Analyse des fonctions des mastocytes in vivo à l’aide de sourisknock-inde mastocytes

L'objectif général de la méthode suivante est d'analyser les fonctions des mastocytes in vivo à l'aide de souris transgéniques pour les mastocytes. Cette approche consiste d'abord à générer des mastocytes cultivés dérivés de moelle osseuse, ou MC-BMO, destinés à être greffés dans des souris déficientes en mastocytes. Dans une deuxième étape, les MC-BMO sont transférés de façon adoptive dans différents sites anatomiques de souris déficientes en mastocytes afin de produire des souris transgéniques pour les mastocytes.

En fin de compte, le nombre et la répartition anatomique des mastocytes transférés adoptivement sont évalués par cytométrie en flux et par analyse immunohistochimique afin d'apprécier dans quelle mesure les populations engraftées ressemblent à celles observées chez les souris de type sauvage. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet l'évaluation directe des fonctions des populations de cellules MA de type sauvage ou génétiquement modifiées in vivo. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie des cellules MA, notamment dans quelle mesure les cellules MA ou leurs produits peuvent contribuer aux caractéristiques de modèles murins de processus physiologiques, immunologiques ou pathologiques, y compris des modèles de maladies humaines.

En général, les personnes apprenant cette méthode peuvent éprouver des difficultés car l'engraftement et le degré de déficience des mastocytes peuvent varier selon la méthode utilisée pour générer les CMC à partir de moelle osseuse, la voie d'injection, le nombre de CMC de moelle osseuse injectées et le nombre de semaines d'attente après l'engraftement avant de réaliser des expériences in vivo. Une démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car certains aspects de la procédure d'engraftement sont difficiles à assimiler sans en voir une exécution précise. Pour extraire la moelle osseuse dans un premier temps, utilisez des instruments de dissection stériles afin de prélever le fémur, le tibia et la fibula de souris de type sauvage sans endommager les épiphyses osseuses.

Au fur et à mesure que chaque os est disséqué, fixez-le avec une pince et grattez tous les tissus superflus. Ensuite, placez l'os dans du PBS sur de la glace. Lorsque tous les os ont été collectés, transférez-les dans une hotte de culture cellulaire stérile, puis, un par un, fixez chaque os avec une pince et sectionnez les deux épiphyses afin d'exposer les cavités médullaires. Ensuite, à l'aide de seringues de trois millilitres équipées d'aiguilles de 30 gauge et de milieu froid, rincez toute la moelle rouge de chaque os dans une nouvelle boîte de Pétri. Une fois que tous les os ont été rincés, utilisez la même seringue pour dissocier les agrégats cellulaires de la moelle osseuse par des aspirations et des éjections douces répétées.

Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Remplissez le tube avec du milieu de rinçage froid et centrifugez la suspension cellulaire. Resuspendez le culot cellulaire dans 10 millilitres de milieu de culture.

Ensuite, transférez les cellules de la moelle osseuse dans un flacon de culture tissulaire de taille appropriée. Après un à deux jours de culture, transférez les cellules non adhérentes dans un nouveau flacon avec 10 millilitres de milieu de culture frais par souris au cours des semaines suivantes. Alimentez les cellules tous les trois à quatre jours, comme cela vient d'être démontré.

Transférer les cellules non adhérentes dans un nouveau flacon une fois par semaine jusqu'à ce qu'il ne reste plus aucune cellule adhérente, pour la greffe intradermique dans l'oreille du pinner Resus. Suspendre les cellules BMC MC à raison de quatre fois dix puissance sept cellules par millilitre dans du DMEM froid. Ensuite, aspirer les cellules dans une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 30 et placer la seringue sur de la glace.

Ensuite, confirmer la profondeur adéquate de l'anesthésie par une pincée sur la patte antérieure d'une souris réceptrice âgée de quatre à six semaines et déficiente en mastocytes, puis appliquer une pommade ophtalmique avant d'injecter les cellules. Utiliser l'index pour exposer et tendre la face ventrale du pavillon de l'oreille, en exerçant une pression verticale sur la face dorsale de l'oreille. Puis administrer une injection intradermique de 25 µL contenant 1 × 10⁶ BMC MCs au milieu du pavillon, suivie d'une seconde injection de 25 µL du même volume vers l'extrémité du pavillon.

Pour une greffe intrapéritonéale, resuspendre les CMC de MO à raison de 1 × 10⁷ cellules par millilitre dans du DMEM froid. Ensuite, utiliser une seringue de 1 millilitre équipée d'une aiguille de 25 gauge pour injecter 2 × 10⁶ CMC de MO en 200 microlitres de milieu dans la cavité péritonéale des receveurs déficients en mastocytes. Pour une greffe intraveineuse, resuspendre les CMC de MO à 2,5 × 10⁷ cellules par millilitre dans du DMEM froid, puis injecter 5 × 10⁶ CMC de MO en 200 microlitres de milieu par voie de la veine de la queue.

Quatre à six semaines après une greffe intrapéritonéale, utilisez une seringue de cinq millilitres équipée d'une aiguille de 25 gauge pour injecter cinq millilitres de PBS froid dans la cavité péritonéale de l'animal receveur. Massez l'abdomen pendant 20 secondes afin de recueillir les cellules péritonéales. Ensuite, utilisez une seringue de cinq millilitres équipée d'une aiguille de 22 gauge pour aspirer lentement la lavage péritonéal.

Le pourcentage de mastocytes et le nombre total de cellules dans le liquide de lavage péritonéal peuvent ensuite être évalués par cytométrie en flux ou par histochimie. Pour évaluer les mastocytes dans les fenêtres mésentériques, ouvrez la membrane péritonéale afin d'exposer le tractus intestinal. Disposez quatre à cinq fenêtres mésentériques par souris sur une lame, puis fixez-les pendant une heure dans une solution de carnoy.

Ajouter la température ambiante à la fin de l'incubation, sécher les lames à l'air et retirer l'intestin. Les fenêtres mésentériques fixées resteront attachées aux lames. Enfin, colorer les préparations pendant 20 minutes à température ambiante avec la solution de coloration chaba, représentant une analyse cytométrique en flux et une coloration au bleu d'iodine des CMC de MO après 15 et 45 jours de culture dans du DMEM, supplémenté avec l'IL trois sont montrées des CMC de MO cultivées pendant 45 jours et 95 % pures et contenant un grand nombre de granules cytoplasmiques.

Par conséquent, les cellules provenant de ces cultures conviennent aux expériences de greffage, tandis que les cellules cultivées pendant 15 jours ne conviennent pas, comme le montrent ces images. Un greffage réussi de l'oreille à quatre semaines après un greffon intradermique, des fenêtres mésentériques à six semaines après un greffon intrapéritonéal et du poumon à douze semaines après un greffon intraveineux sont présentés comme attendu. Des mastocytes sont présents dans les échantillons de tissus isolés de souris de type sauvage, tandis qu'aucun mastocyte n'est détecté chez les animaux déficients en mastocytes ou chez les souris de reconstitution des mastocytes.

Cependant, les MC dérivées des BMC transférées adoptivement apparaissent dans des localisations similaires à celles observées chez les animaux de type sauvage. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit que l'intervalle entre la greffe et l'analyse de l'expérience varie selon le site d'injection des mastocytes. Il est très important de respecter ces intervalles afin de laisser suffisamment de temps aux cellules greffées pour mûrir et occuper leur position finale in vivo.

Cette approche a fourni et continue de fournir des informations importantes sur ce que les cellules massiques et leurs produits peuvent ou ne peuvent pas faire in vivo. Veuillez toujours garder à l'esprit que le travail avec des animaux vivants exige une formation spécifique, une évaluation et une approbation appropriées des protocoles expérimentaux, ainsi qu'un respect strict des normes les plus élevées de soins aux animaux, y compris la prise en compte de la réduction de la douleur et du stress des animaux lors de la réalisation de ces procédures.