Name: Évaluation de la migration des cellules endothéliales après une exposition à des produits chimiques toxiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Apprenez à évaluer la migration des cellules endothéliales après exposition à des produits chimiques toxiques. Cette méthode utilise des tests de migration pour analyser les mécanismes cellulaires impliqués dans les troubles de cicatrisation.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par le ministère allemand de la Défense (subvention n° M-SAB1-6-A009).

Le protocole suivant décrit les techniques pour l&#39;enquête de début de la migration des cellules endothéliales. La bonne culture des cellules endothéliales vasculaires nécessite pré-revêtement de flacons de culture cellulaire avec la gélatine pour assurer la prolifération et l&#39;entretien d&#39;un phénotype endothélial. 1. Pré-revêtement de flacons de culture cellulaire <ol><li> Dissoudre la gélatine dans du PBS 0,1 M à une concentration finale de 0,1%. </li><li> Autoclave la solution avec des paramètres pour autoclavage liquide (pour plus de détails voir les instructions de l&#39;autoclave spécifique). </li><li> Ajouter un volume suffisant de la solution de gélatine à l&#39;autoclave dans un ballon de culture cellulaire stérile (par exemple, au moins 5 ml pour un flacon de culture de cellules T25). </li><li> Transférer les flacons dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2 ne soit pas requis, mais ne gêne pas) pendant au moins 30 min. </li><li> Retirer la solution de gélatine restant. Utilisez les flacons pré-enduit ensuite (voir la culture de cellules) ou sdéchiré dans des conditions stériles jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. Culture cellulaire des premières cellules endothéliales Note: cellule souche embryonnaire dérivée des cellules endothéliales début (CEE) ont été obtenues à partir des corps embryoïdes murins différenciées par tri magnétique de cellules activées de la fraction de cellules positives PECAM-1 comme décrit précédemment 10,11. <ol><li> Culture CEE sur des boîtes de culture de cellules revêtues de gélatine dans du DMEM supplémenté avec 15% de FCS, 50 U / ml de pénicilline, 50 U / ml de streptomycine, 200 uM de L-glutamine, 100 pM de ß-mercaptoéthanol et 1% d&#39;acides aminés non essentiels. Poignée cellules dans des conditions stériles. Cultiver les cellules avec 5% de CO2 à 37 ° C et 95% d&#39;humidité jusqu&#39;à ce que la sous-confluence (max. 80%). </li><li> Au sous-confluence, les cellules à séparer un rapport de 1: 5. Remarque: Le détachement des cellules endothéliales est une étape critique. <ol><li> Récolter les cellules avec RT Accutase. Retirez les médias, rincer avec du PBS et ajouter 1 ml de Accutase par 25 cm <sup&gt; 2. </li><li> Incuber le flacon à température ambiante pendant 2-10 min jusqu&#39;à ce que les cellules ont détaché. Disperser les cellules et de les transférer à l&#39;application souhaitée. Remarque: Une neutralisation chimique de l&#39;Accutase est pas nécessaire, car il a lieu lorsque les cellules ensemencées sont stockés dans l&#39;incubateur à 37 ° C. Cependant, Accutase activité peut également être diminuée par l&#39;addition du milieu DMEM contenant du FCS. </li></ol></li></ol> 3. Boyden Chambre Remarque: Les dosages de la chambre de Boyden sont effectuées en utilisant des systèmes d&#39;insertion de polyéthylène téréphtalate opaque à la lumière 8 um de taille de pore. <ol><li> Pré-enduire les inserts de filtre (qui coupe à l&#39;intérieur des puits de culture de cellules, créant ainsi une chambre de Boyden) en ajoutant 500 ul de 0,1% de gélatine dissous dans 0,1 M de PBS pendant au moins 30 min. </li><li> Si les cellules doivent être exposées à des produits chimiques toxiques, selon exposer à la conception expérimentale spécifique avant la récolte des cellules. Note: Les cellules ont été exposées à 12,5 ug chlorambucil / ml de DMEMpendant 24 heures. En ce qui concerne la conception expérimentale spécifique, des instructions peuvent varier. </li><li> Récolte CEE et déterminer le nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage de cellules. Remarque: Les appareils de comptage automatiques peuvent être utilisés, mais doivent être utilisés avec prudence: le comptage manuel des cellules est plus précise et est fortement recommandé. </li><li> Ajouter 500 pi de milieu de culture de cellules dans le compartiment de la chambre inférieure de la chambre de Boyden. </li><li> Ajouter exactement 10 4 500 ul CEE dans un milieu de culture de cellules par insert de filtre dans le compartiment de la chambre supérieure. Éliminer les bulles. </li><li> Incuber les inserts de filtre dans l&#39;incubateur pendant exactement 8 h. </li><li> Rincer une fois avec du PBS et remplacer le milieu par 0,5 ml de paraformaldehyde à 4% dans les deux compartiments pendant 25 minutes pour la fixation des cellules. Laver le filtre largement mais au moins trois fois avec du PBS 0,1 M. </li><li> Exciser les membranes avec un scalpel. </li><li> Monter la membrane entre deux lamelles de verre avec un milieu de montage contenant DAPI pour stainin nucléaireg. Faites attention à l&#39;orientation. Assurez-vous que seules les cellules qui ont migré vers le côté du compartiment inférieur de la membrane sont comptées. </li><li> Compter les cellules qui ont migré vers le côté du compartiment inférieur de la membrane avec un microscope à fluorescence à un grossissement de 400X. Ne confondez pas les pores de la membrane avec des cellules migrées (Figure 1A, 1B). Enquêter sur un nombre raisonnable de répétitions biologiques (au moins 3 répétitions biologiques par condition). </li></ol> 4. Wound Healing Assay <ol><li> Selon l&#39;équipement disponible, choisissez avec soin les plats ou des plaques de culture cellulaire: Lorsque vous utilisez microscopie DIC, éviter des boîtes de culture à base de surface en plastique ou des plaques ainsi, mais utiliser des dispositifs à base de verre à la place. Remarque: Si en utilisant la microscopie à contraste de phase, plats de plastique à base peuvent également être utilisés. </li><li> Cultiver CEE dans un dispositif de culture de cellules approprié (par exemple, 4 cm à fond de verre boîte de Pétri approprié pour l&#39;imagerie des cellules vivantes) Jusqu&#39;à 80% de confluence. Important: ne pas cultiver les cellules pour compléter confluence. </li><li> Grattez les monocouches avec stériles 10 conseils ul de pipettes. Poussez la pointe doucement sans trop de pression sur la surface de la boîte et de le déplacer en ligne droite en douceur d&#39;un côté à l&#39;other.Wash les cellules deux fois avec 0,1 M de PBS pour éliminer les cellules individuelles. </li><li> Ajouter un volume suffisant de milieu de la boîte de culture. Le cas échéant, ajouter des composés qui devraient être étudiés. Note: 1,5 ml de milieu contenant 15 ng / ml alpha a été ajouté de l&#39;acide linolénique. </li><li> Monter la boîte de culture sous un microscope capable d&#39;imagerie des cellules vivantes. Veiller à 5% de CO 2, 37 ° C et une atmosphère humidifiée. Remarque: L&#39;humidification est particulièrement important pour éviter l&#39;évaporation moyenne. </li><li> Acquérir les images de time-lapse de plus de 24 heures à intervalles de 10 minutes. Plan pour les grandes tailles de fichiers. Remarque: Une résolution de 512 x 512 pixels est généralement suffisant; Toutefois, nous vous recommandons d&#39;utiliser des images d&#39;au moins 1024 x 1,024. </li><li> Mesurer la largeur de la fente à t = 0 h et à t = 24 h en utilisant l&#39;outil de longueur du logiciel fourni avec le microscope ou utiliser des logiciels open-source (par exemple, ImageJ). Remarque: Dans le logiciel générale d&#39;acquisition et d&#39;analyse d&#39;image spécifique est fourni par le fabricant. Par conséquent, pour les détails techniques concernant l&#39;utilisation du logiciel, reportez-vous au manuel. </li></ol> Suivi 5. cellulaire <ol><li> Selon l&#39;équipement disponible, choisissez avec soin les plats ou des plaques de culture cellulaire: Lorsque vous utilisez microscopie DIC, éviter des boîtes de culture à base de surface en plastique ou des plaques ainsi, mais utiliser des dispositifs à base de verre à la place. Remarque: Si en utilisant la microscopie à contraste de phase, plats de plastique à base peuvent également être utilisés. </li><li> Seed 5 x 10 4 CEE complétée DMEM dans un dispositif de culture de cellules approprié (par exemple, plaque de 24 puits multiples) et de cultiver les cellules avec 5% de CO 2 à 37 ° C et 95% d&#39;humidité pendant 1-2 jours. </li><li> Lorsque les cellules ont grandi à un 80% De confluence, retirez les médias et la culture des cellules avec les nouveaux médias dans la présence de substances d&#39;essai respectifs (par exemple, 12,5 pg chlorambucil / ml DMEM). Toujours inclure les cellules de contrôle (traitées avec le solvant, par exemple l&#39;éthanol) à 37 ° C pendant une certaine période de temps (24 heures, selon le système de test individuel). </li><li> Monter la boîte de culture sous un microscope capable de l&#39;imagerie des cellules vivantes (37 ° C, 5% de CO 2 et 95% d&#39;humidité). Acquérir les images de time-lapse de plus de 24 heures à des intervalles prédéfinis. Acquérir des images à intervalles de 10 min. </li><li> Effectuer le suivi manuellement des CEE par l&#39;utilisation du plugin ImageJ MTrackJ. Choisissez 10 cellules au hasard dans le champ de vision et de suivre leurs mouvements en ajoutant un point de données par point dans le temps en utilisant le &quot;Ajouter&quot; commandement de MTrackJ. </li></ol> Remarque: MTrackJ est disponible gratuitement à et ImageJ est disp [Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;.]le à [Rasband, imagej. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]. Un manuel détaillé sur le plugin MTrackJ est disponible au &quot;http://www.imagescience.org&quot;. 6. imagerie de cellules vivantes / évaluation du potentiel de membrane mitochondriale <ol><li> Cultiver CEE dans un dispositif de culture de cellules approprié (par exemple, 4 cm bas boîte de Pétri en verre approprié pour l&#39;imagerie de cellules vivantes) jusqu&#39;à une confluence de 80%. Important: Ne pas cultiver les cellules pour compléter confluence. </li><li> Le cas échéant, exposer les cellules à des produits chimiques. Note: Les cellules ont été exposées à 12,5 pg / ml pendant 24 heures chlorambucil. En ce qui concerne la conception expérimentale spécifique, des instructions peuvent varier. </li><li> Préparer une solution à 10 mM du stock de tétraméthylrhodamine (TMRM) dans le DMSO. Protéger de la lumière. Remarque: La solution stock peut être conservé à -20 ° C. </li><li> Diluer la solution mère dans un milieu de culture de cellules à une solution de travail avec une concentration de 10 uM (1: 1000 dilution). Protéger de la lumièreet d&#39;utiliser dès que possible. Remarque: La solution de travail peut être conservé à température ambiante pendant un certain temps (&gt; 1 h), cependant, la préparation d&#39;une solution de travail frais est fortement recommandée. </li><li> Ajouter 2 ul de la solution de travail à 1 ml de milieu (solution de charge) de culture cellulaire frais. </li><li> Charger les cellules en remplaçant le milieu de culture de cellules avec la solution de charge. Incuber pendant 15 min à 37 ° C, 5% CO 2 et une atmosphère humidifiée (incubateur). Attention: Presque tous les indicateurs de fluorescence sont exportés par les cellules plus de temps à vivre; donc éviter de chargement prolongée ou retardée analyse. </li><li> Sans lavage, placez le plat sous un microscope convenant pour l&#39;imagerie de cellules vivantes. Important: indicateurs de fluorescence sont très sensibles à la lumière, par conséquent, éviter l&#39;exposition inutile de lumière. </li><li> Acquérir des images sans modifier les paramètres d&#39;acquisition pour assurer la comparabilité entre les différentes images. </li></ol>

<ol><li>Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis%2C+vasculogenesis%2C+and+induction+of+healing+in+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+and+Endovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds.</a> Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).</li>
<li>Reinke, J. M., Sorg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Surgical+Research.+Europaische+Chirurgische+Forschung.+Recherches+Chirurgicales+Europeennes%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).</li>
<li>Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation.+1%3A+Its+role+in+the+healing+of+acute+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds.</a> Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).</li>
<li>Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((endothelial+progenitor+cell+mobilization%2C+and+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).</li>
<li>Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperbaric+oxygen+and+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells+in+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular%22%5BJournal%5D)">Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing.</a> Vascular. 14, 328-337 (2006).</li>
<li>Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+toxicology+of+sulfur+mustard-induced+cutaneous+inflammation+and+blistering%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering.</a> Toxicology. 263, 12-19 (2009).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+mustard+%28Chlorambucil%29+has+a+negative+influence+on+early+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development.</a> Toxicology. 263, 32-40 (2009).</li>
<li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-acetyl+cysteine+and+alpha-linolenic+acid+on+sulfur+mustard+caused+impairment+of+in+vitro+endothelial+tube+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation.</a> Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).</li>
<li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorambucil+%28nitrogen+mustard%29+induced+impairment+of+early+vascular+endothelial+cell+migration+-+Effects+of+alpha-linolenic+acid+and+N-acetylcysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine.</a> Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+endostatin+on+embryonic+vasculo-+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics+%3A+an+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).</li>
<li>Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cell+separations%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods in cell separations.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+VEGF-induced+endothelial+cell+migration+by+mitochondrial+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).</li>
<li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+substrates+for+human+umbilical+vein+endothelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry+%3A+Official+Publication+of+the+Biological+Stain+Commission%22%5BJournal%5D)">A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture.</a> Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> BioTechniques. 50, 98-115 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L&#39;exposition cutanée à des produits chimiques toxiques se traduit souvent par des troubles de cicatrisation sévère. Les mécanismes sous-jacents sont largement inconnues. La cicatrisation des plaies est un processus complexe qui se compose de différentes phases (hémostase, inflammation, prolifération et remodelage). La migration cellulaire est impliquée dans toutes les étapes, cependant, il est de la plus haute importance pour la formation du tissu de granulation. Ici, de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés soit ...

La migration cellulaire est important dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques y compris le développement, diverses maladies, et la cicatrisation après une blessure de la peau. Après une lésion de la peau, une inflammation des tissus durs supprime granulation et endommagées ou nécrotiques préliminaire fermeture de plaie et permet la formation d&#39;un réseau de nouveaux capillaires à travers la vasculogenèse (formation novel) ou l&#39;angiogenèse (bourgeonnement de vésicules existants) 3.1. Les deux vasculo- et nécessitent une angiogenèse migration des cellules endothéliales. Le réseau croissant de vaisseaux sanguins est essentielle pour le transport de l&#39;oxygène et des nutriments à la prolifération des kératinocytes qui subissent finalement kératinisation, former un nouvel épithélium et de fournir fermeture de la plaie. La migration des cellules endothéliales avec facultés affaiblies est une cause sous-jacente de cicatrisation 4,5 trouble. Ainsi, les méthodes pour évaluer la migration des cellules endothéliales premiers sont nécessaires pour explorer le pathophysiolgie des troubles de la migration cellulaire et d&#39;identifier de nouvelles stratégies d&#39;intervention thérapeutique. L&#39;exposition cutanée aux agents alkylants (par exemple, de soufre et d&#39;azote moutardes) provoque la cicatrisation trouble 6. Ces composés ont été utilisés comme agents de guerre chimique dans plusieurs conflits dans le 20ème siècle et restent raison de vives préoccupations en raison de stocks existants dans des régions politiquement instables et la synthèse relativement simple. Bien que le gaz moutarde a été synthétisé pour la première en 1822, la pathologie moléculaire et clinique de l&#39;exposition SM ne soit pas compris dans le détail et aucun antidote pour l&#39;exposition SM a été identifié. Plusieurs études ont été menées afin de comprendre et de modéliser la guérison des plaies après une exposition de SM et de tester des composés candidats potentiels capables de réserver cet effet. Schmidt et al. (2009) ont testé l&#39;effet de chlorambucil, un composé alkylant avec des propriétés similaires à SM dans mousoi modèles de corps embryoïdes et trouvé une dramatique, réduction parfois plus de 99% dans la formation de vaisseaux 7. Cet effet indésirable est le plus prononcé à un stade de développement qui, dans des conditions physiologiques, est dominé par la prolifération et la migration des cellules précurseurs endothéliales vasculaires. Ainsi, ces cellules ont été identifiés comme étant particulièrement sensible aux agents d&#39;alkylation. Steinritz et al. (2010) ont testé piégeurs de formes réactives de l&#39;oxygène (ROS), en particulier, la N-acétylcystéine (NAC) et de l&#39;acide alpha-linolénique (ALA) pour leur capacité à réduire la toxicité SM dans les modèles de l&#39;organisme de la souris embryoïdes et en particulier, à restaurer la formation de vaisseaux 8. Effets protecteurs temporaires ont été observés, ce qui indique que la formation excessive ROS était susceptible de contribuer aux effets néfastes de SM sur la cicatrisation. Ces effets ne sont pas permanentes et les deux composés candidats peuvent ne pas être capable de restaurer la formation des vaisseaux et la cicatrisation dans le long terme 8. However, ces expériences ont été menées dans un modèle 3D complexe qui a fait de permettre une enquête de la migration cellulaire. Ainsi, nous avons ensuite testé CNA et de l&#39;ALA pour les effets bénéfiques sur la migration des cellules de la CEE qui ont un rôle clé dans le processus de la formation de vaisseaux 9. En outre, il est prouvé que la polarité cellulaire est nécessaire pour la migration des cellules. Dysfonction mitochondriale conduisant à la formation de ROS a été montré à porter atteinte à la polarité cellulaire et peut donc nuire à la migration cellulaire. Par conséquent, imagerie des cellules vivantes à l&#39;égard de la fonction mitochondriale a été effectuée et les effets de charognards ROS ont été examinés. Le protocole suivant décrit les exigences générales pour la culture de la CEE, le dosage de la chambre de Boyden, la cicatrisation dosage y compris l&#39;analyse de suivi de la cellule et l&#39;utilisation de TMRM pour l&#39;évaluation de la fonction mitochondriale en détail. Les aspects importants de protocoles expérimentaux pour la culture et la migration CEE sont mis en évidence.

<table><tbody><tr><td>Chambre Boyden&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserts traités Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC), 24 puits - 3 & micro ; m</td><td>Corning Incorporated</td><td>#351151</td><td></td></tr><tr><td>Inserts traités par culture tissulaire (TC) Corning FluoroBlok, 24 puits - 8 & micro ; m</td><td>Life Sciences</td><td>#351152</td><td></td></tr><tr><td>(à utiliser avec Falcon Insert 24 puits Companion Plate (353504)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essai de cicatrisation des</td><td></td><td></td><td></td>plaies</tr><tr><td>Plats à fond de verre</td><td>Word Precision Instruments, Inc.</td><td>#FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Évaluation du potentiel</td><td></td><td></td><td></td>mitochondrial</tr><tr><td>TMRM (tétraméthylrhodamine methyl ester)</td><td>Life Technologies</td><td>#T669</td><td></td></tr><tr><td>Culture</td><td></td><td></td><td></td>cellulaire</tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA, Pasching, Autriche#</td> <td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-Acide linolénique</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Allemagne</td><td>&nbsp ;# L2376</td><td></td></tr><tr><td>Chlorambucil</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Allemagne#</td> <td>23125</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Allemagne</td><td># G2500-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de la migration des cellules endothéliales après une exposition à des produits chimiques toxiques

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

L&#39;exposition à des substances chimiques (y compris les agents alkylants de guerre chimiques tels que les moutardes à l&#39;azote et soufre) provoque une grande variété de symptômes cliniques, y compris le trouble de guérison de la plaie. Le processus physiologique de cicatrisation de la plaie est très complexe. La formation de tissu de granulation est une étape clé dans ce processus résultant dans un avant fermeture de la plaie et de fournir un réseau de nouveaux vaisseaux sanguins capillaires - soit par vasculogenèse (formation de roman) ou angiogenèse (la germination des navires existants). Les deux vasculo- et nécessitent une angiogenèse fonctionnel, la migration dirigée des cellules endothéliales. Ainsi, l&#39;enquête du début de cellules endothéliales (CEE) la migration est important de comprendre la physiopathologie de la plaie chimique induite par les troubles de guérison et de potentiellement identifier de nouvelles stratégies d&#39;intervention thérapeutique. Nous avons évalué la guérison des plaies après alkylation exposition de l&#39;agent et testé des composés candidats potentiels pour traitement. Nous avons utilisé un ensemble de techniques décrites dans ce protocole. Une chambre de Boyden modifiée pour enquêter quantitativement chimiokinèse des CEE est décrite. En outre, l&#39;utilisation de la cicatrisation dosage en combinaison avec l&#39;analyse de piste afin d&#39;évaluer qualitativement la migration est illustré. Enfin, nous démontrons l&#39;utilisation de la TMRM de colorant fluorescent pour l&#39;enquête du potentiel de membrane mitochondriale pour identifier les mécanismes sous-jacents de la migration cellulaire perturbé. Le protocole suivant décrit les techniques de base qui ont été adaptés pour l&#39;étude des CEE.

L&#39;exposition cutanée à des agents d&#39;alkylation provoque l&#39;érythème, la formation de cloques et une ulcération cutanée qui est associé à un trouble de la cicatrisation des plaies. La cicatrisation des plaies nécessite vasculogénèse angiogenèse et qui sont basées sur la migration des cellules endothéliales. Quantitative migration peut être évaluée en utilisant le dosage de la chambre de Boyden. Comme le montre la figure 1C de l&#39;exposition de la CEE au chlorambucil agent alkylant entraîné u...

L’étude de la migration précoce des cellules endothéliales (EEC) est importante pour comprendre la physiopathologie de certaines maladies et pour identifier potentiellement de nouvelles stratégies d’intervention thérapeutique. Le protocole suivant décrit les techniques d’évaluation de la migration cellulaire qui ont été adaptées pour l’étude de l’EEC.

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'examiner l'influence de produits chimiques toxiques sur la migration des cellules endothéliales à l'aide de différents tests de migration. Dans un premier temps, l'utilisation d'un test de chambre d'évitement modifié pour étudier la chimokinèse des cellules endothéliales exposées est démontrée dans l'expérience suivante. Un test de cicatrisation de blessure est combiné à un suivi cellulaire afin de fournir des informations supplémentaires approfondies sur la dynamique de la migration cellulaire.Dans le dosage final, l'investigation du potentiel de membrane mitochondrial est démontrée afin d'identifier les mécanismes sous-jacents à la migration altérée des cellules endothéliales. En fin de compte, ces dosages de migration peuvent être utilisés pour évaluer les effets d'agents alkylants hautement toxiques sur le potentiel de membrane mitochondrial et la migration des cellules endothéliales. Les méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine des troubles de la cicatrisation induits par des produits chimiques hautement toxiques, en démontrant que les procédures seront réalisées par Ramat, Voer et Stefan Miller, tous techniciens de mon laboratoire. Pour préparer les flacons de culture cellulaire, commencez par ajouter un volume suffisant de gélatine fraîchement préparée pour recouvrir juste le fond d'un flacon stérile de culture cellulaire.Placer le flacon dans une étuve à culture cellulaire pendant au moins 30 minutes. Ensuite, éliminer la solution de gélatine restante et transférer les cellules endothéliales précoces dérivées de cellules souches embryonnaires, ou EEC, dans un volume suffisant de milieu pour cultiver les cellules jusqu'à une confluence de 80 % lorsque les cellules ont atteint une sous-confluence. Retirer le milieu, rincer les cellules avec du PBS et les incuber dans un millilitre d'Accutase par 25 centimètres carrés pendant deux à dix minutes.Lorsque les cellules se sont détachées, divisez-les selon un rapport de un à cinq dans un milieu frais pour l'analyse de la migration des cellules endothéliales par test de chambre de Boyden. Pré-recouvrez les inserts filtrants avec 500 microlitres de gélatine 0,1 % fraîchement préparée. Après avoir récolté les EEC comme vient d'être montré, comptez les cellules et ajoutez 500 microlitres de milieu de culture cellulaire dans les compartiments inférieurs de la chambre de Boyden.Ensuite, ajouter exactement 1 × 10⁴ EEC dans 500 microlitres de milieu à chaque filtre. Puis, après avoir éliminé les bulles d'air, placer la chambre de Boyden dans l'incubateur pendant exactement huit heures. À la fin de l'incubation, rincer les filtres une fois avec du PBS.Fixez ensuite les cellules en ajoutant 0,5 millilitre de paraformaldéhyde à 4 % dans les deux compartiments après 20 minutes. Lavez les filtres au moins trois fois avec du PBS 0,1 molaire et excisez les membranes à l’aide du scalpel. Utilisez un milieu de montage supplémenté de DPI pour monter chaque membrane entre deux lamelles en verre.Veiller à noter l'orientation des filtres. Ensuite, utiliser un microscope fluorescent avec un grossissement de 400 x pour compter uniquement les cellules qui ont migré vers le compartiment inférieur. Prendre soin de ne pas confondre les pores avec les cellules migrantes.Pour initier le test de cicatrisation des plaies, détacher manuellement les cellules à partir d'une boîte de culture EEC à 80 % de confluence en faisant glisser délicatement une pointe de pipette stérile de 10 microlitres à la surface de la culture selon une ligne droite et uniforme, d'un côté de la boîte à l'autre. Laver la plaque deux fois avec du PBS 0,1 molaire afin d'éliminer les cellules détachées. Puis ajouter au récipient de culture un milieu enrichi du composé d'intérêt.Ensuite, placez la boîte de culture sous un microscope capable d'effectuer une imagerie de cellules vivantes dans des conditions de culture cellulaire, et acquérez des images en laps de temps pendant 24 heures à des intervalles de 10 minutes, en utilisant une résolution d'au moins 10 24 par 10 24 à la fin de la session d'imagerie. Utilisez l'outil logiciel approprié pour mesurer la largeur de l'intervalle à 0 et 24 heures afin de réaliser un test de suivi cellulaire. Importez la séquence d'images dans ImageJ et activez le module complémentaire MT TrackJ pour ImageJ.Ensuite, à l’aide de la commande d’ajout, sélectionnez aléatoirement 10 cellules dans le champ de vision afin de suivre manuellement le déplacement des cellules pendant la période d’imagerie de 24 heures. Utilisez la commande de mesure pour afficher les résultats. Puis, utilisez la commande de création de film pour exporter les trajectoires afin d’évaluer le potentiel membranaire mitochondrial des cellules après traitement avec le composé expérimental d’intérêt, remplacez le milieu de culture cellulaire par deux microlitres de TMRM fraîchement préparé dans un millilitre de milieu de culture cellulaire neuf.Moins, puis sans lavage immédiatement, placez la boîte sous le microscope et obtenez des images des cellules témoins et traitées expérimentalement sans modifier les paramètres d'acquisition. Pour assurer la comparabilité entre les différents groupes, la cicatrisation des lésions nécessite l'angiogenèse, qui dépend de la migration des cellules endothéliales, comme le montre le graphique. L'exposition des CEE à l'agent alkylant chlorambucil entraîne une diminution significative de la migration cellulaire, mesurée par le test de chambre de Boyden. L'ajout du piégeur d'espèces réactives de l'oxygène (ERO), ou alpha-linolénique, directement après 24 heures d'exposition au chlorambucil, restaure de manière significative le phénotype, atteignant presque les niveaux témoins.Cependant, le test de chambre de Boyden ne fournit pas d'information sur le comportement migratoire des cellules dans ce test représentatif de plaie et de cicatrisation. Les cellules EEC non exposées ont été capables de refermer l'intervalle en 24 heures, alors que les cellules EEC traitées au chlorambucil ne l'ont pas été. De plus, le suivi individuel des cellules EEC a révélé que les cellules exposées au chlorambucil présentaient peu de mouvement, mouvement qui a été rétabli après traitement avec le piégeur de ROS.En fait, les cellules endothéliales exposées au chlorambucil présentent une rupture de leur potentiel membranaire mitochondrial, comme en témoigne l'absence d'expression de TMRM. Toutefois, le traitement des cellules endothéliales avec un piégeur de ROS a empêché ces dommages mitochondriaux, préservant ainsi leur potentiel membranaire mitochondrial. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment analyser la migration de cellules endothéliales perturbées chimiquement en utilisant un test modifié de type « point dans une chambre », combiné à un test de cicatrisation par rayure, ainsi que la manière d'évaluer leur potentiel membranaire mitochondrial.

assessment-endothelial-cell-migration-after-exposure-to-toxic

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo montre une méthode pour tester la migration des interneurones en réponse à des signaux chimioattractifs provenant de cellules endothéliales périventriculaires (PVEC). Les interneurones sont placés dans un compartiment central, avec des PVEC et des cellules de contrôle de chaque côté. L’augmentation de la migration vers les PVEC indique une réponse positive à leurs signaux chimioattractifs.

Évaluation de la réponse interneuronale aux signaux chimioattractifs des cellules endothéliales périventriculaires

Nous avons développé un modèle in vitro qui imite un élément important de la réponse inflammatoire aiguë lors d'une infection de la vessie avec Escherichia coli uropathogènes. Le dosage de la migration des neutrophiles transuroepithelial permet une évaluation quantitative de la migration des neutrophiles humains à travers l'épithélium de la vessie, cultivées sur des supports perméables, en réponse à une infection bactérienne ou substances chimiotactiques.

Évaluation quantitative des neutrophiles migrations humaines à travers une culture d&#39;épithélium de la vessie

Dispositif de chambre de flux en trois dimensions est une...

A Novel tridimensionnelle chambre d&#39;écoulement périphérique pour étudier chimiokine dirigée extravasation des cellules circulantes des conditions d&#39;écoulement physiologiques

Couramment utilisés, des méthodes très accessibles pour examiner la migration cellulaire et l'invasion in vitro sont décrits. La première méthode est la fermeture de la plaie dosage de cellules qui mesure la motilité cellulaire. La deuxième méthode est la migration et l'invasion essai transwell qui évalue la capacité chimiotactique et invasif des cellules.

Dans la migration cellulaire in vitro et Invasion dosages

La migration des cellules est un phénomène biologique qui est impliquée dans une grande variété de physiologiques, telles que la cicatrisation des plaies et les réponses immunitaires, et des processus physiopathologiques, comme le cancer. La détermination de la migration de la matrice 3D-collagène est un outil polyvalent pour analyser les propriétés de migration de différents types de cellules à l'intérieur dans un environnement physiologique analogue à 3D.

Analyse de la migration cellulaire dans un tridimensionnelle Matrice Collagène

Nous rapportons une méthode in vitro qui permet de quantifier le nombre réel de cellules adhésives au sein d’une monocouche de cellules endothéliales.

La quantification des cellules endothéliales adhésivité<em&gt; In Vitro</em

Cette étude rend compte de deux méthodes différentes pour l’analyse de l’invasion cellulaire et migration : le test de chambre de Boyden et l’essai in vitro vidéo axée sur le microscope cicatrisation avec. Les protocoles de ces deux expériences sont décrites, et leurs avantages et leurs inconvénients sont comparés.

Évaluation de l’Invasion des cellules et le processus de Migration : une comparaison de la rayure axée sur le Microscope vidéo blessure test et le test de chambre de Boyden

Dans ce protocole, les lymphocytes sont placés dans la chambre supérieure d'un système de transmigration, séparés de la chambre inférieure par une membrane poreuse. La chimiokine est ajoutée à la chambre inférieure, qui induit une migration active le long d'un gradient de chimiokine. Après 48 h, les lymphocytes sont comptés dans les deux chambres pour quantifier la transmigration.

Évaluation de la migration des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo

Nous présentons trois essais in vitro simples -l'analyse de migration à longue distance, l'analyse de migration de co-culture, et l'analyse de chimio-attraction--qui évaluent collectivement les fonctions des cellules souches humaines dérivées des cellules périventriculaires endothéliales et de leur interaction avec les interneurons GABAergic.

Migrations, Chemo-Attraction et Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons (en anglais)

Nous présentons une méthode rentable à l’essai de migration de rayures qui fournit une nouvelle approche pour déterminer la migration cellulaire sans l’utilisation de méthodes à forte intensité d’équipement. Bien que les fibroblastes aient été utilisés dans ce protocole, ils peuvent être adaptés et utilisés pour étudier d’autres types de cellules et influences sur la migration cellulaire.

Un test de migration à gratter rentable et adaptable

Apprenez à évaluer la migration des cellules endothéliales après exposition à des produits chimiques toxiques. Cette méthode utilise des tests de migration pour analyser les mécanismes cellulaires impliqués dans les troubles de cicatrisation.

Évaluation de la migration des cellules endothéliales après une exposition à des produits chimiques toxiques

Explorer plus de vidéos