Name: Comet Assay comme une mesure indirecte de stress oxydatif systémique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Découvrez le test des comètes pour mesurer indirectement le stress oxydatif systémique à partir de leucocytes humains isolés. Cette méthode simple et peu coûteuse quantifie les cassures de l'ADN par microscopie à fluorescence.

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Nous tenons à remercier la LDD Stiftung, à Triesen Liechtenstein, de soutenir financièrement notre recherche sur le stress oxydatif.

Les études sur test des comètes effectuées à l&#39;Université de Bâle, Département d&#39;ophtalmologie ont été approuvés par le comité d&#39;éthique local de Bâle 1. Préparation des réactifs <ol><li> Préparer saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (PBS) (Ca ++, Mg ++) solution par addition de PBS (1 paquet L) et 990 ml de dH 2 O aux médias. Ajuster le pH à 7,4. Stocker à température ambiante. </li><li> Préparer la solution de lyse: Pour préparer 1000 ml ajoute 2,5 M de NaCl (146,1 g), de l&#39;EDTA 100 mM (37,2 g) et 10 mM de base Trizma (1,2 g) dans de dH 2 O. </li><li> Préparer tampon d&#39;électrophorèse (NaOH 300 mM / EDTA 1 mM) en ajoutant 30 ml de NaOH 10 M et 7,5 ml de 0,2 M EDTA, QS 1500 DH 2 O et bien mélanger. Le volume total dépend de la capacité de la boîte à gel. Avant utilisation, mesurer le pH du tampon pour assurer un pH&gt; 13. </li><li> Préparez tampon de neutralisation contenant 0,4 M de Tris (48,5 g ajouté à dh ~ 800 2 O, ajuster le pH à 7,5), concentré (&amp; #62; M HCl 10) dans 1000 ml avec dH 2 O. Conserver la solution à la température ambiante. </li><li> Préparer la solution de coloration. Pour le bromure d&#39;éthidium (EtBr; 10x Stock, 20 pg / ml) ajouter 10 mg de EtBr dans 50 ml dH 2 O et stocker à température ambiante. Pour 1x Stock - mélanger 1 ml avec 9 ml dH 2 O. PRUDENT! Manipuler avec précaution EtBr adéquate car il est un cancérogène connu. </li></ol> 2. Isolement de leucocytes <ol><li> Obtenir des échantillons de sang humain (20 ml) avec anti-coagulant tels que l&#39;héparine en utilisant la ponction veineuse. </li><li> Séparer les lymphocytes en utilisant un séparateur de cellules à gradient de densité tels que Histopaque. <ol><li> En bref, le sang dilué dans 1: 1 avec du PBS ou RPMI (sans FBS) et de la couche au-dessus de 600 ul de liquide de séparation de cellule. </li><li> Centrifugeuse 1800 g pendant 20 min à 4 ° C. Aspirer le manteau &#39;Buffy&#39; dans 3-5 ml de PBS / RPMI et centrifugé à 300 g pendant 10 min pour sédimenter les lymphocytes. </li><li> Récupérer lymphocytes juste au-dessus limite entre PBS (RPMI) Et le liquide de séparation de cellules, à l&#39;aide d&#39;une pipette. Retirer les bandes de leucocytes à partir de l&#39;interface entre le plasma et les couches de liquide de séparation de cellules de chaque tube et recueillir dans un tube de 50 ml. </li></ol></li><li> Amener le volume total à 50 ml avec du milieu Eagle modifié de froid Dulbecco (DMEM). Laver la suspension de cellules trois fois avec du DMEM à 300 xg pendant 10 min. </li><li> Comptez le nombre total de cellules en utilisant un hémocytomètre. Suspendre les cellules dans PBS et aliquote dans des microtubes à 10 7 cellules / tube. </li><li> Pipeter 0,4 ml de cellules dans un tube de matière plastique à usage unique de 5 ml. Ajouter 1,2 ml 1% d&#39;agarose à faible température de gélification à 40 ° C. Mélanger et rapidement et pipeter 1,2 ml de suspension de cellules sur la surface d&#39;agarose recouvert d&#39;une lame de pré-enduit. Éviter de produire des bulles. </li><li> Laisser la gélose se gélifier pendant environ 2 min. Soyez cohérent avec le temps et la température de gélification, et veiller à ce que l&#39;agarose est entièrement réglé avant l&#39;immersion dans une solution de lyse. Après pleinement set, plonger dans la solution de lyse à ~ 4 ºC. </li></ol> 3. Lyse et Électrophorèse NOTE: La procédure décrite est pour l&#39;électrophorèse dans des conditions de pH&gt; 13 alcalines. <ol><li> Après au moins 2 heures à ~ 4 ºC, retirez délicatement les lames de la solution de lyse. Placer les lames côte à côte sur la boîte de gel horizontal de près d&#39;une extrémité, les glissant aussi rapprochés que possible. </li><li> Remplir les réservoirs tampons avec fraîchement préparé tampon à pH&gt; 13 d&#39;électrophorèse jusqu&#39;à ce que le niveau de liquide recouvre complètement les diapositives (éviter les bulles plus de l&#39;agarose). </li><li> Laissez-lames sont assis dans le tampon alcalin de 20 min pour permettre le déroulement de l&#39;ADN et l&#39;expression des dommages alcalin labile. </li><li> Allumez alimentation de 25 volts (~ 0,75 V / cm) et ajuster le courant à 300 milliampères en élevant ou abaissant le niveau de tampon. Électrophorèse les diapositives pendant 30 min. </li><li> Coupez l&#39;alimentation. Soulevez doucement les lames de la mémoire tampon et pdentelle sur un plateau de vidange. Goutte à goutte enduire les lames avec neutralisation tampon. Laisser les lames reposer pendant au moins 5 min. Égoutter diapositives et répéter deux fois de plus. </li><li> Colorer les lames avec 80 ul 1x bromure d&#39;éthidium (BET) et laisser reposer pendant 5 min, puis tremper dans de l&#39;eau distillée refroidie pour éliminer l&#39;excès. Ensuite, placez une lamelle sur la lame et de les stocker immédiatement. Magasin glisse pendant un mois à température ambiante dans des conditions sèches. REMARQUE: Les autres taches d&#39;ADN (par exemple, SYBR-green) peut également être utilisé. Attention! porter des gants de protection comme la plupart des colorants sont mutagènes. </li></ol> 4. Quantification des cassures de l&#39;ADN <ol><li> Pour visualiser la lésion de l&#39;ADN, observer la diapositive d&#39;ADN coloré à l&#39;EtBr sous un microscope à fluorescence objectif 40X. </li><li> Évaluer quantitativement dommages à l&#39;ADN dans les cellules en mesurant la longueur de migration de l&#39;ADN et le pourcentage d&#39;ADN migré (Figure 1A). Quantifier dommages à l&#39;ADN (figure 1B) par le moment et Olive Queue-moment. Définitions de Queue-Moment et Olive -Moment ont déjà été donnés 8-10. NOTE: Dans notre expérience, il est suffisant pour tenir à l&#39;un des paramètres. Les cellules sont photographiées en réglant l&#39;outil automatisé qui analyse sur les cellules de diapositives et de photographies au microscope. Quantification des cassures de l&#39;ADN peut être fait par des progiciels d&#39;analyse d&#39;image. Il existe plusieurs forfaits différents logiciels qui sont faits sur mesure pour capturer l&#39;image des cellules et de quantifier les dommages à l&#39;ADN. Nous vous recommandons d&#39;utiliser le même logiciel pendant toute l&#39;expérience. Le technicien de laboratoire identifie la cellule intacte ou d&#39;une comète est marqué sur l&#39;ordinateur et clique avec la souris sur elle. La cellule comète ou intacte est alors automatiquement marqué. </li></ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromagnetic+fields+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pathophysiology%22%5BJournal%5D)">Electromagnetic fields and DNA damage.</a> Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).</li>
<li>Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet+assay%3A+a+reliable+tool+for+the+assessment+of+DNA+damage+in+different+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).</li>
<li>Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-repair+genes+and+vitamin+E+in+the+prevention+of+N-nitrosodiethylamine+mutagenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity.</a> Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).</li>
<li>Bartsch, H., Nair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+and+oxidative+stress+in+the+genesis+and+perpetuation+of+cancer%3A+role+of+lipid+peroxidation%2C+DNA+damage%2C+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair.</a> Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).</li>
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<li>Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Half+a+pack+of+cigarettes+a+day+more+than+doubles+DNA+breaks+in+circulating+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Tob+Induc+Dis%22%5BJournal%5D)">Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes.</a> Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).</li>
<li>Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+ranibizumab+versus+photodynamic+therapy+on+DNA+damage+in+patients+with+exudative+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration.</a> Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).</li>
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<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li>
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<li>Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage%3A+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li>
<li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood%3A+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li>
<li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol+Nutr%22%5BJournal%5D)">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li>
<li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station%5BTitle%5D)+AND+%22Electromagn+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li>
<li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li>
</ol>

Des scientifiques suédois Ostling et Johanson ont été les premiers dans leur domaine à utiliser test des comètes de quantifier les dommages de l&#39;ADN dans les cellules 1. Les conditions neutres que les deux scientifiques ont utilisé, cependant, seulement permis la détection des cassures double-brin d&#39;ADN. Singh et al. Tard le dosage adapté pour une utilisation dans des conditions alcalines, qui a produit une version sensible qui pourrait évaluer les cassures double et simple brin d&#39;ADN et de détecter les sites alcali-labiles 12. Depuis son développement initial, le test a été modifiée à diverses étapes, pour la rendre appropriée pour évaluer les types de dommages à l&#39;ADN dans des types cellulaires différents 13-15. Comme avec toutes les techniques, en accordant une attention rigoureuse aux détails techniques est important d&#39;obtenir des résultats précis 16. Basé sur notre expérience, on obtient les meilleurs résultats si chaque étape de la préparation de la solution vers la comète quantification-est réalisé par le laboratoire techn expert méthodologiqueicians. L&#39;utilisation de milieux frais et correctement préparé, techniques de pipetage adéquates, le calendrier exact et (comme mentionné précédemment dans la section des résultats) l&#39;utilisation de leucocytes fraîchement préparés sont essentiels pour que la lyse et électrophorèse sur gel pour obtenir des résultats précis 17. Toutes les étapes individuelles dans ce test sont tout aussi importants pour obtenir des résultats fiables. Dans 16 meilleurs résultats généraux sont obtenus si chaque étape méthodologique unique de la préparation de la solution jusqu&#39;à la quantification comète est effectuée par le laboratoire expert technicians.Important semblent l&#39;utilisation de milieux frais et correctement préparés , les techniques de pipetage adéquates, timing exact et comme déjà mentionnées dans la section des résultats de l&#39;utilisation de leucocytes fraîchement préparés pour la lyse et l&#39;électrophorèse sur gel pour obtenir des résultats satisfaisants à partir de l&#39;essai 17. Comme le font d&#39;autres méthodes, la technique de test des comètes a son avandes avantages et des inconvénients. Être une méthode sensible, le dosage est vulnérable aux facteurs (par exemple, la lumière UV) qui pourraient augmenter cassures de l&#39;ADN et donc affecter les résultats. Tout facteur qui peut augmenter le stress oxydatif, sauf ce qui est l&#39;objet de recherches, devrait être évitée. Les facteurs de stress peuvent augmenter le niveau de stress oxydatif, non seulement dans les leucocytes, mais aussi dans tous les autres milieux de sang et les lymphocytes. Comme mentionné précédemment, il existe de nombreuses façons de mesurer le stress oxydatif 18,19 différentes et plus directs. Le test des comètes est l&#39;une des nombreuses méthodes qui présente certains avantages. Ceux-ci comprennent sa faible coût relatif, le petit nombre de cellules nécessaires (&lt;10 000 cellules) et donc les petits échantillons de sang nécessaires par patient, la période de temps relativement courte nécessaire de quantifier les dommages de l&#39;ADN dans les cellules (environ trois jours), sa sensibilité et son répandue applicabilité aux dommages de l&#39;ADN des ânes dans différents types cellulaires. Dans le passé, nous avons choisi de travailler avec les leucocytes puisque nous avons eu l&#39;expérience avec ceun type de cellule et il est applicable pour l&#39;étude particulière prévue. Un autre avantage de l&#39;essai de comète est qu&#39;il peut être utilisé pour détecter les différents types et niveaux de dommages à l&#39;ADN et peut donc être appliquée dans divers autres domaines d&#39;études en plus de stress oxydatif telles que des études de réparation d&#39;ADN, essais de supplémentation ou d&#39;études de génotoxicité. Le stress oxydatif est maintenant reconnue comme jouant un rôle essentiel dans la pathogenèse de plusieurs maladies. La méthode de test des comètes, tandis que l&#39;une des nombreuses façons de mesurer le stress oxydatif 18,19, est relativement simple, polyvalent et peu coûteux. Lorsque maîtrisée, cette méthode peut être utilisée dans tous les domaines de la médecine dans lequel le stress oxydatif joue un rôle 8-10,20,21.

Test des comètes a été développé par des scientifiques suédois Ostling et Johanson 1. L&#39;ADN est une molécule chargée négativement. Au cours de l&#39;électrophorèse, les fragments d&#39;ADN, endommagées petits voyagent plus vite vers une anode chargée positivement 2. Le plus petit des fragments d&#39;ADN, plus vite leur migration vers l&#39;anode pour former une &quot;comète&quot; typique avec une «tête» composée de intacte, l&#39;ADN endommagé et une &quot;queue&quot; composée de fragments d&#39;ADN endommagés 3. ADN endommagé peut être réparé par différents mécanismes dans le corps 4, qui gardent la génération des cassures de l&#39;ADN assez équilibrés 5. Si, cependant, la balance est en faveur de cassures de l&#39;ADN, les pauses peuvent accumuler et finira par contribuer au développement d&#39;une maladie. Notre ADN souffre environ 0.000165% de dégâts à un moment donné 6. Simples cassures de l&#39;ADN échoués se réfèrent à un défaut sur l&#39;un des deux brins de la double hélice de l&#39;ADNalors que des cassures double-brin d&#39;ADN sont causées lorsque les deux brins de la double hélice de l&#39;ADN sont endommagés. Il ya différents facteurs qui peuvent améliorer la quantité de cassures de l&#39;ADN à un moment donné, comme l&#39;âge de la cellule, la fumée de cigarette, divers médicaments ou le stress oxydatif 7-9. Si tous les facteurs conduisant à l&#39;amélioration des cassures d&#39;ADN sont maintenus constants, la quantification des cassures de l&#39;ADN à l&#39;aide d&#39;essai de comète est un bon paramètre indirect de stress oxydatif. La méthode de test des comètes est utilisé de plus en plus aujourd&#39;hui dans la médecine, y compris l&#39;ophtalmologie. Une raison à cela est que le stress oxydatif est de plus en plus reconnue comme un mécanisme pathogénique pour diverses maladies 8-11 et test des comètes est une méthode avec laquelle le stress oxydatif peut indirectement être quantifiés.

<table><tbody><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Qualigènes</td><td>(CPW59)</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodique</td><td>HiMedia</td><td>(RM1370)</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sigma</td><td>(E-8751)</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>(1077-1)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate salin tamponné (PBS) (sans Ca++, Mg++)</td><td>HiMedia</td><td>(TS1006)</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Ranbaxy Rankem</td><td>(S0160)</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>BDH-Merck</td><td>(89021)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>(RM 845)</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Spectrochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Matériaux requis pour l’électrophorèse sur gel</td></tr><tr><td>Agarose à fusion normale (NMA)</td><td>HiMedia</td><td>(RM273)</td><td></td></tr><tr><td>Point de fusion bas Agarose (LMPA)</td><td>Sigma</td><td>(A9414)</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles de méthanol - Qualigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(n° 1, 24 x 60 mm)</td><td></td>Tubes de microcentrifugation Blue Star <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tarsons</td><td>(500010)</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor et pointes</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope, Lames d’électrophorèse</td><td></td><td></td> conventionnelle / Micro gel (MGE)<td></td></tr></tbody></table>

comet assay comme une mesure indirecte de stress oxydatif systémique

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Organismes eucaryotes supérieurs ne peuvent pas vivre sans oxygène; Pourtant, paradoxalement, l&#39;oxygène peut être nocif pour eux. La molécule d&#39;oxygène est chimiquement relativement inerte parce qu&#39;il a deux électrons non appariés, situés dans différents pi * orbitales anti-collage. Ces deux électrons ont des spins parallèles, ce qui signifie qu&#39;ils tournent dans la même direction autour de leurs propres axes. Ceci est la raison pour laquelle la molécule d&#39;oxygène est peu réactif. L&#39;activation de l&#39;oxygène peut se produire par deux mécanismes différents; soit par réduction par l&#39;intermédiaire d&#39;un électron à la fois (réduction monovalent), ou par l&#39;absorption d&#39;une énergie suffisante pour inverser la rotation de l&#39;un des électrons non appariés. Cela se traduit par la production d&#39;espèces oxydantes réactives (ROS). Il existe un certain nombre de moyens par lesquels le corps humain élimine ROS à l&#39;état physiologique. Si la production de ROS dépasse la capacité de réparation, les résultats de stress oxydatif et les dommages différentes molécules. Il existe de nombreuses méthodes différentes par lesquelles le stress oxydatif peut être moiPROFESSIONNELS DU SECTEUR. Ce manuscrit met l&#39;accent sur l&#39;une des méthodes de famille électrophorèse sur gel de cellule, également connu sous le nom «dosage comète&quot; qui permet la mesure de cassures de l&#39;ADN. Si tous les facteurs connus pour provoquer des dommages à l&#39;ADN, autre que le stress oxydatif sont maintenus constants, le montant des dommages à l&#39;ADN mesurée par dosage comète est un bon paramètre de stress oxydatif. Le principe est simple et repose sur le fait que les molécules d&#39;ADN sont chargées négativement. Molécule d&#39;ADN intact a une taille telle qu&#39;elle ne migre pas au cours de l&#39;électrophorèse. cassures de l&#39;ADN, cependant, si le résultat présent en des fragments plus petits qui se déplacent dans le champ électrique vers l&#39;anode. Des fragments plus petits migrent plus rapidement. Comme les fragments ont des tailles différentes le résultat final de l&#39;électrophorèse est pas une ligne distincte, mais plutôt un continuum avec la forme d&#39;une comète. Le système permet une quantification de la &quot;comète&quot; résultant et donc des cassures de l&#39;ADN dans la cellule.

Bien que la méthode de test des comètes rend résultats reproductibles, il peut être influencé par une variété de facteurs. Un tel facteur est de savoir si oui ou non les leucocytes sont cryoconservés avant la lyse et électrophorèse sur gel ou si cette étape est réalisée sur les leucocytes fraîchement préparées. La figure 2 montre que dans le groupe 2, où les leucocytes ont été cryoconservés avant de l&#39;ADN de lyse et une électrophorèse sur gel pauses étaient significativement plus élevés, que dans le groupe 1 où la lyse et gel -electrophoresis a été faite sur des cellules fraîchement préparés. Le dosage peut également être utilisé pour évaluer indirectement le stress oxydatif systémique. Le tableau 1 présente les statistiques descriptives pour Queue moment et Olive- moment, chez les fumeurs et les sujets sains. Les données révèlent que fumer un demi-paquet de cigarettes par jour a plus que doublé pauses ADNsb dans les leucocytes circulants 9. <img alt="Figure 1A" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="Figure 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> Figure 1. (A) représente le microscope utilisé lors de l&#39;analyse de l&#39;essai comète. (B) Δ représente une &quot;comète&quot; typique avec une tête brillante et la queue (endommagé fragments d&#39;ADN plus petites). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> Figure 2. ADNsb ruptures étaient significativement plus élevés lorsque les leucocytes ont été cryoconservés (Groupe 2) que lorsque les leucocytes fraîchement préparés ont été utilisés avant la lyse et électrophorèse sur gel. <imgalt = &quot;Tableau 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; Tableau 1. Les fumeurs avaient plus que doubler le nombre de ssADN casse par rapport à l&#39;âge et le sexe appariés non-fumeurs en bonne santé.

Test des comètes mesure cassures de l&#39;ADN induites par différents facteurs. Si tous les facteurs (sauf stress oxydatif) causant des dommages de l&#39;ADN sont maintenus constants, le montant des dommages à l&#39;ADN est un bon paramètre indirect de stress oxydatif. L&#39;objectif de ce protocole est d&#39;utiliser test des comètes pour la mesure indirecte du stress oxydatif.

Comet Assay comme une mesure indirecte de stress oxydatif systémique

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser le test COMET pour mesurer indirectement le stress oxydatif. Cela est réalisé en isolant d'abord les leucocytes à partir d'échantillons de sang humain. La deuxième étape consiste à mélanger les cellules avec de l'agarose à bas point de fusion et à immobiliser les cellules sur des lamelles.Ensuite, les cellules sont lysées pendant deux heures, suivies d'une électrophorèse après coloration des lames au bromure de dium. L'ADN est visualisé par microscopie de fluorescence. Enfin, les cassures d'ADN sont quantifiées par analyse logicielle des données de microscopie de fluorescence.Aujourd'hui, nous savons que le stress oxydatif joue un rôle crucial dans la pathogenèse de diverses maladies, y compris, bien sûr, les maladies oculaires. Il existe de nombreuses méthodes différentes pour mesurer le stress oxydatif. L'une des façons de le mesurer indirectement est l'essai comet.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans son caractère simple, peu coûteux et fiable, permettant ainsi de mesurer indirectement le stress oxydatif. Les leucocytes Lucas pour cette expérience seront isolés à partir d'échantillons de sang humain obtenus avec un anticoagulant par ponction veineuse afin de séparer les lymphocytes : diluez d'abord le sang dans un rapport un pour un avec du PBS. Ensuite, recouvrez d'une couche de 600 microlitres d'un liquide séparateur de cellules par gradient de densité, tel que l'hysto-pack, puis centrifugez à 1 800 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.Aspirez la couche de buffy coat et placez-la dans trois à cinq millilitres de PBS. Effectuez une centrifugation à 300 G pendant 10 minutes. À l’aide d’une pipette, prélèvez les lymphocytes situés juste au-dessus de la limite entre le PBS et le liquide séparateur cellulaire. Retirez les bandes de leucocytes situées à l’interface entre la couche de plasma et le liquide séparateur cellulaire dans chaque tube, puis rassemblez-les dans un seul tube de 50 millilitres.Amener le volume total à 50 millilitres avec du PBS froid. Laver la suspension cellulaire trois fois avec du PBS à 300 ×g pendant 10 minutes. Après le troisième lavage, dénombrer le nombre total de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.Suspendre les cellules dans du PBS et de l'Eloqua dans des tubes de microcentrifugeuse à raison de 10 millions de cellules par tube. Prélever 0,4 millilitre de cellules dans un tube en plastique jetable de 1,5 millilitre. Ajouter 50 microlitres de suspension cellulaire à 500 microlitres d'une solution à 1 % à faible température de gélification.À 40 degrés Celsius, préparez à l’avance le mélange et pipetez rapidement 50 microlitres de la suspension cellulaire sur la surface recouverte d’agros d’une lame pré-enrobée. Laissez l’agros gélifier environ deux minutes à quatre degrés Celsius. Veillez à toujours utiliser le même temps et la même température pour la gélification, et assurez-vous que l’agros est complètement solidifié avant de passer à l’étape de lyse.Une fois que l'agarose est complètement solidifiée, plonger les lames dans une solution de lyse à quatre degrés Celsius pendant au moins deux heures. Ensuite, retirer délicatement les lames de la solution de lyse. Placer les lames côte à côte sur une boîte horizontale pour gel, près d'une extrémité, en les rapprochant le plus possible.Remplir les réservoirs tampons avec un tampon d'électrophorèse fraîchement préparé, de pH supérieur à 13. Noter que la procédure démontrée ici concerne l'électrophorèse. Dans des conditions alcalines avec un pH supérieur à 13, remplir les réservoirs tampons jusqu'à ce que le niveau de liquide recouvre complètement les lames.Évitez les bulles au-dessus des aros. Laissez la lame tremper dans le tampon alcalin pendant 20 minutes afin de permettre le déroulement de l'ADN et l'expression des lésions alcali-labiles. Au bout de 20 minutes, allumez l'alimentation électrique à 25 volts et réglez le courant à 300 milliampères en ajustant le niveau du tampon.Effectuer l'électrophorèse pendant 30 minutes. Au bout de 30 minutes, éteindre l'alimentation électrique. Soulever délicatement les lames du tampon et les placer sur un plateau d'écoulement, en les recouvrant goutte à goutte d'un tampon de neutralisation.Laisser les lames reposer pendant au moins cinq minutes. Éliminer le liquide et répéter l'application du tampon de neutralisation deux fois supplémentaires. Ensuite, colorer les lames avec un millilitre de bromure d'Éthidium à 1 x pendant cinq minutes.Portez des gants de protection car le bromure d'ahy est un carcinogène connu. Après cinq minutes, plongez les lames dans de l'eau distillée froide pour éliminer tout excès de colorant. Ensuite, placez une lame couvre-objet sur chaque lame.Conserver immédiatement les lames. Les lames colorées peuvent être conservées un mois à quatre degrés Celsius dans des conditions sèches. Pour visualiser et évaluer les dommages de l'ADN, observer la lame d'ADN colorée au bromure d'athérium au microscope à fluorescence avec un objectif 40 x.Configurer l'outil automatisé qui balaye le microscope, la lame et photographie les cellules dans le test des comètes. Les dommages à l'ADN ont été évalués de manière quantitative dans les cellules en mesurant la longueur de la migration de l'ADN et le pourcentage d'ADN migré. La flèche noire indique un comète typique avec une tête et une queue brillantes.La tête est composée d'ADN intact et non endommagé, tandis que la queue est constituée de fragments d'ADN plus petits et endommagés. Bien que le test COMET fournisse des résultats reproductibles, il peut être influencé par divers facteurs, comme le fait que le test soit réalisé sur des leucocytes fraîchement préparés. Dans ce graphique, le moment de la queue est défini comme le produit de la longueur de la queue et de la queue elle-même.Pourcentage d'ADN de l'ADN total des leucocytes du groupe deux qui ont été cryopréservés avant la lyse et l'électrophorèse, montrant un nombre significativement plus élevé de cassures de l'ADN simple brin par rapport aux leucocytes fraîchement préparés du groupe un. Ce dosage peut également être utilisé pour évaluer indirectement le stress oxydatif systémique. Ici, le moment d'olive représente le produit du pourcentage d'ADN total dans la queue et de la distance entre les centres de masse des régions de la tête et de la queue.Les résultats obtenus chez des fumeurs et des sujets sains appariés par âge et sexe révèlent que fumer la moitié d'un paquet de cigarettes par jour double plus que le nombre de cassures de l'ADN simple brin dans les leucocytes circulants. Une fois maîtrisée, cette technique présente plusieurs avantages, notamment son coût relativement faible, le faible nombre de cellules, et donc le faible volume d'échantillon sanguin nécessaire par patient, ainsi que la durée relativement courte requise pour quantifier les dommages à l'ADN dans les cellules.

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La vidéo montre le test de comète pour détecter les dommages à l’ADN après une exposition à des agents nocifs. Dans des conditions alcalines, l’ADN se déroule et se dénature, et lors de l’électrophorèse, l’ADN intact et endommagé migre différemment dans le gel d’agarose, formant une structure en forme de comète. L’ADN non endommagé qui migre lentement forme la tête de comète circulaire, tandis que les fragments d’ADN endommagés qui migrent rapidement forment la queue de comète allongée.

Dosage des comètes pour la détection des dommages à l’ADN dans les cellules

Cette vidéo présente le dosage des substances réactives de l’acide thiobarbiturique (TBARS) pour évaluer le stress oxydatif dans des échantillons biologiques.

Dosage des substances réactives à l’acide thiobarbiturique pour évaluer le stress oxydatif dans le sérum humain

Le test des comètes est un moyen efficace de détection de ruptures simple et double brin, y compris alcali-labiles sites et DNA-DNA/DNA-protein liens croisés sur l'ADN dans toutes les cellules, y compris les neurones hippocampiques. La méthode tire parti de la migration différentielle de l'ADN dans un champ électrique dû à des différences de quantité de dommages de l'ADN.

Le dosage de dommages de l&#39;ADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de l&#39;essai de comète

Nous décrivons ici une plate-forme qui permet la détection de test des comètes de dommages à l'ADN avec un débit sans précédent. Les motifs de dispositif de cellules de mammifères dans une puce et permet le traitement parallèle de 96 échantillons. L'approche facilite l'analyse des lésions de l'ADN au niveau de base, les dommages à l'ADN induits exposition et réparation de l'ADN cinétique.

CometChip: Une plate-forme à haut débit de 96 puits pour la mesure de dommages de l&#39;ADN dans les cellules humaines Microarrayed

Le test des comètes alcalines mesure les cassures de brins d’ADN dans les cellules eucaryotes. En ajoutant une étape de digestion de l’endonucléase III ou de la 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase humaine, le test peut détecter efficacement les dommages oxydatifs à l’ADN. Nous décrivons les méthodes d’utilisation de ces tests pour détecter les dommages à l’ADN dans le foie du rat.

In Vivo Alkaline Comet Assay et Enzyme modifiée Alkaline Comet Assay pour mesurer Breaks brin d&#39; ADN et l&#39; ADN oxydative dommages de foie de rat

Le test des comètes est une méthode efficace pour détecter les lésions de l’ADN dont l’ADN simple et double-brin se brise. Nous décrivons la comète neutres et alcalins des essais pour mesurer les lésions de l’ADN dans les cellules cancéreuses pour évaluer les effets thérapeutiques de la chimiothérapie.

Évaluation In Vitro dommages à l’ADN à l’aide du test des comètes

Ce protocole décrit plusieurs procédures pour la préparation d’échantillons de tissus congelés de haute qualité au moment de l’autopsie pour une utilisation dans l’essai de la comète pour évaluer les dommages à l’ADN : 1) tissu haché, 2) cellules épithéliales grattées du tractus gastro-intestinal, et 3) tissu en cubes d’échantillons, nécessitant l’homogénéisation à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire.

Utilisation de tissus congelés dans l’analyse de la comète pour l’évaluation des dommages à l’ADN

Le test de comète est un moyen populaire de détecter les dommages à l’ADN. Cette étude décrit une approche pour exécuter des glissements dans des variantes représentatives du test de la comète. Cette approche a considérablement augmenté le nombre d’échantillons tout en réduisant la durée d’exécution des essais, le nombre de manipulations de lames et le risque d’endommagement des gels.

Une approche de dosage de comète à haut débit pour évaluer les dommages à l’ADN cellulaire

Ce protocole décrit une méthode efficace pour quantifier la différence dans les dommages à l’ADN induits par les inhibiteurs de type I et de type II dans les cellules mutantes FLT3 grâce à l’application du test de comète.

Test de comète pour quantifier les dommages à l’ADN dans les cellules 32D exprimant le mutant FLT3 après une exposition à des inhibiteurs de FLT3 de type I et de type II

Nous avons développé la réponse visuelle et de motricité pour quantifier la puissance du moteur du poisson zèbre larvaire dans la réponse aux augmentations de lumière et décrémente. Nous avons également examiné la vision mutants poisson zèbre, y compris le pas de la réponse optocinétique (CNRC) mutants, qui étaient censées être complètement aveugle lorsqu'il est testé par un autre test de vision, le réflexe optocinétique.

Un test pour mesurer la réactivité comportementale du poisson-zèbre à l&#39;évolution des intensités de lumière

Découvrez le test des comètes pour mesurer indirectement le stress oxydatif systémique à partir de leucocytes humains isolés. Cette méthode simple et peu coûteuse quantifie les cassures de l'ADN par microscopie à fluorescence.

Comet Assay comme une mesure indirecte de stress oxydatif systémique

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