High Throughput Mesure de l'ADN extracellulaire de sortie et quantitative Formation NET dans les neutrophiles humains In vitro

L’objectif global de cette procédure est de quantifier les pièges extracellulaires de neutrophiles, ou TNE, libérés par les neutrophiles humains à grande échelle. Les méthodes présentées ici peuvent aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’inflammation et de l’altération des maladies inflammatoires grâce à l’étude du mécanisme et de la régulation de la formation in vitro de pièges extracellulaires de neutrophiles dans les neutrophiles humains. Les implications de cette technique impliquent l’identification d’une TNE centrale médiant les voies de signalisation et de molécules inhibitrices ou stimulant les TNE.

Pour isoler les neutrophiles du sang, aliquote 20 millilitres de sang humain dans des tubes coniques de 250 millilitres. Ajoutez 10 millilitres de dextran à 6 %, puis mélangez doucement et laissez reposer les solutions à température ambiante pendant 20 minutes. Transférez soigneusement la phase supérieure riche en leucocytes dans des tubes coniques propres de 50 millilitres et utilisez du PBS stérile pour remplir le tube jusqu’en haut.

Ensuite, centrifugez l’échantillon à 400 fois G pendant dix minutes et utilisez 15 millilitres de PBS stérile pour remettre la pastille en suspension. Répétez cette étape de lavage une fois de plus. Ensuite, préparez des gradients de percoll en cinq étapes de 85, 80, 75, 70 et 65 % dans des tubes coniques de 215 millilitres et superposez deux millilitres de suspension leucocytaire sur chaque gradient.

Ensuite, centrifugez les gradients à 800 fois G pendant 30 minutes avec la pause. Après centrifugation, récupérez les cellules dans les couches aux interfaces 75-80 % et 70-75 %. Utilisez le PBS pour laver les cellules deux fois, puis utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.

Pour mesurer la cinétique de libération d’ADN extracellulaire, préparez une suspension de neutrophiles dans un milieu de dosage à une concentration de deux fois dix à six cellules par millilitre. Ajoutez cinq micromoles par litre d’orange SYTOX, qui est un colorant de liaison à l’ADN imperméable à la membrane, et mélangez délicatement. Aliquote des neutrophiles humains dans des microplaques stériles à fond transparent noir à 96 puits, garantissant que le milieu de test couvre tout le fond du puits.

Si ce n’est pas le cas, tapotez doucement la plaque sur le côté. Réchauffez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pendant ce temps, utilisez un milieu de dosage à 37 degrés Celsius pour préparer des solutions contenant des stimuli au double de leurs concentrations finales à utiliser.

En tant que contrôle NET positif, préparez 100 nanomolaires d’acétate de myristate phorbol, ou PMA, pour traiter les neutrophiles humains pendant quatre heures afin de déclencher une libération maximale de TNE. Ensuite, préparez le fluorimètre à microplaques pour la mesure. Stimulez les neutrophiles en ajoutant 50 microlitres de solution de stimulus à 50 microlitres de suspensions de neutrophiles.

Ajoutez une concentration finale de 0,5 milligramme par millilitre de saponine dans un puits, pour mesurer le signal maximal de libération d’ADN. Placez la plaque dans le lecteur et mesurez les changements de fluorescence à deux minutes d’intervalle pendant quatre heures sans secouer. Pour analyser les données, calculez les augmentations normalisées de la fluorescence au fil du temps en soustrayant la fluorescence de référence des valeurs finales pour tous les puits, y compris la saponine.

L’augmentation de la fluorescence des saponine devrait être le signal le plus élevé et est appelée la libération maximale d’ADN. Faites la moyenne des résultats des réplicats et présentez-les en pourcentage de la libération maximale d’ADN. Pour quantifier la formation de TNE à l’aide de tests ELISA MPO-DNA et HNE-DNA, ajoutez des anticorps anti-MPO ou anti-HNE capture des anticorps à 96 puits à haute capacité de liaison et incubez-les pendant la nuit pour les enrober.

Le lendemain matin, utilisez 200 microlitres par puits de PBS pour laver les plaques ELISA trois fois. Utilisez ensuite 200 microlitres d’albumine sérique bovine à 5 %, ou BSA, et à 0,1 % d’albumine sérique humaine, ou HSA, pour bloquer les puits à température ambiante pendant deux heures. Dans le même temps, ensemencer les neutrophiles dans 100 microlitres de milieu de dosage sur une plaque de 96 puits à une densité de 100 000 cellules par puits et induire la formation de NET après l’ajout de stimuli en incubant à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.

Ensuite, effectuez une digestion limitée de la DNase en ajoutant deux unités par millilitre de DNAse aux surnageants de neutrophiles, puis mélangez bien et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, arrêtez la réaction en ajoutant 15 microlitres d’EGTA de 25 millimolaires et mélangez bien. Collectez les surnageants et nettoyez les tubes de microfuge et faites tourner les échantillons pour vous débarrasser des débris cellulaires à 300 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes.

La collecte de TNE sans digestion limitée entraîne des données incohérentes. L’étape limitée de digestion de l’ADN est essentielle pour obtenir des résultats reproductibles. Par conséquent, la concentration de l’enzyme DNase I et la durée de digestion ont été optimisées.

Transférez le surnageant dans des tubes de microfuge propres et conservez-le sur de la glace. Ensuite, à l’aide d’une aliquote de l’étalon NET préalablement préparée, préparer une dilution de un à deux dans le PBS et l’EGTA. Maintenant, utilisez PBS avec EGTA pour diluer vingt fois les échantillons digérés par la DNase I et les aliquote sur des plaques ELISA recouvertes d’anticorps de capture.

Incuber les assiettes pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Avant d’utiliser le PBS pour laver les plaques trois fois, appliquez 100 microlitres par puits d’une solution d’anticorps de détection telle qu’un anticorps anti-ADN conjugué à la peroxydase de raifort, et incubez dans l’obscurité pendant une heure. Après quatre lavages avec du PBS, ajoutez 100 microlitres par puits de substrat de la peroxydase TMB et incubez pendant 30 minutes.

La coloration bleue indique l’activité de la peroxydase et la présence de TNE. Pour arrêter la réaction, ajoutez 100 microlitres d’une molaire HCL. Les solutions bleues deviendront jaunes.

À l’aide d’un photomètre sur microplaques, lisez l’absorbance à 450 nanomètres. Pour comparer la quantité de complexes d’ADN-MPO ou d’ADN-HNE mesurée par rapport à l’étalon NET, soustrayez la densité optimale de fond de tous les échantillons et tracez les valeurs d’absorbance des échantillons étalons dilués par rapport à leur contenu NET relatif. À l’aide de l’intervalle non saturé de cette courbe standard, établissez une ligne de tendance à l’aide du meilleur ajustement exponentiel du logiciel utilisé.

Insérez les valeurs de DO mesurées des inconnues dans l’équation de la courbe de tendance qui donnera la quantité de TNE dans l’échantillon inconnu en pourcentage de la norme NET. Enfin, calculez les moyennes des répétitions et présentez les données finales sous forme de quantité de complexes MPO-ADN ou HNE-ADN. Voici des données représentatives d’un test de libération d’ADN basé sur la fluorescence de neutrophiles humains non stimulés ou activés par PMA ou P-aeruginosa.

P-aeruginosa déclenche la formation de TNE chez les PMN humains. Ce graphique illustre que les moyennes d’augmentation de la fluorescence des puits répliqués sont calculées, normalisées sur la fluorescence maximale et sont exprimées en libération d’ADN. Ces images de fluorescence représentent des neutrophiles non traités ou stimulés par la PMA.

Voici des images d’immunofluorescence de neutrophiles humains non stimulés, activés par PMA et PA01 à partir d’un test MPO-DNA et HNE-DNA Elisa. L’ADN extracellulaire présente une morphologie typique des TNE et colocalise avec le MPO et l’histone H4 citrullinée, un marqueur de la formation des TNET. Cette expérience montre la libération d’ADN-MPO et d’ADN-HNE dans les neutrophiles humains en utilisant le même test.

La norme NET contient en moyenne 19,5 microgrammes par millilitre d’ADN extracellulaire, 399 nanogrammes par millilitre de MPO et 103,4 nanogrammes par millilitre de HNE. Sur la base des poids moléculaires du MPO et du HNE, et du fait qu’un microgramme d’ADN contient 9,91 fois 10 à 14 nucléotides, l’étalon NET contient 109 molécules HNE et 147 molécules MPO pour 1 000 nucléotides. Enfin, des expériences de dilution en série de deux fois de l’étalon NET révèlent que les plages dynamiques des tests ELISA MPO-ADN et HNE-ADN sont comprises entre 19 et 609 nanogrammes par millilitre d’ADN.

Une fois maîtrisé, l’acide à base d’orange SYTOX peut être facilement et rapidement assemblé en une heure, ce qui permet d’obtenir des résultats le lendemain. Les tests de quantification NET sont également faciles à réaliser et donneront des données le lendemain s’ils sont effectués correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier la naturalase dans les neutrophiles humains à haut débit.