Analyse des fonctions des mastocytes in vivo à l’aide de sourisknock-inde mastocytes

L’objectif général de la méthode suivante est d’analyser les fonctions des mastocytes in vivo à l’aide de souris knockin de mastocytes. Ceci est réalisé en générant d’abord des mastocytes cultivés dérivés de la moelle osseuse, ou BMC MC ou une greffe chez des souris déficientes en mastocytes. Dans la deuxième étape, les CM BMC sont transférés adoptivement dans divers sites anatomiques chez les souris déficientes en mastocytes pour générer des souris knockin à mastocytes.

En fin de compte, le nombre et la distribution anatomique des mastocytes transférés par adoption sont évalués par cytométrie en flux et analyse immunohistochimique pour évaluer dans quelle mesure les populations greffées ressemblent à celles trouvées chez les souris de type sauvage. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’évaluer directement les fonctions des populations de cellules MA de type paroi greffée ou génétiquement modifiées in vivo. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire de l’AM, telles que la mesure dans laquelle les cellules MA ou leurs produits peuvent contribuer aux caractéristiques des modèles murins de processus physiologiques, immunologiques ou pathologiques, y compris les modèles de maladies humaines.

En général, les personnes qui apprennent cette méthode peuvent avoir des difficultés car la greffe et la déficience des mastocytes peuvent varier en fonction de la méthode utilisée pour générer des CMC BM, de la racine de l’injection, du nombre de MC BMC injectés et du nombre de semaines un poids après la greffe avant de réaliser des expériences in vivo. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car certains aspects de la procédure de greffe sont difficiles à apprendre à moins de voir exactement comment ils sont effectués. Pour extraire d’abord la moelle osseuse, utilisez des outils de dissection stériles pour prélever le fémur, le tibia et le péroné de souris de type sauvage sans jurer sur l’épiphyse osseuse.

Au fur et à mesure que chaque os est disséqué, fixez-le à l’aide d’une pince et grattez tous les tissus extérieurs. Ensuite, placez l’os dans le PBS sur de la glace lorsque tous les os ont été recueillis, transférez-les dans une hotte de culture de tissus stériles, puis un à la fois, fixez chaque os avec une pince et coupez les deux épiphyses pour exposer les cavités médullaires. Ensuite, à l’aide de seringues de trois millilitres, équipées d’aiguilles de calibre 30 et d’un moyen de rinçage froid, toute la moelle rouge de chaque os dans une nouvelle boîte de Pétri Lorsque tous les os ont été rincés, utilisez la même seringue pour dissocier les amas de cellules de la moelle osseuse par une aspiration et une éjection douces répétées.

Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Remplissez le tube avec un fluide de rinçage à froid et centrifugez les cellules ressus. Suspendre la pastille cellulaire dans 10 millilitres de milieu de culture.

Transférez ensuite les cellules de la moelle osseuse dans une fiole de culture tissulaire de taille appropriée. Après un à deux jours de culture, transférez les cellules de non-adhérence dans un nouveau flacon avec 10 millilitres de culture fraîche, milieu par souris au cours des semaines suivantes. Nourrir les cellules tous les trois à quatre jours n’est que démontré.

Transférer les cellules de non-adhérence dans un nouveau flacon une fois par semaine jusqu’à ce qu’il ne reste plus de cellules d’adhérence pour la greffe intradermique dans le Pinner de l’oreille Resus. Suspendez les MC BMC à quatre fois 10 à sept cellules par millilitre dans du DMEM froid. Ensuite, aspirez les cellules dans une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 30 et placez la seringue sur de la glace.

Ensuite, confirmez la profondeur appropriée de l’anesthésie par une pincée supérieure d’une souris receveuse déficiente en mastocytes âgée de quatre à six semaines et appliquez une pommade oculaire pour injecter les cellules. Utilisez l’index pour exposer et étirer la face ventrale de l’épingle de l’oreille, créant une pression verticale sur la face dorsale de l’oreille. Administrez ensuite 1 injection intradermique de 25 microlitres d’une fois 10 aux six MC BMC au milieu de l’oreille, et une deuxième injection de 25 microlitres de la même chose vers l’extrémité de l’épingle.

Pour l’intrapéritonéale, la greffe remet en suspension les MC BMC à une fois 10 à sept cellules par millilitre dans le DMEM froid. Ensuite, à l’aide d’une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 25, injectez deux fois 10 aux six CMC BM dans 200 microlitres de milieu dans la cavité péritonéale des receveurs déficients en mastocytes pour la greffe intraveineuse. Remettez en suspension les CMC BM à raison de 2,5 fois 10 pour les sept cellules par millilitre dans le DMEM froid, puis injectez cinq fois 10 pour les six CM BMC dans 200 microlitres de milieu via la veine de la queue.

Quatre à six semaines après une greffe intrapéritonéale, utilisez une seringue de cinq millilitres équipée d’une aiguille de calibre 25 pour injecter cinq millilitres de PBS froid dans la cavité péritonéale de l’animal receveur. Massez l’abdomen pendant 20 secondes pour récolter les cellules péritonéales. Ensuite, utilisez une seringue de cinq millilitres équipée d’une aiguille de calibre 22 pour aspirer lentement le lavage péritonéal.

Le pourcentage de mastocytes et le nombre total de cellules dans le liquide de lavage péritonéal peuvent ensuite être évalués par cytométrie en flux ou chimie histologique. Pour évaluer les mastocytes dans les fenêtres mésentériques, ouvrez la membrane péritonéale pour exposer le tractus intestinal. Disposez quatre à cinq fenêtres mésentériques par souris sur une diapositive suivie d’une fixation d’une heure dans une solution de bruit de voiture.

Ajouter à température ambiante à la fin de l’incubation, sécher les lames à l’air libre et retirer l’intestin. Les fenêtres mésentériques fixes resteront fixées aux toboggans. Enfin, colorer les préparations pendant 20 minutes à température ambiante avec une solution de coloration au chaba représente l’analyse cytométrique en flux et la coloration au bleu odine des CMC BM après 15 et 45 jours de culture Dans le DMEM, complété par IL, trois CMC BM sont présentés cultivés pendant 45 jours et purs à 95 % et contiennent un nombre élevé de granules cytoplasmiques.

Par conséquent, les cellules de ces cultures conviennent aux expériences de greffe, alors que les cellules cultivées pendant 15 jours ne sont pas dans ces images. La greffe réussie de l’oreille quatre semaines après la greffe intradermique, les fenêtres mésentériques, la cavité péritonéale six semaines après la greffe intrapéritonéale et le poumon 12 semaines après la greffe intraveineuse sont indiquées comme prévu. Les mastocytes sont présents dans les échantillons de tissus isolés chez les souris de type sauvage, tandis qu’aucun mastocytes n’est détecté chez les animaux déficients en mastocytes chez les souris knockin.

Cependant, les MC BMC transférés par adoption apparaissent à des endroits similaires à ceux observés chez les animaux de type sauvage. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de garder à l’esprit que l’intervalle entre la greffe et l’étude de l’expérience variera en fonction du site d’injection du mastocyte. Il est très important de respecter ces intervalles afin de laisser suffisamment de temps aux cellules greffées pour mûrir et occuper l’emplacement final vivo.

Cette approche a fourni et continue de fournir des informations importantes sur ce que les cellules de masse et leur produit peuvent ou ne peuvent pas faire in vivo. Veuillez toujours garder à l’esprit que le travail avec des animaux vivants nécessite une formation spécifique, un examen et une approbation appropriés des protocoles expérimentaux et un strict respect des normes les plus élevées de soins aux animaux, y compris le fait de prendre soin de réduire la douleur et le stress de l’animal lorsque vous effectuez ces procédures.