Grünwald non diluée pendant 5 min, suivie d’un lavage en PBS pendant 5 min, les deux à température ambiante. Couvrir les cellules avec la tache giemsa diluée 1:20 avec de l’eau désionisée et incuber 20 min à température ambiante. Lavez les lames 2 fois dans l’eau du robinet pendant 1 min, puis les lames sèches à l’air.</li>
			<li>Cellules de lamelle à l’aide d’un support de montage, et calculer le pourcentage de MC greffés à l’aide d’un microscope optique (en comptant au moins 400 cellules totales). Évaluer l’efficacité de l’engraftment en comparant le pourcentage de MC dans le lavage péritonéal des souris greffées par rapport aux souris de type sauvage.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Évaluation des mastocytes dans les fenêtres mésentériques.<ol>
<li>Suite au lavage péritonéal décrit à l’étape 3.2.1, ouvrir la membrane péritonéale pour exposer le tractus intestinal des souris. Disposez 4 à 5 fenêtres mésentériques par souris sur une diapositive.</li>
			<li>Fixer les lames pendant 1 heure dans une solution de carnoy (3:2:1 vol/vol/vol d’éthanol, de chloroforme et d’acide acétique glacial) à température ambiante. Sécher à l’air les lames et enlever l’intestin (les fenêtres mésentériques fixes resteront attachées aux lames).</li>
			<li>Colorer les préparations pendant 20 min à température ambiante avec la solution de coloration Csaba (bleu Alcian/Safranin O).<ol>
<li>Pour faire 500 ml de coloration Csaba, préparer 500 ml de tampon acétate en mélangeant 100 ml de solution d’acétate de sodium 1 M avec 120 ml de HCl 1 M. Porter jusqu’à 500 ml avec de l’eau désionisée et ajuster le pH à 1,42. Ensuite, dissoudre 90 mg de Safranin [identifie les « MC matures » en rouge], 1,8 g de bleu d’Alcian [identifie les « MC immatures » en bleu] et 2,4 g de sulfate d’ammonium ferriqueNH4Fe(SO(SO)2dans 500 ml de tampon acétate.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Lames de couverture à l’aide d’un support de montage, puis comptez le nombre de MC greffés par fenêtre mésentérique à l’aide d’un microscope optique. Évaluer l’efficacité de l’engraftment en comparant le pourcentage et la distribution des MC dans les fenêtres mésentériques des souris greffées par rapport aux souris de type sauvage.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse de l’engraftment I.v.<ol>
<li>À la fin de l’expérience, euthanasier les souris par inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale, et prélever les tissus d’intérêt(par exemple, poumon, peau ou rate) et fixer pendant la nuit dans 10 % (vol/vol) de fortérine tamponnée à 4 °C.</li>
		<li>Incorporez des tissus fixes dans de la paraffine, coupez des sections de 4 μm et montez sur des lames de verre. Colorer les lames avec une solution bleue de toluidine à 0,1% pendant 1 min à température ambiante. Lavez les lames à l’eau du robinet pendant 1 min, puis les lames sèches à l’air pendant 10 min.</li>
		<li>Lames de couverture utilisant le support de montage et évaluer le nombre et la distribution de MCs greffés par sections de tissu utilisant un microscope de lumière.</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Près de 30 ans après sa description initiale38, l’approche «mastocyte knock-in» continue de fournir des informations précieuses sur ce que les MC peuvent faire ou ne peuvent pas faire in vivo. Les fonctions de MCs ont été longtemps pensées pour être limitées à leur rôle dans l’allergie. Les données générées à l’aide de l’approche «mastocyte knock-in» ont changé ce point de vue, en fournissant des preuves que les MC peuvent, entre autres fonctions, jouer des rôles critiques dans la dé...

Les mastocytes (MC) sont des cellules hématopoïétiques qui proviennent de progéniteurs pluripotents de moelle osseuse1-3. Après l’évacuation de la moelle osseuse, les progéniteurs des MC migrent dans divers tissus où ils se développent en MC matures sous l’influence des facteurs de croissance locaux1-3. Les MC résidants dans les tissus sont stratégiquement situés aux interfaces hôte-environnement, telles que la peau, les voies respiratoires et le tractus gastro-intestinal, où ils se comportent comme une première ligne de défense contre les insultes externes3-6. Les MC sont souvent sous-classés en fonction de leurs caractéristiques phénotypiques « de base » et de leurs emplacements anatomiques. Chez la souris, deux types de MC ont été décrits: les MC de type « tissu conjonctif » (CTMCs) et les MCs muqueux (MMCs)1-3,7,8. Les CTMCs sont souvent situés autour des veinules et près des fibres nerveuses, et résident dans les cavités sérales, tandis que les MMC occupent des emplacements intraépithéliaux dans l’intestin et la muqueuse respiratoire1-3.
De nombreuses méthodologies ont été appliquées pour étudier les fonctions biologiques des MC9-13. De nombreux groupes se sont concentrés sur des approches in vitro utilisant soit des lignées cellulaires (telles que les lignées MC humaines HMC114 ou LAD215,16),des MC dérivées in vitro (telles que les MC17dérivées du sang périphérique humain, ou des MC cultivés dérivés de la moelle osseuse de souris [BMCMC]18,des MC cultivés dérivés de la peau fœtale [FSCMC]19 et des MC dérivés de cellules péritonéales [PCMC]20) ou des MC isolés ex vivo provenant de différents sites anatomiques. Tous ces modèles sont largement utilisés pour étudier les détails moléculaires de la biologie de MC, tels que les voies de signalisation impliquées dans l’activation de MC. Cependant, un aspect important de la biologie des MC est que leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles(par exemple,la teneur en protéase des granules cytoplasmiques ou la réponse à différents stimuli) peuvent être modulées par localisation anatomique et microenvironnement2,7. Étant donné que le mélange exact de tels facteurs rencontrés in vivo peut être difficile à reproduire in vitro,nous privilégions l’utilisation d’approches in vivo pour obtenir des informations sur les fonctions des MC9.
Il existe plusieurs souches de souris présentant une déficience génétique en MC, telles que les souris WBB6F1-Kit W/W-v ou C57BL/6-Kit W-sh/W-sh largement utilisées. Ces souris manquent d’expression et/ou d’activité de KIT (CD117), le récepteur du principal facteur de cellules souches de facteur de croissance MC (SCF)21,22. En conséquence, ces souris ont un déficit profond en MC mais ont également des anomalies phénotypiques supplémentaires liées à leurs mutations c-kit (chez les souris WBB6F1-Kit W/W-v) ou aux effets de la grande inversion chromosomique qui entraîne une réduction de l’expression duc- kit (chez les souris C57BL/6- Kit W-sh/W-sh) 9,10,12,23. Plus récemment, plusieurs souches de souris présentant un déficit constitutif indépendant de MC enc- kitont été signalées24-26. Toutes ces souris et quelques nouveaux types supplémentaires de souris inductibles mc-déficientes ont été récemment examinés en détail9,10,13.
Ici, nous décrivons des méthodes pour la génération de MCs cultivés moelle-dérivés de souris (BMCMCs), leur transfert adoptif dans les souris MC-déficientes, et l’analyse des nombres et de la distribution de MCs adoptivement transférés à différents emplacements anatomiques. Cette méthode dite de « mastocyte knock-in » peut être utilisée pour évaluer les fonctions des MC et des produits dérivés de MC in vivo. Nous discutons des avantages et des limites de cette méthode, à la lumière des approches alternatives qui ont été développées ces dernières années.

<table><tbody><tr><td>Solution antibiotique-antimycosique à 1 %</td><td>Corning cellgro</td><td>30-004-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 3 ml</td><td>Falcon</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Plat</td><td>Corning cellgro</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Tube à fond rond en polystyrène</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A35-500</td><td></td></tr><tr><td>Bleu Alcian 8GX</td><td>Rowley Biochemical Danver</td><td>33864-99-2</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 6R Centrifugeuse</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD16/32 (clone 93) Purified</td><td>eBioscience</td><td>14-0161-81</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 ml TB Seringue</td><td>BD 309659</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD 22 G x 1 (0,7 mm x 25 mm) Aiguilles</td><td>BD Aiguille Precision Glide</td><td>205155</td><td></td></tr><tr><td>BD 25 G 5/8 Aiguilles</td><td>BD Seringue</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BD 30 G x 1/2 Aiguilles</td><td>BD Precision Glide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Blue MAX Jr, 15 ml Tube conique en polypropylène</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60 Medium de montage</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin3</td><td>Shandon</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Stylo DakoCytomation</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>15-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E 7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum Inactivated à la chaleur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135-500ml</td><td></td></tr><tr><td>FITC Conjugué IgG2B K Rat Isotype Control</td><td>eBioscience</td><td>14-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocyanate de fluorescéine (FITC) KIT anti-souris conjugué (CD117 ; clone 2B8)</td><td>eBioscience</td><td>11-1171-82</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>Coloration Giemsa Modifié</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GS-1L</td><td></td></tr><tr><td>Isothésie</td><td>Henry Schein Santé animale</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald Stain</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MG-1L</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 6 puits plaques</td><td>Falcon</td><td>35 3046</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX60 Microscope</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td><td>Fisher Brand</td><td>23-021-400</td><td></td></tr><tr><td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td><td>eBioscience</td><td>12-4888-81</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Tamponné-Saline (PBS) 1x</td><td>Corning cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Phycoérythrine (PE) Conjuguée Anti-souris FceRIa (clone MAR-1)</td><td>eBioscience</td><td>12-5898-82</td><td></td></tr><tr><td>Solution de coloration à l’iodure de propidium</td><td>eBioscience</td><td>00-6990-50</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Certifié Safranin-o</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8884</td><td></td></tr><tr><td>Fioles de culture tissulaire T25 25 cm2</td><td>Beckton Dickinson</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>Fioles de culture tissulaire T75 75 cm2</td><td>Beckton Dickinson</td><td>353110</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de toluidine 1 % aqueux</td><td>LabChem-Inc</td><td>LC26165-2</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des fonctions des mastocytes in vivo à l’aide de sourisknock-inde mastocytes

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Les mastocytes (MC) sont des cellules hématopoïétiques qui résident dans divers tissus et sont particulièrement abondantes aux sites exposés à l’environnement externe, tels que la peau, les voies respiratoires et le tractus gastro-intestinal. Mieux connus pour leur rôle néfaste dans les réactions allergiques IgE-dépendantes, les MCs ont également émergé en tant qu’acteurs importants dans la défense de l’hôte contre le venin et envahissant les bactéries et les parasites. Le phénotype et la fonction de MC peuvent être influencés par des facteurs microenvironnementaux qui peuvent différer selon l’emplacement anatomique et/ou basé sur le type ou le stade de développement des réponses immunitaires. Pour cette raison, nous et d’autres avons favorisé les approches in vivo sur les méthodes in vitro pour mieux comprendre les fonctions mc. Ici, nous décrivons des méthodes pour la génération de MCs cultivés moelle-dérivés de souris (BMCMCs), leur transfert adoptif dans les souris génétiquement MC-déficientes, et l’analyse du nombre et de la distribution de MCs adoptivement transférés à différents emplacements anatomiques. Cette méthode, appelée l’approche« mastocyte knock-in », a été largement utilisée au cours des 30 dernières années pour évaluer les fonctions des MCcs et des produits dérivés de MC in vivo. Nous discutons des avantages et des limites de cette méthode, à la lumière des approches alternatives qui ont été développées ces dernières années.

Un aperçu de l’approche del’enramationdes mastocytes est montré à la figure 1,et comprend la génération de BMCMC, le nombre de cellules qui devraient être greffées i.p., i.d. ou i.v. dans des souris déficientes en MC (le nombre peut être varié si indiqué en fonction de la conception expérimentale) et l’intervalle entre la greffe et l’expérience en fonction du site d’injection (cet intervalle peut également varier, si indiqué; par exemple,le contenu des médiateurs stockés dans les granul...

Nous décrivons une méthode pour la génération des mastocytes dérivés in vitro, leur greffe en souris mastocytaires-déficientes, et l’analyse du phénotype, des nombres et de la distribution des mastocytes engrafted à différents emplacements anatomiques. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer les fonctions des mastocytes in vivo.

Analyse des fonctions des mastocytes in vivo à l’aide de sourisknock-inde mastocytes

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

L'objectif général de la méthode suivante est d'analyser les fonctions des mastocytes in vivo à l'aide de souris transgéniques pour les mastocytes. Cette approche consiste d'abord à générer des mastocytes cultivés dérivés de moelle osseuse, ou MC-BMO, destinés à être greffés dans des souris déficientes en mastocytes. Dans une deuxième étape, les MC-BMO sont transférés de façon adoptive dans différents sites anatomiques de souris déficientes en mastocytes afin de produire des souris transgéniques pour les mastocytes.En fin de compte, le nombre et la répartition anatomique des mastocytes transférés adoptivement sont évalués par cytométrie en flux et par analyse immunohistochimique afin d'apprécier dans quelle mesure les populations engraftées ressemblent à celles observées chez les souris de type sauvage. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'évaluation directe des fonctions des populations de cellules MA de type sauvage ou génétiquement modifiées in vivo. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules MA, notamment dans quelle mesure les cellules MA ou leurs produits peuvent contribuer aux caractérist

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Décrit ici est une technique dans laquelle lipopolysaccharide est injecté dans la glande mammaire en lactation de la souris via le mamelon pour simuler la mammite, une condition souvent causée par une infection bactérienne. Des résultats d'injection de lipopolysaccharide à l'augmentation du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) de signalisation, visualisé par l'imagerie de bioluminescence d'une souris NF-kB rapporteur de la luciférase.

Injection intra-canalaire de LPS comme un modèle de souris de la mammite: signalisation visualisée via un transgénique NF-kB Reporter

Cette vidéo présente un test colorimétrique pour déterminer l’activité de dégranulation des mastocytes. L’enzyme libérée par les mastocytes hydrolyse le substrat et produit un produit coloré. L’activité de dégranulation des mastocytes a été mesurée comme le pourcentage de libération d’enzymes à l’extérieur de la cellule normalisé avec la teneur totale en enzymes dans la cellule.

Essai de dégranulation des mastocytes pour étudier l’effet d’un produit chimique cible

Cette vidéo présente une méthode de lavage péritonéal pour isoler les mastocytes matures de type tissu conjonctif de la cavité péritonéale de souris adultes. Lors de l’isolement d’un mélange de cellules immunitaires primaires de la cavité péritonéale, la prolifération sélective des mastocytes est effectuée dans des conditions de culture appropriées.

Technique d’isolement des mastocytes primaires d’une cavité péritonéale murine

Les réponses allergiques, caractérisé par l'activation des mastocytes et des basophiles, sont entraînés par la reticulation d'IgE et la libération de médiateurs pro-inflammatoires. Une évaluation quantitative de réactions allergiques peut être obtenue en utilisant le colorant bleu d'Evans pour suivre l'évolution de la perméabilité vasculaire après provocation allergénique.

Mesure de l&#39;anaphylaxie locaux chez la souris

L'objectif du présent Protocole est de développer une méthode qui permettra aux analyses de génomique fonctionnelle de la sécrétion des mastocytes. Le protocole est basé sur l'évaluation quantitative de la libération d'un gène rapporteur fluorescent cotrasfected avec le gène d'intérêt et des analyses en temps réel de la morphologie du granule sécrétoire.

Enquête mât cellules sécrétoires granulés; de biosynthèse d&#39;exocytose

Ce protocole décrit la digestion enzymatique de la peau de souris dans un milieu riche en nutriments, suivie d’une séparation par gradient pour isoler les leucocytes.  Les cellules ainsi dérivées peuvent être utilisées pour diverses applications en aval. Il s’agit d’une alternative efficace, économique et améliorée aux machines de dissociation des tissus et aux protocoles de digestion tissulaire basés sur la trypsine et la dispase.

Isolement de leucocytes infiltrant de la peau de souris Utilisation de digestion enzymatique et séparation par gradient

Alors que les macrophages infiltrés sont continuellement recrutés sur les tissus adultes à partir de précurseurs circulants, les macrophages résidents sement leurs tissus pendant le développement, où ils sont maintenus sans autre contribution des progéniteurs. Les ancêtres des macrophages résidents ont récemment été identifiés. Ici, nous présentons des méthodes pour la cartographie du devenir génétique des progéniteurs résidents de macrophages.

Identification des progéniteurs érythromyélidiens et de leur descendance dans l&#39;embryon de souris par cytométrie de flux

Protocoles pour l’étude de l’aorte murin embryonnaire et périnatale à l’aide en vivo clonale analyse et cartographie sort, explants aortiques et muscle lisse isolé des cellules sont détaillées ici. Ces diverses approches facilitent l’enquête de la morphogenèse de l’aorte embryonnaire et périnatale dans le développement normal et la pathogenèse de la maladie.

À l’aide de In Vivo et tissulaire et cellulaire Explant approches à l’étude de la morphogénèse et la pathogenèse de l’aorte embryonnaire et périnatale

Nous présentons ici un protocole visant à isoler et à cultiver des mastocytes péritonéaux murines. Nous décrivons également deux protocoles pour leur caractérisation fonctionnelle : une imagerie fluorescente de concentration2 + Ca libre intracellulaire et un test de dégranulation issu de dosage colorimétrique de la β-hexosaminidase libéré.

Isolement des mastocytes dérivé de péritoine et leur caractérisation fonctionnelle avec Ca2 +-imagerie et des essais de dégranulation

Cet article décrit la procédure à suivre pour la préparation d'une version marquée par fluorescence du bactériophage lambda, l'infection...

Après Cell-sort<em&gt; E. coli</em&gt; Après infection par le phage Lambda

Découvrez l'analyse des fonctions des mastocytes in vivo par génération de mastocytes dérivés de la moelle osseuse et greffe dans des souris déficientes. Cette méthode permet d'évaluer leur phénotype et distribution.

Analyse des fonctions des mastocytes in vivo à l’aide de sourisknock-inde mastocytes

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