Name: High Throughput Mesure de lADN extracellulaire de sortie et quantitative Formation NET dans les neutrophiles humains In vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Découvrez des méthodes de haut débit pour quantifier la libération d'ADN extracellulaire et la formation de pièges extracellulaires de neutrophiles (NETs) chez l'humain. Ces techniques permettent d'étudier les mécanismes inflammatoires.

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Un merci spécial au personnel du laboratoire du Centre de santé de l’Université de Géorgie pour son soutien continu à notre travail d’isolement des neutrophiles humains. Ce travail a été soutenu par le fonds de démarrage du Dr Rada fourni par le bureau du vice-président de la recherche de l’UGA.

Le Conseil de l&#39;Université de Géorgie Institutional Review a approuvé l&#39;étude sur des sujets humains pour recueillir le sang périphérique de volontaires sains (UGA N ° 2012-10769-06). 5,7,8 bénévoles ont signé le formulaire de consentement éclairé nécessaire avant le prélèvement de sang. La recherche effectuée dans cet article est en conformité avec les directives éthiques pour la recherche médicale impliquant des sujets humains de la Déclaration d&#39;Helsinki. 1. Isolement des cellules neutrophiles du sang périphérique humain (Figure 1) Remarque: Il existe plusieurs façons d&#39;isoler les neutrophiles du sang périphérique. Le protocole suivant fournit une possibilité. Ce protocole donne un grand nombre de neutrophiles non activés humains capables de libérer les TNE lors d&#39;une stimulation externe. Utilisez 40 ml de sang total obtenu à partir de volontaires sains par ponction veineuse. 7,9 <ol><li> Aliquoter 20 ml de sang en deux 50 ml tubes coniques. Ajouter 10 ml de 6% de dextran. Mélanger délicatement. </li><li> Après 20 min de transfert leucocyte-rich phase supérieure sans prendre de globules rouges sédimentées dans 50 ml propres tubes coniques, et le remplir avec du PBS stérile. </li><li> Centrifugeuse à 400 g 10 min. Resuspendre le culot dans 4 ml de PBS stérile. </li><li> Préparer une 5 étape de gradient de Percoll 85% -80% -75% -70% -65% dans deux tubes de 15 ml coniques et la couche leucocytaire 2 ml de suspension au-dessus de chaque gradient. </li><li> Centrifugeuse 800 xg pendant 30 min avec freins hors. </li><li> Recueillir toutes les cellules (neutrophiles) dans les couches à 75% / 80% et 70% d&#39;interface / 75%. </li><li> Laver les cellules deux fois dans du PBS (350 x g, 10 min, RT) et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. </li></ol> 2. Mesure de la cinétique de l&#39;ADN extracellulaire édition à l&#39;aide d&#39;une microplaque fluorimètre Remarque: Cette méthode permet de mesurer des changements dans la fluorescence d&#39;une membrane imperméable à l&#39; ADN se liant à un colorant indiquant la libération d&#39; ADN dans un format de microplaque à 96 puits (figure 2). <ol><li> Préparer une suspension de neutrophiles dans le milieu de dosage (HBSS +1% (v / v) de sérum autologue + 5 mM de glucose) à une concentration de 2 x 10 6 cellules / ml. </li><li> Ajouter 5 umol / L de l&#39;imperméable colorant liant l&#39;ADN membranaire. Mélanger délicatement. </li><li> neutrophiles humains aliquotes (50 pl / puits) sur 96 puits noir, fond transparent microplaques. Assurez-vous que le milieu d&#39;essai couvre la totalité du fond du puits. Sinon, appuyez doucement la plaque sur le côté. </li><li> Réchauffez la plaque contenant des neutrophiles pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> En attendant de préparer des solutions de stimuli à deux de leurs concentrations finales à utiliser (en 37 ° C milieu d&#39;essai chaud). En tant que contrôle positif NET utiliser neutrophiles humains avec 100 nM phorbol-myristate-acétate (PMA) pendant 4 heures pour déclencher NET libération maximale. 5,8 PMA stimulation pendant 4 heures assure NET libération maximale tandis que la formation NET spontanée reste faible 5,8. </li><li> Préparer fluorimètre à microplaques pour la mesure (4 h, 37 ° C, 530 nm pour l&#39;excitation et 590 nm pour l&#39;émission). &lt;/ Li&gt; <li> Stimulez neutrophiles en ajoutant une solution de relance de 50 pi à 50 pi suspensions de neutrophiles. Utiliser 0,5 pg / ml de saponine dans un puits pour mesurer le signal maximal ADN de libération. </li><li> Placer la plaque dans le lecteur et mesurer les changements dans la fluorescence pendant 4 heures à toutes les 2 min sans agitation. </li><li> Pour l&#39;analyse des données, calculer les augmentations normalisées de fluorescence au fil du temps. <ol><li> Soustraire base de fluorescence à partir des valeurs d&#39;extrémité pour tous les puits , y compris la saponine (figure 2A, B). Hausse de la fluorescence de la saponine devrait être le signal le plus élevé. Il est appelé « la libération d&#39;ADN maximale&quot; (Figure 2A). </li><li> Calculer les pourcentages de libération d&#39;ADN dans des échantillons inconnus en divisant l&#39;augmentation de la fluorescence d&#39;échantillons inconnus par la libération d&#39;ADN maximale. </li><li> Les résultats moyens de répétitions et les présentent comme &quot;% de la libération d&#39;ADN maximal&quot; (figure 2C). </li></ol></li></ol> 3. Quantification du formulaire NETtion par FTU-ADN et ADN-HNE analyses ELISA Remarque: Ces tests (MPO-ADN) modifiés ou (HNE-ADN) établie dans notre laboratoire de quantifier la formation NET en mesurant les niveaux de MPO-ADN et complexes ADN-5 HNE. <ol><li> Manteau de 96 puits à haute capacité de liaison des plaques ELISA pendant une nuit avec des anticorps de capture (50 pl / puits): anti-MPO (1: 2000 dilution) ou anti-HNE (1: 2000). </li><li> Laver les plaques ELISA à trois reprises avec du PBS (200 ul / puits) et les bloquer avec 5% de BSA et 0,1% d&#39;albumine de sérum humain pendant 2 heures à la température ambiante (200 ul / puits). Laver trois fois avec du PBS. </li><li> neutrophiles de semences sur microplaques de 96 puits à une densité de 100.000 cellules / puits dans 100 milieu d&#39;essai de pi, et stimuler la formation NET. Incuber les cellules: 4 h pour 37 ° C. </li><li> Effectuer une digestion DNase limitée par addition de 2 U / ml de DNase à surnageants de neutrophiles, mélangez-les bien. Gardez-les à température ambiante. </li><li> Arrêter la DNase après 15 min par addition de 11 ul de 25 mM d&#39;EGTA (concentration finale 2,5 mM). Bien mélanger. Collecter susurnageants dans des tubes de microcentrifugation propres. échantillons de spin pour se débarrasser des débris de cellules à 300 xg pendant 5 min à température ambiante. Transférer leurs surnageants dans des tubes de microcentrifugation propres. Gardez-les sur de la glace jusqu&#39;au moment. </li><li> Utilisez une aliquote d&#39;un &quot;standard NET&quot; préparé précédemment. Remarque: Le NET-standard est un mélange de surnageants de DNase digéré de neutrophiles stimulées par PMA obtenues à partir d&#39;au moins 5 différents, donneurs humains indépendants. <ol><li> Pour utiliser la même norme pour une longue période, recueillir et aliquoter un volume important de surnageants de neutrophiles de chaque donateur individuel. Collecte par exemple 2 ml de surnageants de DNase digéré de neutrophiles stimulées par PMA se traduira par 200 aliquotes (10 pi chacun) suffisamment pour 200 plaques ELISA. Les données caractérisant la norme NET se trouvent dans la figure 5. </li><li> Stimulez neutrophiles humains avec 100 nM PMA pendant 4 heures et appliquer DNase digérer à leurs surnageants selon les étapes 3,4-3,5. </li><li> Collecter, piscine, aliquote (10 pi) et libreLes surnageants ze (-20 ° C) de neutrophile. </li><li> Pour préparer le &quot;NET-standard&quot;, décongeler un aliquote / donneur obtenu à partir d&#39;au moins cinq bailleurs de fonds distincts, les mélanger et de les garder sur la glace. </li><li> Jeter les échantillons décongelés et d&#39;utiliser les frais pour l&#39;expérience suivante. </li><li> Préparer une dilution 1: série 2 du NET-standard dans PBS + EGTA. </li></ol></li><li> Diluer les échantillons DNase1 digérées (standard et inconnus) surnageants 20 fois dans du PBS + EGTA et les aliquoter sur des plaques ELISA revêtues d&#39;anticorps de capture. </li><li> Incuber plaques ELISA pendant la nuit à 4 ° C et les laver trois fois avec du PBS. </li><li> Appliquer une solution d&#39;anticorps de détection (100 pl / puits): peroxydase de raifort conjuguée à un anticorps de cheval anti-ADN (1: 500, souris). Incuber pendant 1 heure dans l&#39;obscurité. </li><li> Après quatre lavages avec du PBS ajouter substrat de peroxydase TMB: 100 ul / puits, 30 mn. La coloration bleue est une indication de l&#39;activité de la peroxydase (filets présents). </li><li> Arrêter la réaction en ajoutant 100 pl / puits de 1 M HCl. lesolutions bleues deviennent jaunes (figure 5A). </li><li> Mesurer l&#39;absorbance à 450 nm en utilisant un photomètre de microplaques. </li><li> Pour l&#39;analyse des données, calculer la quantité de MPO-ADN ou des complexes ADN-HNE par rapport à la norme NET. <ol><li> Soustraire la valeur de densité optique de base du milieu d&#39;essai de tous les échantillons. </li><li> Tracer les valeurs d&#39;absorbance (axe X) des échantillons standards dilués contre leur contenu NET relative (axe Y) (figure 5A). </li><li> Utilisation de la gamme de cette courbe non saturé norme établit une ligne de tendance (utiliser le meilleur ajustement exponentielle à partir du logiciel utilisé) (figure 5A). L&#39;équation de cette ligne de tendance détermine la conversion des valeurs de DO quantitatifs quantités de TNE. </li><li> Insérez les valeurs de DO mesurées des inconnues dans l&#39;équation ligne de tendance à partir de 3.13.3 qui donnera la quantité de TNE dans l&#39;échantillon inconnu en pourcentage du NET-standard (figure 5A). </li><li> Calculermoyennes des répétitions (triplicats) et présenter les données finales comme «quantité de MPO-ADN ou des complexes ADN-(HNE% de la norme)&quot; (Figure 5C). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nat Med. 15, 623-625 (2009).</li>
<li>Leffler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+neutrophil+extracellular+traps+co-varies+with+disease+activity+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).</li>
<li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).</li>
<li>Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudogout-associated+inflammatory+calcium+pyrophosphate+dihydrate+microcrystals+induce+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).</li>
<li>Yoo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+cystic+fibrosis+airway+inflammatory+markers+from+Pseudomonas+aeruginosa-stimulated+human+neutrophils+involves+NADPH+oxidase-dependent+extracellular+DNA+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation.</a> J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%2C+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Rada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyocyanin-enhanced+neutrophil+extracellular+trap+formation+requires+the+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase.</a> PLoS One. 8, e54205(2013).</li>
<li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+peptide+LL-37+facilitates+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Biochem J. 464, 3-11 (2014).</li>
<li>Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+DNA+in+the+serum+of+cancer+patients+and+the+effect+of+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.</a> Cancer Res. 37, 646-650 (1977).</li>
<li>Raptis, L., Menard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+and+characterization+of+plasma+DNA+in+normals+and+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus.</a> J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).</li>
<li>Chang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cell-free+serum+DNA+detected+in+patients+with+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction.</a> Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

EVF représentent un nouveau mécanisme fascinant par lequel les neutrophiles tuer les agents pathogènes. 1 Bien que la littérature de TNE a connu une expansion continue au cours des dix dernières années , depuis leur découverte, plusieurs questions importantes liées à leur rôle dans la biologie, le mécanisme et la réglementation demeurent obscures. Une méthodologie appropriée doit être développée pour mesurer les TNE, ce mécanisme antimicrobien unique. Cet article décrit des procédés qui peuvent être utilisés ...

La formation de NET est un nouveau mécanisme par lequel les neutrophiles combattent les agents pathogènes. 1 Le cœur des TNE est l’ADN nucléaire. 1 Ce réseau d’ADN est associé à des protéines granulaires de neutrophiles et à des histones. 1 La forme principale de formation de TNE nécessite la mort des neutrophiles caractérisée par la décondensation de la chromatine, la disparition des membranes granulaires et nucléaires, la translocation de l’élastase des neutrophiles vers le noyau, la citrullination des histones et enfin le déversement de TNE à base d’ADN. deux Les TNE piègent et tuent une grande variété de microbes et constituent une partie essentielle du répertoire des armes immunitaires innées. La formation incontrôlée de TNE a cependant été liée à de nombreuses maladies auto-inflammatoires. 3,4 Malgré leur pertinence de plus en plus établie, on sait peu de choses sur le mécanisme et la régulation de la libération de TNE. 
Les neutrophiles qui meurent en libérant des TNE sont différents des neutrophiles apoptotiques ou nécrotiques. 3,5 Les neutrophiles libérant des TNE présentent plusieurs caractéristiques caractéristiques de la formation des TNET. Les composants granulaires sont associés à l’ADN dans les TNE. 1 La myéloperoxydase (MPO) et l’élastase neutrophile humaine (HNE) se trouvent toutes deux dans les granules primaires des cellules au repos, mais sont transloquées dans le noyau pour se lier à l’ADN dans les TNE. 1 Les complexes MPO-ADN et HNE-ADN sont spécifiques des TNE, ne se produisent pas dans les neutrophiles apoptotiques ou nécrotiques. La décondensation de la chromatine 1,3,5 est une autre caractéristique typique de la NETose. deux La libération de TNE nécessite également la citrullinisation des histones par la peptidyl aminidase 4 (PAD4). 6 Les histones citrullinées sont des caractéristiques des neutrophiles qui ont subi la libération de TNE. 6
Ici, trois méthodes sont introduites qui, combinées, fournissent d’excellents outils pour quantifier les TNE à grande échelle. Le premier test a été utilisé sur le terrain avec différents changements et quantifie la libération d’ADN extracellulaire sous forme de microplaque. Les deuxième et troisième tests confirment l’existence de TNE en mesurant les complexes MPO-ADN et HNE-ADN spécifiques des TNE.

<table><tbody><tr><td>Élastase anti-neutrophile humain&nbsp ; Lapin Ab&nbsp ;</td><td>Calbiochem</td><td>481001</td><td>1:2 000x</td></tr><tr><td>revêtement Anti-myéloperoxydase Ab (lapin)</td><td>Millipore</td><td>07-496</td><td>1:2 000x revêtement</td></tr><tr><td>DNase-1</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>1 &#181 ; g/ml utilisé pour</td></tr><tr><td>la digestion 20 mM EGTA/ PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>2,5 mM EGTA/PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>Détection de la mort cellulaire ELISA Anti-ADN POD</td><td>Roche</td><td>11544675001</td><td>1:500x&nbsp ;</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre de microplaques Eon</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 Logiciel de microplaques tout-en-un</td><td></td><td>Outil analytique</td> Biotek <td></td> (ELISA)</tr><tr><td>Sytox orange</td><td>Life Technology</td><td>S11368</td><td>0,2 % concentration finale/volume</td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td>Utilisation 10 mM concentration finale.</td></tr><tr><td>1 M de glucose</td><td>Sigma Utilisez 5</td><td></td><td>mM de concentration finale.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-023-CM</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Flash Ver.2.4.3</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P 8139</td><td>100 nM final used</td></tr><tr><td>ELISA Plate</td><td>Greiner bio-one 655061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques 15 ml</td><td>Thermoscientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques 50 ml</td><td></td><td>Thermoscientific 339652</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (pH 8,5-9,5)&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P 1644</td><td>Chlorure de sodium, Sigma, S7653-250G</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Spectrum</td><td>D1004</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 média</td><td>Corning Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 puits plaque d’essai plaque noire fond transparent</td><td>Costar</td><td>3603</td><td></td></tr></tbody></table>

high throughput mesure de l&#39;adn extracellulaire de sortie et quantitative formation net dans les neutrophiles humains<em&gt; in vitro</em

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Les granulocytes neutrophiles sont les leucocytes les plus abondants dans le sang humain. Les neutrophiles sont les premiers à arriver sur le site de l’infection. Les neutrophiles ont développé plusieurs mécanismes antimicrobiens, notamment la phagocytose, la dégranulation et la formation de pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles. Les TNE sont constituées d’un échafaudage d’ADN décoré d’histones et de plusieurs marqueurs granulaires, notamment la myéloperoxydase (MPO) et l’élastase neutrophile humaine (HNE). La libération de TNE est un processus actif impliquant des modifications morphologiques caractéristiques des neutrophiles conduisant à l’expulsion de leur ADN dans l’espace extracellulaire. Les TNE sont essentielles pour lutter contre les microbes, mais leur libération incontrôlée a été associée à plusieurs troubles. Pour en savoir plus sur la pertinence clinique et le mécanisme de formation des TNE, il est nécessaire de disposer d’outils fiables capables de quantifier les TNE. 
Ici, trois méthodes sont présentées qui permettent d’évaluer la libération de TNE à partir de neutrophiles humains in vitro. Le premier est un test à haut débit pour mesurer la libération d’ADN extracellulaire des neutrophiles humains à l’aide d’un colorant de liaison à l’ADN imperméable à la membrane. De plus, deux autres méthodes sont décrites capables de quantifier la formation de TNE en mesurant les niveaux de complexes MPO-ADN et HNE-ADN spécifiques de NET. La combinaison de ces méthodes basées sur des microplaques fournit d’excellents outils pour étudier efficacement le mécanisme et la régulation de la formation de TNE de neutrophiles humains.

Les chiffres de ce manuscrit décrivent le procédé d&#39;isolement des cellules neutrophiles, les procédures expérimentales et présentent des résultats représentatifs avec l&#39; explication de l&#39; analyse des données. La figure 1 montre les étapes successives de préparation neutrophile humaine. Ce protocole représente qu&#39;une seule façon possible de l&#39;isolement des neutrophiles. Il donne de grandes quantités de repos neutrophiles capables de libérer les TNE lor...

Des dosages à haut débit sont présentés qui, combinés, fournissent d’excellents outils pour quantifier la libération de TNE par les neutrophiles humains.

High Throughput Mesure de l&#39;ADN extracellulaire de sortie et quantitative Formation NET dans les neutrophiles humains<em&gt; In vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier les pièges extracellulaires des neutrophiles, ou NET, libérés par des neutrophiles humains à grande échelle. Les méthodes présentées ici peuvent aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l'inflammation et des maladies inflammatoires modifiées, grâce à l'étude du mécanisme et de la régulation de la formation in vitro des pièges extracellulaires des neutrophiles chez l'humain. Les implications de cette technique concernent l'identification de voies de signalisation centrales médiées par les NET, ainsi que de molécules inhibitrices ou stimulatrices des NET.Pour isoler les neutrophiles à partir du sang, aliquoter 20 millilitres de sang humain dans des tubes coniques de 250 millilitres. Ajouter 10 millilitres de dextrane à 6 %, puis mélanger doucement et laisser les solutions reposer à température ambiante pendant 20 minutes. Transférer soigneusement la phase supérieure riche en leucocytes dans des tubes coniques propres de 50 millilitres, et utiliser du PBS stérile pour remplir le tube jusqu'au bord.Ensuite, centrifuger l'échantillon à 400 fois G pendant dix minutes et utiliser 15 millilitres de PBS stérile pour resuspendre le culot. Répéter cette étape de lavage une fois supplémentaire. Préparer ensuite cinq gradients de Percoll en escalier de 85, 80, 75, 70 et 65 pour cent dans des tubes coniques de 215 millilitres et déposer délicatement deux millilitres de la suspension de leucocytes au-dessus de chaque gradient.Ensuite, centrifuger les gradients à 800 × g pendant 30 minutes sans frein. Après la centrifugation, récupérer les cellules présentes aux interfaces 75-80 % et 70-75 %. Laver les cellules deux fois avec du PBS, puis les compter à l’aide d’un hématimètre.Pour mesurer la cinétique de libération de l'ADN extracellulaire, préparez une suspension de neutrophiles dans le milieu de dosage à une concentration de deux fois dix puissance six cellules par millilitre. Ajoutez cinq micromoles par litre de SYTOX orange, un colorant inperméant à la membrane et se liant à l'ADN, puis mélangez délicatement. Répartissez les neutrophiles humains en aliquotes dans des microplaques stériles de 96 puits, noires à fond transparent, en veillant à ce que le milieu de dosage recouvre entièrement le fond de chaque puits.Sinon, tapez doucement sur le côté de la plaque. Incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pendant ce temps, utilisez du milieu d'essai à 37 degrés Celsius pour préparer des solutions contenant les stimuli à une concentration double de leur concentration finale prévue.En tant que contrôle positif de NET, préparez une solution de 100 nanomolaire de phorbol myristate acétate, ou PMA, afin de traiter les neutrophiles humains pendant quatre heures pour induire une libération maximale de NET. Ensuite, préparez le fluoromètre à microplaque pour la mesure. Stimulez les neutrophiles en ajoutant 50 microlitres de solution stimulante à 50 microlitres de suspensions de neutrophiles.Ajoutez une concentration finale de 0,5 milligrammes par millilitre de saponine à un puits afin de mesurer le signal maximal de libération d'ADN. Placez la plaque dans le lecteur et mesurez les variations de fluorescence par intervalles de deux minutes pendant quatre heures sans agitation. Pour analyser les données, calculez les augmentations normalisées de fluorescence au fil du temps en soustrayant la fluorescence de base des valeurs finales pour tous les puits, y compris celui contenant la saponine.L'augmentation de la fluorescence des saponines doit correspondre au signal le plus élevé et est appelée libération maximale d'ADN. Faire la moyenne des résultats des réplicats et les exprimer en pourcentage de la libération maximale d'ADN. Pour quantifier la formation des NETs à l'aide des tests ELISA MPO-ADN et HNE-ADN, ajouter les anticorps de capture anti-MPO ou anti-HNE sur des plaques ELISA à 96 puits à haute capacité de fixation, puis les incuber toute la nuit pour les enrober.Le lendemain matin, utiliser 200 microlitres par puits de PBS pour laver les plaques ELISA trois fois. Ensuite, utiliser 200 microlitres d'albumine sérique bovine à 5 %, ou BSA, et d'albumine sérique humaine à 0,1 %, ou HSA, pour bloquer les puits à température ambiante pendant deux heures. Pendant ce temps, ensemencer des neutrophiles dans 100 microlitres de milieu d'essai dans une plaque de 96 puits à une densité de 100 000 cellules par puits et induire la formation de NET après ajout de stimuli en incubant à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.Ensuite, réalisez une digestion limitée par l'ADNase en ajoutant deux unités par millilitre de DNase aux surnageants de neutrophiles, puis mélangez soigneusement et incubez à température ambiante pendant 15 minutes. Arrêtez ensuite la réaction en ajoutant 15 microlitres d'EGTA 25 millimolaire et mélangez bien. Récupérez les surnageants dans des tubes microcentrifuges propres et centrifugez les échantillons pour éliminer les débris cellulaires à 300 × g et à température ambiante pendant cinq minutes.Le recueil de NETs sans digestion limitée entraîne des données incohérentes. L'étape de digestion limitée de l'ADN est essentielle pour obtenir des résultats reproductibles. Par conséquent, la concentration de l'enzyme DNase I et la durée de la digestion ont été optimisées.Transférez le surnageant dans des tubes microcentrifuges propres et maintenez-les sur glace. Ensuite, à l’aide d’un aliquot du NET-standard préparé précédemment, préparez une dilution au 1/2 dans du PBS et de l’EGTA. Diluez ensuite les échantillons digérés par la DNase I d’un facteur vingt dans du PBS contenant de l’EGTA et répartissez-les en aliquots dans des plaques ELISA revêtues d’anticorps de capture.Incuber les plaques toute la nuit à quatre degrés Celsius. Avant d'utiliser du PBS pour laver les plaques trois fois, ajouter 100 microlitres par puits d'une solution d'anticorps de détection, comme un anticorps anti-ADN conjugué à la peroxydase de raifort, et incuber à l'obscurité pendant une heure. Après quatre lavages avec du PBS, ajouter 100 microlitres par puits de substrat TMB pour la peroxydase et incuber pendant 30 minutes.La coloration bleue indique une activité de la peroxydase et la présence de NETs. Pour arrêter la réaction, ajouter 100 microlitres d'acide chlorhydrique un molaire. Les solutions bleues deviendront jaunes.À l'aide d'un photomètre de microplaque, mesurez l'absorbance à 450 nanomètres. Pour comparer la quantité de complexes MPO-ADN ou HNE-ADN mesurée par rapport au standard de NET, soustrayez la densité optique du fond de toutes les échantillons et tracez les valeurs d'absorbance des échantillons standards dilués en fonction de leur teneur relative en NET. À partir de la plage non saturée de cette courbe standard, établissez une droite de tendance en utilisant le meilleur ajustement exponentiel fourni par le logiciel utilisé.Insérez les valeurs d'OD mesurées des échantillons inconnus dans l'équation de la droite d'étalonnage, ce qui donnera la quantité de NETs dans l'échantillon inconnu exprimée en pourcentage par rapport à l'étalon de NETs. Enfin, calculez les moyennes des réplicats et présentez les données finales comme la quantité de complexes MPO-ADN ou HNE-ADN. Les données représentatives présentées ici proviennent d'un dosage de la libération d'ADN par fluorescence réalisée sur des neutrophiles humains laissés non stimulés ou activés par le PMA ou P-aeruginosa.P. aeruginosa induit la formation de NETs chez les PMN humains. Ce graphique illustre que les moyennes de l'augmentation de la fluorescence des puits en réplicats sont calculées, normalisées par rapport à la fluorescence maximale et exprimées en tant que libération d'ADN. Ces images de fluorescence représentent des neutrophiles laissés non traités ou stimulés avec du PMA.Des images d'immunofluorescence de neutrophiles humains non stimulés, activés par le PMA ou par PA01, provenant d'un test Elisa MPO-ADN et HNE-ADN sont présentées ici. L'ADN extracellulaire présente une morphologie typique des NETs et colocalise avec la MPO et l'histone H4 citrullinée, un marqueur de la formation des NETs. Cette expérience montre la libération de MPO-ADN et d'HNE-ADN par les neutrophiles humains à l'aide du même test.Le standard NET contient en moyenne 19,5 microgrammes par millilitre d'ADN extracellulaire, 399 nanogrammes par millilitre de MPO et 103,4 nanogrammes par millilitre d'HNE. En se basant sur les masses moléculaires de la MPO et de l'HNE, et sachant qu'un microgramme d'ADN contient 9,91 × 10¹⁴ nucléotides, le standard NET contient 109 molécules d'HNE et 147 molécules de MPO pour 1 000 nucléotides. Enfin, des expériences de dilutions sérielles par facteur deux du standard NET révèlent que les plages dynamiques des tests ELISA MPO-ADN et HNE-ADN se situent entre 19 et 609 nanogrammes par millilitre d'ADN.Une fois maîtrisée, la technique basée sur l'acide SYTOX orange peut être facilement et rapidement assemblée en une heure, conduisant à des résultats le lendemain. Le dosage de quantification des NET est également aisé à réaliser et fournira des données dès le jour suivant, s'il est correctement effectué. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode de quantification de la naturalase dans les neutrophiles humains selon une approche à haut débit.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente une technique in vitro pour générer et isoler des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE). Les neutrophiles sont isolés du sang périphérique et stimulés avec de l’acétate de myristate de phorbol (PMA) pour produire des TNE. Au cours de l’incubation, les neutrophiles subissent un processus de mort cellulaire (NETosis) pour libérer des TNE composées de chromatine décondensée mélangée à des protéines cytoplasmiques granulaires.

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L'adhésion des neutrophiles à l'endothélium activé sur les sites d'infection est une partie intégrante de la réponse inflammatoire de l'hôte. Décrite dans le présent rapport est une analyse de liaison des neutrophiles qui permet...

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont des réseaux d'ADN, les histones et les protéines de neutrophiles. Bien qu'une composante de la réponse immunitaire innée, TNE sont impliqués dans l'auto-immunité et de la thrombose. Ce protocole décrit une méthode simple pour l'isolement des cellules neutrophiles canins et la quantification de TNE en utilisant un dosage de fluorescence de microplaque.

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