Name: Imagerie non invasive de la réponse immunitaire innée dans un modèle de poisson zèbre larves de Streptococcus iniae Infection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Découvrez la microinjection de Streptococcus iniae dans la vésicule otique de larves de Danio rerio pour imager la réponse immunitaire innée en temps réel. Cette méthode permet d'étudier les interactions hôte-pathogène.

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Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire pour les soins de poisson zèbre et la maintenance. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health, National Service Award recherche A155397 à EA Harvie et NIH R01GM074827 à Anna Huttenlocher.

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La méthode d&#39;infection utilisé ici est utile pour l&#39;étude de la réponse immunitaire de l&#39;hôte à une infection localisée initialement dans 2 à 3 dpf embryons et les larves. La mise au point d&#39;un stimulus inflammatoire, comme une infection, dans une cavité fermée de telle sorte que la vésicule otique permet l&#39;étude de la chimiotaxie de neutrophiles et de macrophages et de phagocytose. Une mise en garde de l&#39;injection de bactéries dans la vésicule otique est que la capacité des neutrophiles à phagoc...

Streptococcus iniae est un agent pathogène aquatique majeur qui est capable de provoquer une maladie systémique dans les poissons et les humains 1. Bien que S. iniae est responsable de pertes importantes dans l&#39;industrie de l&#39;aquaculture, ce est aussi un agent pathogène zoonotique potentiel, capable de provoquer une maladie chez les hôtes humains immunodéprimés atteints de pathologies cliniques similaires à ceux causés par d&#39;autres agents pathogènes humains streptocoques. Compte tenu de ses similitudes avec des agents pathogènes humains, il est important d&#39;étudier S. iniae pathogenèse des maladies dans le contexte d&#39;un hôte naturel. Un modèle de poisson zèbre adulte de S. infection iniae a révélé l&#39;infiltration robuste de leucocytes d&#39;accueil sur le site de l&#39;infection localisée ainsi comme un temps rapide d&#39;accueillir la mort, un temps trop court pour impliquer le système immunitaire adaptatif 7. Afin d&#39;obtenir un regard en profondeur dans la réponse immunitaire innée à S. iniae infection in vivo, il est nécessaire d&#39;utiliser un modèle qui est plus favorable à nsur-invasive imagerie en temps réel. Le poisson zèbre larves a un certain nombre d&#39;avantages qui en font un modèle vertébré plus en plus attrayant pour étudier les interactions hôte-pathogène. Poisson zèbre sont relativement peu coûteux et facile à utiliser et à entretenir par rapport aux modèles de mammifères. L&#39;immunité adaptative est pas fonctionnellement matures jusqu&#39;à 4-6 semaines après la fécondation, mais les larves ont un système immunitaire inné des vertébrés hautement conservée avec le complément, Toll-like récepteurs, les cytokines et les neutrophiles et les macrophages avec des capacités antimicrobiennes y compris la phagocytose et la bouffée respiratoire 2-6, 8-11. En outre, la traçabilité génétique et la transparence optique des stades embryonnaires et larvaires de développement pour permettre la génération de lignées transgéniques stables avec les cellules immunitaires marquées par fluorescence permettant d&#39;étudier les interactions hôte-pathogène en temps réel in vivo. La génération de ces lignées transgéniques en utilisant une protéine photoconvertible tels que DenDRA2 permet le suivi de l&#39;origine de la cellule hôte et le destin individuel au cours de l&#39;infection 12. Lors de l&#39;élaboration d&#39;un modèle d&#39;infection des larves de poisson zèbre, le site choisi de microinjection permettra de déterminer si une infection est initialement localisée ou systémique. Infections du sang systémique dans la veine caudale ou un conduit de Cuvier sont les plus couramment utilisées pour étudier les pathogènes microbiens chez le poisson zèbre et sont utiles pour étudier les interactions entre l&#39;hôte et des cellules microbiennes, les réponses de cytokines, et les différences de virulence entre les souches pathogènes. Pour les micro-organismes à croissance plus lente, une injection précoce dans le sac vitellin d&#39;un embryon au stade 16-1,000 cellulaire peut être utilisée pour générer une infection systémique 13,14, avec le stade de développement optimal pour la micro-injection d&#39;un micro-organisme à croissance lente jugée entre l&#39;étape 16 à 128 de la cellule 15. Toutefois, le jaune injections sac de nombreux microbes à des stades ultérieurs de développement hôte ont tendance à être mortelle à til accueillera en raison de l&#39;environnement riche en nutriments pour le microbe et le manque de leucocytes infiltrants 16-18. Une infection localisée se traduit généralement par la migration dirigée des leucocytes vers le site de l&#39;infection qui peut être facilement quantifiée par imagerie non invasive. Ce type d&#39;infection peut permettre pour la dissection des mécanismes qui interviennent dans la migration des leucocytes ainsi que des enquêtes de différentes capacités migratoires et phagocytaires de diverses populations leucocytaires. Infections localisées sont également utiles lors de l&#39;examen des différences de virulence entre les souches bactériennes ainsi que l&#39;étude des mécanismes d&#39;invasion de microbes depuis barrières de l&#39;hôte physiques doivent être croisés pour une infection localisée à devenir systémique. Poisson zèbre sont généralement soulevé à des températures de 25-31 ° C 19, mais ils peuvent aussi être maintenu à des températures aussi élevées que 34 à 35 ° C pour les études de l&#39;envahissement de certains agents pathogènes humains avec les exigences de température strictespour la virulence 20, 21. De nombreux sites différents ont été utilisés pour générer une infection bactérienne localisée initialement compris le ventricule du cerveau postérieur 22, queue muscle dorsal 18, la cavité péricardique 23, et la vésicule otique (oreille) 5, 16, 24. Cependant, il a été trouvé que l&#39;injection des bactéries en queue muscle peut causer des dommages aux tissus et l&#39;inflammation indépendante des bactéries, ce qui peut fausser les résultats lorsque l&#39;enquête réponse des leucocytes 13. Bien que moins de dommages est associé à l&#39;injection dans le cerveau postérieur et bien que ce est d&#39;abord dépourvu de leucocytes chez les jeunes embryons, le ventricule rhombencéphale gagne progressivement les cellules immunitaires dans le temps que les microglies se installent. Le ventricule rhombencéphale est également un endroit plus difficile à l&#39;image. La vésicule otique est une cavité creuse fermée sans accès direct à la vascularisation 25, 26. Il est normalement dépourvue de leukocytes leucocytes, mais peuvent être recrutés pour la vésicule otique en réponse à des stimuli inflammatoires telles que l&#39;infection. Il est également un site privilégié de la micro-injection de bactéries chez le poisson zèbre ans après la fécondation (DPF) 2-3 jours en raison de la facilité d&#39;imagerie et la visualisation de l&#39;injection. Par conséquent, nous avons choisi la vésicule otique que notre site d&#39;infection bactérienne localisée.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml Eppendorfs</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Tube Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>27 G x &frac12 ; aiguille BD</td><td>Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>plaque à 96 puits</td><td>Corning Incorporated</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Sondes moléculaires rouges CellTracker</td><td>, Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CNA agar</td><td>Dot Scientific, Inc</td><td>7126A</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert jetables</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7m</td><td></td></tr><tr><td>Lunette de dissection</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>MDS</td><td>2292</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler fine</td><td> Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Peigne gel</td><td>VWR</td><td>27372-482</td><td>4,2 mm de largeur, 1,5 mm d’épaisseur</td></tr><tr>Plats <td></td><td></td><td>à fond en verre</td><td>Fabriqué sur mesure en perçant un trou de 16 à 18 mm au centre d’un fond de plat de culture tissulaire de 35 mm et en plaçant une lamelle ronde #1 de 22 mm dans le trou et en scellant avec une fine couche d’adhésif optique Norland 68 durci à la lumière UV.</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à haut point de fusion</td><td>Denville Scientific, Inc.</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Olympus</td><td>avec système</td><td></td>FV-1000</tr><tr><td>Agarose à bas point</td><td>de fusion Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Support magnétique</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Système de micro-injection</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Embouts de pipette à microchargeur</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotmètre</td><td>Nanodrop Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourée (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldheyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-4557</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Ricca Chemoical Company</td><td>572516</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>165921</td><td></td></tr><tr><td>Protease peptone</td><td>Fluka Biochemika</td><td>29185</td><td></td></tr><tr><td>Petite boîte de culture cellulaire</td><td>Corning Incorporated</td><td>430165</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2380</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles d’injection capillaire en verre à paroi mince</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt</td><td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td><td>T1438</td><td></td></tr><tr><td>Tricaïne (3-aminobenzoate d’éthyle)</td><td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fluka Biochemika</td><td>Référence 92144</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie non invasive de la réponse immunitaire innée dans un modèle de poisson zèbre larves de<em&gt; streptococcus iniae</em&gt; infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

L&#39;agent pathogène aquatique, Streptococcus iniae, est responsable de plus de 100 millions de dollars de pertes annuelles pour l&#39;industrie de l&#39;aquaculture et est capable de provoquer une maladie systémique dans les deux poissons et les humains. Une meilleure compréhension de S. maladie iniae pathogénie nécessite un système de modèle approprié. La traçabilité génétique et la transparence optique des premiers stades de développement du poisson zèbre pour permettre la génération et l&#39;imagerie non-invasive de lignées transgéniques avec étiqueté par fluorescence des cellules immunitaires. Le système immunitaire adaptatif est pas complètement fonctionnel jusqu&#39;à plusieurs semaines après la fécondation, mais larves de poisson zèbre ont un système immunitaire inné de vertébré conservé à la fois les neutrophiles et les macrophages. Ainsi, la génération d&#39;un modèle d&#39;infection larvaire permet l&#39;étude de la contribution spécifique de l&#39;immunité innée dans le contrôle de S. infection iniae. Le site de micro-injection permettra de déterminer si une infection estsystémique ou localisée initialement. Ici, nous présentons nos protocoles pour l&#39;injection de vésicule otique du poisson zèbre âgés de 2-3 jours après la fécondation ainsi que nos techniques d&#39;imagerie confocale de fluorescence de l&#39;infection. Un site d&#39;infection localisée permet l&#39;observation de l&#39;invasion microbienne initiale, recrutement des cellules hôtes et la diffusion de l&#39;infection. Nos résultats en utilisant le modèle des larves de poisson zèbre de S. iniae infection indiquent que le poisson zèbre peut être utilisé pour examiner les différents apports de neutrophiles et les macrophages d&#39;accueil dans les infections bactériennes localisées. En outre, nous décrivons comment photomarquage des cellules immunitaires peut être utilisé pour suivre le destin des cellules hôte individuel au cours de l&#39;infection.

Microinjection de S. iniae dans la vésicule otique (Figure 1 et Figure 2) conduit à une réponse de l&#39;hôte initialement localisée. Lorsqu&#39;elle est injectée correctement, les bactéries doivent seulement être vu dans la vésicule otique et non dans le tissu ou le sang environnant. Ceci peut être visualisé au cours de la micro-injection en utilisant un colorant rouge de phénol (figure 1A). Alternativement, si bactéries marquées sont injectées, une analyse ra...

Ici, nous présentons un protocole pour la génération et l’imagerie d’une infection bactérienne localisée dans la vésicule otique du poisson zèbre.

Imagerie non invasive de la réponse immunitaire innée dans un modèle de poisson zèbre larves de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

L'objectif général de cette procédure est d'injecter par microinjection des larves de poisson zèbre avec un agent pathogène bactérien, Streptococcus IEA, afin d'obtenir une imagerie en direct non invasive de la réponse immunitaire de l'hôte. Cette opération s'effectue tout d'abord en chargeant l'aiguille de microinjection avec une suspension bactérienne, puis en alignant des larves de poisson zèbre anesthésiées sur le moule d'injection en agarose. Ensuite, la suspension bactérienne est injectée par microinjection dans la vésicule otique des larves.Ensuite, les larves injectées sont montées dans de l'agarose à bas point de fusion. Enfin, les cellules immunitaires de l'hôte sont marquées par photo-étiquetage pour un suivi facile, et l'infection est observée à l'aide d'un microscope confocal. En définitive, l'injection microscopique de Streptococcus iniae dans la vésicule otique, ainsi que le photo-étiquetage et la microscopie confocale qui suivent, sont utilisées pour étudier la réponse immunitaire de l'hôte chez les larves de poisson zèbre.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'injection dans la veine caudale, est que l'injection dans la vésicule otique provoque une infection bactérienne localisée, permettant ainsi l'imagerie non invasive des interactions hôte-pathogène chez la larve de zebrafish transparente. Pour commencer, préparez une solution d'agarose à 1,5 à 2 % à point de fusion élevé dans le milieu E3, puis chauffez-la au micro-ondes jusqu'à ce que la solution devienne limpide. Une fois refroidie, versez un peu d'agarose dans une boîte de Pétri, en ajoutant juste assez pour recouvrir le fond de la boîte, puis faites tourner doucement.Une fois que l'agarose est solidifiée, placez un peigne à gel rincé et séché par-dessus de sorte que l'extrémité solide repose légèrement sur le dessus de la boîte de Pétri et que l'extrémité encochée touche l'agarose. Veillez à ce que le peigne soit aussi horizontal que possible, formant un angle de 30 degrés par rapport à la couche inférieure d'agarose. Versez une petite quantité supplémentaire d'agarose à l'interface entre le peigne et la couche inférieure d'agarose afin que la nouvelle couche d'agarose recouvre les puits du peigne.Laisser refroidir complètement avant de retirer le peigne. Ensuite, à l’aide d’une pipette, retirer tous les morceaux excédentaires d’aros présents dans les puits. Verser le milieu E trois sur le moule d’injection et conserver à quatre degrés Celsius.Après avoir préparé l'inoculum de SNEA et les larves de poisson zèbre pour les injections conformément au protocole décrit, allumez le micro-injecteur et réglez la durée sur une échelle en millisecondes. Ouvrez le robinet du réservoir de dioxyde de carbone pour permettre au gaz de s'écouler dans la conduite. La pression du micro-injecteur doit afficher environ 20 PSI. Vortexez la culture de SNEA préparée dans du rouge de phénol et du PBS, puis utilisez une pipette micro-loader pour charger deux à trois microlitres de la culture dans une micropipette capillaire tirée. Montez la micropipette chargée sur un micromanipulateur fixé à un support magnétique et positionnez-la sous un microscope stéréo de sorte que la micropipette forme un angle d'environ 45 à 65 degrés par rapport à la base du microscope.Tout d'abord, cassez délicatement la pointe de l'aiguille à l'aide d'une pince fine, puis appuyez sur la pédale du micro-injecteur pour déposer une goutte d'inoculum sur l'extrémité de l'aiguille. Utilisez la barre d'échelle présente dans l'oculaire du microscope pour mesurer le diamètre de la goutte. Le diamètre de la goutte doit être d'environ 0,10 millimètre, ce qui correspond à un volume d'environ un nanolitre.Pour ajuster la taille des gouttes, modifiez le réglage de la durée sur le micro-injecteur ou utilisez une pince fine pour couper davantage l'extrémité de l'aiguille. Le temps d'injection doit être compris entre 20 et 35 millisecondes afin d'éviter des dommages tissulaires excessifs. Ensuite, à l’aide d’une pipette plastique de transfert, transférez un poisson par puits dans chacun des 12 puits du moule d’injection.Ensuite, à l’aide d’une tige en verre, d’une anse en cheveu ou d’une micropipette en plastique, positionner délicatement les larves de manière à ce que leurs têtes soient orientées vers l’arrière du microscope et que leurs sacs vitellins soient contre le côté gauche du puits. Orienter l’oreille gauche des larves vers le haut, en direction du plafond. Lorsque les larves sont prêtes pour l’injection, utiliser les molettes du micromanipulateur pour aligner l’aiguille chargée avec la vésicule otique, de sorte que les deux se trouvent dans le même champ de vision.Avec la pointe de l'aiguille, percer la couche épithéliale externe de la vésicule otique de manière à ce que la pointe se trouve juste à l'intérieur de la vésicule. Ensuite, en appliquant une pression suffisamment faible pour ne pas rompre la cavité, appuyer sur la pédale au pied pour injecter un nanolitre de la dose souhaitée de SNEA. Si l'injection est réussie, la vésicule otique, mais pas les tissus environnants, doit se remplir d'un inoculum au rouge de phénol.Retirer délicatement l'aiguille hors des larves et, sous une amplification de cinq fois, déplacer manuellement la plaque d'injection afin que les larves soient en vue. Si l'on injecte des bactéries marquées au fluorochrome sous un microscope à fluorescence, examiner visuellement les larves injectées et conserver uniquement celles où le dépôt de bactéries s'est produit exclusivement à l'intérieur de la vésicule otique, afin de garantir que le volume injecté reste constant tout au long de l'expérience. Après avoir injecté chaque 48e embryon, injecter une goutte de suspension bactérienne dans un tube de centrifugation de 1,7 millilitre contenant 100 microlitres de PBS stérile.Ensuite, ensemencer les 100 microlitres sur des boîtes de THY supplémentées de P auger, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant toute une nuit. Pour déterminer l'UFC dans le volume d'injection, une fois qu'un groupe complet de 12 larves sur la rampe d'injection a été injecté, utiliser soigneusement une pipette plastique de transfert pour retirer les larves des puits et les placer dans une nouvelle boîte de Pétri. Retirer la solution trica et la remplacer par environ deux millilitres de milieu E trois frais afin de permettre aux larves de se rétablir.Incuber les embryons conformément au protocole indiqué dans le texte. Après avoir préparé les aros avec du trica, conformément au protocole indiqué dans le texte à l’étape du microscope stéréo, utiliser une pipette de transfert pour placer quatre à cinq larves anesthésiées dans une boîte en verre à fond plat. Retirer la solution de trica et d’aro du bain-marie à 55 degrés Celsius et laisser refroidir à température ambiante pendant une à deux minutes.Entre-temps, retirez autant de liquide que possible des larves anesthésiées. Ensuite, versez l'agar refroidi dans la boîte jusqu'à ce qu'environ la moitié de la surface soit recouverte. Puis faites tourner doucement la boîte pour répartir l'agar.Prendre les larves qui ont flotté sur les bords de la boîte et les repipeter au centre. Ensuite, sous microscope stéréo, utiliser une pipette longue pour positionner délicatement les larves comme souhaité pour l'acquisition d'images. Pour la vésicule otique, positionner les larves de sorte que la vésicule otique droite soit orientée vers le haut et que la vésicule otique gauche soit à plat contre le fond de la boîte.Laisser refroidir les aros pendant environ 10 minutes avant de déplacer le plat. Ensuite, pipeter délicatement une solution de trica et E trois sur la couche des aros afin de la maintenir humide. Pour visualiser les échantillons, utiliser un scan Zack avec les lasers de 488 nanomètres et 543 nanomètres.Utilisez la numérisation en ligne continue pour régler la puissance du laser et le gain du détecteur. Vérifiez qu'aucune fluorescence rouge n'a été accidentellement photoconvertie dans la fenêtre de contrôle d'acquisition d'image. Dans les paramètres de stimulation, sélectionnez l'outil de numérisation et choisissez principal, sélectionnez le laser de 405 nanomètres et réglez-le à 70 % de puissance.Ensuite, à l’aide de l’option cercle, définissez la région d’intérêt dans la vésicule odyque ; dans le paramètre de début du stimulus, sélectionnez une activation en série avec une pré-activation d’une image et une durée d’activation de 60 000 millisecondes dans la fenêtre de paramétrage de l’acquisition. Sous l’en-tête « balayage temporel », choisissez deux intervalles d’une minute chacun, un pour l’acquisition avant et un pour celle après la photoconversion. Démarrez la série en laps de temps pour initier la photoconversion de la région d’intérêt définie.Enfin, analyser l'échantillon à l'aide d'un Zack et des lasers de 488 et 543 nanomètres. Pour visualiser la fluorescence rouge photo-convertie, ainsi que toute fluorescence verte résiduelle, l'injection microscopique de SNEA dans du phénol rouge dans la vésicule otique entraîne une réponse hôte initialement localisée qui, lorsqu'elle est injectée correctement, ne devrait être observée que dans la vésicule otique et non dans les tissus environnants ou dans le sang. Alternativement, si des bactéries marquées sont injectées, un balayage rapide des larves infectées immédiatement après l'injection peut confirmer que les bactéries se trouvent uniquement dans la vésicule otique et non dans les tissus adjacents.Les sites d'injection microscopique d'une infection initialement localisée sont utiles pour étudier la chimiotaxie des leucocytes, comme illustré ici. Le recrutement des leucocytes peut être quantifié soit par la coloration au noir de Soudan des granules des neutrophiles, soit par la fixation au formaldéhyde de lignées transgéniques fluorescentes, en utilisant des lignées de poisson-zèbre transgéniques exprimant la protéine verte fluorescente Dendra deux, spécifiquement dans les macrophages ou les neutrophiles. Ces dernières ont révélé que l'injection de NEA dans la vésicule otique déclenchait le recrutement de neutrophiles et de macrophages ainsi que la phagocytose des bactéries dans les 60 minutes suivant l'infection.Dans cette figure, deux macrophages marqués par DRA, recrutés vers la vésicule otique cinq heures après l'infection, ont été photoconvertis puis suivis pendant les 24 heures suivantes. Bien que certains de ces cellules photoconverties restent dans la vésicule otique ou la région de la tête, d'autres se sont également retrouvées disséminées dans tout le corps des larves, comme on le voit ici. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une microinjection de streptococcus n EEA dans la vésicule otique de poisson-zèbre âgés de trois jours post-fécondation.Cela comprend : un, aligner des larves anesthésiées sur le moule d'injection et charger l'aiguille avec l'inoculum bactérien ; deux, micro-injecter des bactéries dans la vésicule otique ; trois, monter les larves infectées dans de l'agarose à bas point de fusion ; et quatre, utiliser un microscope confocal pour photo-marquer les leucocytes de l'hôte et imager les interactions entre les leucocytes et les agents pathogènes in vivo.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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