Name: Imagerie non invasive de la réponse immunitaire innée dans un modèle de poisson zèbre larves de Streptococcus iniae Infection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Découvrez la microinjection de Streptococcus iniae dans la vésicule otique de larves de Danio rerio pour imager la réponse immunitaire innée en temps réel. Cette méthode permet d'étudier les interactions hôte-pathogène.

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Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire pour les soins de poisson zèbre et la maintenance. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health, National Service Award recherche A155397 à EA Harvie et NIH R01GM074827 à Anna Huttenlocher.

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La méthode d&#39;infection utilisé ici est utile pour l&#39;étude de la réponse immunitaire de l&#39;hôte à une infection localisée initialement dans 2 à 3 dpf embryons et les larves. La mise au point d&#39;un stimulus inflammatoire, comme une infection, dans une cavité fermée de telle sorte que la vésicule otique permet l&#39;étude de la chimiotaxie de neutrophiles et de macrophages et de phagocytose. Une mise en garde de l&#39;injection de bactéries dans la vésicule otique est que la capacité des neutrophiles à phagoc...

Streptococcus iniae est un agent pathogène aquatique majeur qui est capable de provoquer une maladie systémique dans les poissons et les humains 1. Bien que S. iniae est responsable de pertes importantes dans l&#39;industrie de l&#39;aquaculture, ce est aussi un agent pathogène zoonotique potentiel, capable de provoquer une maladie chez les hôtes humains immunodéprimés atteints de pathologies cliniques similaires à ceux causés par d&#39;autres agents pathogènes humains streptocoques. Compte tenu de ses similitudes avec des agents pathogènes humains, il est important d&#39;étudier S. iniae pathogenèse des maladies dans le contexte d&#39;un hôte naturel. Un modèle de poisson zèbre adulte de S. infection iniae a révélé l&#39;infiltration robuste de leucocytes d&#39;accueil sur le site de l&#39;infection localisée ainsi comme un temps rapide d&#39;accueillir la mort, un temps trop court pour impliquer le système immunitaire adaptatif 7. Afin d&#39;obtenir un regard en profondeur dans la réponse immunitaire innée à S. iniae infection in vivo, il est nécessaire d&#39;utiliser un modèle qui est plus favorable à nsur-invasive imagerie en temps réel. Le poisson zèbre larves a un certain nombre d&#39;avantages qui en font un modèle vertébré plus en plus attrayant pour étudier les interactions hôte-pathogène. Poisson zèbre sont relativement peu coûteux et facile à utiliser et à entretenir par rapport aux modèles de mammifères. L&#39;immunité adaptative est pas fonctionnellement matures jusqu&#39;à 4-6 semaines après la fécondation, mais les larves ont un système immunitaire inné des vertébrés hautement conservée avec le complément, Toll-like récepteurs, les cytokines et les neutrophiles et les macrophages avec des capacités antimicrobiennes y compris la phagocytose et la bouffée respiratoire 2-6, 8-11. En outre, la traçabilité génétique et la transparence optique des stades embryonnaires et larvaires de développement pour permettre la génération de lignées transgéniques stables avec les cellules immunitaires marquées par fluorescence permettant d&#39;étudier les interactions hôte-pathogène en temps réel in vivo. La génération de ces lignées transgéniques en utilisant une protéine photoconvertible tels que DenDRA2 permet le suivi de l&#39;origine de la cellule hôte et le destin individuel au cours de l&#39;infection 12. Lors de l&#39;élaboration d&#39;un modèle d&#39;infection des larves de poisson zèbre, le site choisi de microinjection permettra de déterminer si une infection est initialement localisée ou systémique. Infections du sang systémique dans la veine caudale ou un conduit de Cuvier sont les plus couramment utilisées pour étudier les pathogènes microbiens chez le poisson zèbre et sont utiles pour étudier les interactions entre l&#39;hôte et des cellules microbiennes, les réponses de cytokines, et les différences de virulence entre les souches pathogènes. Pour les micro-organismes à croissance plus lente, une injection précoce dans le sac vitellin d&#39;un embryon au stade 16-1,000 cellulaire peut être utilisée pour générer une infection systémique 13,14, avec le stade de développement optimal pour la micro-injection d&#39;un micro-organisme à croissance lente jugée entre l&#39;étape 16 à 128 de la cellule 15. Toutefois, le jaune injections sac de nombreux microbes à des stades ultérieurs de développement hôte ont tendance à être mortelle à til accueillera en raison de l&#39;environnement riche en nutriments pour le microbe et le manque de leucocytes infiltrants 16-18. Une infection localisée se traduit généralement par la migration dirigée des leucocytes vers le site de l&#39;infection qui peut être facilement quantifiée par imagerie non invasive. Ce type d&#39;infection peut permettre pour la dissection des mécanismes qui interviennent dans la migration des leucocytes ainsi que des enquêtes de différentes capacités migratoires et phagocytaires de diverses populations leucocytaires. Infections localisées sont également utiles lors de l&#39;examen des différences de virulence entre les souches bactériennes ainsi que l&#39;étude des mécanismes d&#39;invasion de microbes depuis barrières de l&#39;hôte physiques doivent être croisés pour une infection localisée à devenir systémique. Poisson zèbre sont généralement soulevé à des températures de 25-31 ° C 19, mais ils peuvent aussi être maintenu à des températures aussi élevées que 34 à 35 ° C pour les études de l&#39;envahissement de certains agents pathogènes humains avec les exigences de température strictespour la virulence 20, 21. De nombreux sites différents ont été utilisés pour générer une infection bactérienne localisée initialement compris le ventricule du cerveau postérieur 22, queue muscle dorsal 18, la cavité péricardique 23, et la vésicule otique (oreille) 5, 16, 24. Cependant, il a été trouvé que l&#39;injection des bactéries en queue muscle peut causer des dommages aux tissus et l&#39;inflammation indépendante des bactéries, ce qui peut fausser les résultats lorsque l&#39;enquête réponse des leucocytes 13. Bien que moins de dommages est associé à l&#39;injection dans le cerveau postérieur et bien que ce est d&#39;abord dépourvu de leucocytes chez les jeunes embryons, le ventricule rhombencéphale gagne progressivement les cellules immunitaires dans le temps que les microglies se installent. Le ventricule rhombencéphale est également un endroit plus difficile à l&#39;image. La vésicule otique est une cavité creuse fermée sans accès direct à la vascularisation 25, 26. Il est normalement dépourvue de leukocytes leucocytes, mais peuvent être recrutés pour la vésicule otique en réponse à des stimuli inflammatoires telles que l&#39;infection. Il est également un site privilégié de la micro-injection de bactéries chez le poisson zèbre ans après la fécondation (DPF) 2-3 jours en raison de la facilité d&#39;imagerie et la visualisation de l&#39;injection. Par conséquent, nous avons choisi la vésicule otique que notre site d&#39;infection bactérienne localisée.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml Eppendorfs</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Tube Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>27 G x &frac12 ; aiguille BD</td><td>Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>plaque à 96 puits</td><td>Corning Incorporated</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Sondes moléculaires rouges CellTracker</td><td>, Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CNA agar</td><td>Dot Scientific, Inc</td><td>7126A</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert jetables</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7m</td><td></td></tr><tr><td>Lunette de dissection</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>MDS</td><td>2292</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler fine</td><td> Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Peigne gel</td><td>VWR</td><td>27372-482</td><td>4,2 mm de largeur, 1,5 mm d’épaisseur</td></tr><tr>Plats <td></td><td></td><td>à fond en verre</td><td>Fabriqué sur mesure en perçant un trou de 16 à 18 mm au centre d’un fond de plat de culture tissulaire de 35 mm et en plaçant une lamelle ronde #1 de 22 mm dans le trou et en scellant avec une fine couche d’adhésif optique Norland 68 durci à la lumière UV.</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Agarose à haut point de fusion</td><td>Denville Scientific, Inc.</td><td>CA3510-6</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Olympus</td><td>avec système</td><td></td>FV-1000</tr><tr><td>Agarose à bas point</td><td>de fusion Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Support magnétique</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Système de micro-injection</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Embouts de pipette à microchargeur</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Tritech (Narishige)</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Flaming/Brown P-97</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotmètre</td><td>Nanodrop Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourée (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldheyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-4557</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Ricca Chemoical Company</td><td>572516</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>165921</td><td></td></tr><tr><td>Protease peptone</td><td>Fluka Biochemika</td><td>29185</td><td></td></tr><tr><td>Petite boîte de culture cellulaire</td><td>Corning Incorporated</td><td>430165</td><td>35 x 10 mm</td></tr><tr><td>Sudan Black</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2380</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles d’injection capillaire en verre à paroi mince</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt</td><td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td><td>T1438</td><td></td></tr><tr><td>Tricaïne (3-aminobenzoate d’éthyle)</td><td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fluka Biochemika</td><td>Référence 92144</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie non invasive de la réponse immunitaire innée dans un modèle de poisson zèbre larves de<em&gt; streptococcus iniae</em&gt; infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

L&#39;agent pathogène aquatique, Streptococcus iniae, est responsable de plus de 100 millions de dollars de pertes annuelles pour l&#39;industrie de l&#39;aquaculture et est capable de provoquer une maladie systémique dans les deux poissons et les humains. Une meilleure compréhension de S. maladie iniae pathogénie nécessite un système de modèle approprié. La traçabilité génétique et la transparence optique des premiers stades de développement du poisson zèbre pour permettre la génération et l&#39;imagerie non-invasive de lignées transgéniques avec étiqueté par fluorescence des cellules immunitaires. Le système immunitaire adaptatif est pas complètement fonctionnel jusqu&#39;à plusieurs semaines après la fécondation, mais larves de poisson zèbre ont un système immunitaire inné de vertébré conservé à la fois les neutrophiles et les macrophages. Ainsi, la génération d&#39;un modèle d&#39;infection larvaire permet l&#39;étude de la contribution spécifique de l&#39;immunité innée dans le contrôle de S. infection iniae. Le site de micro-injection permettra de déterminer si une infection estsystémique ou localisée initialement. Ici, nous présentons nos protocoles pour l&#39;injection de vésicule otique du poisson zèbre âgés de 2-3 jours après la fécondation ainsi que nos techniques d&#39;imagerie confocale de fluorescence de l&#39;infection. Un site d&#39;infection localisée permet l&#39;observation de l&#39;invasion microbienne initiale, recrutement des cellules hôtes et la diffusion de l&#39;infection. Nos résultats en utilisant le modèle des larves de poisson zèbre de S. iniae infection indiquent que le poisson zèbre peut être utilisé pour examiner les différents apports de neutrophiles et les macrophages d&#39;accueil dans les infections bactériennes localisées. En outre, nous décrivons comment photomarquage des cellules immunitaires peut être utilisé pour suivre le destin des cellules hôte individuel au cours de l&#39;infection.

Microinjection de S. iniae dans la vésicule otique (Figure 1 et Figure 2) conduit à une réponse de l&#39;hôte initialement localisée. Lorsqu&#39;elle est injectée correctement, les bactéries doivent seulement être vu dans la vésicule otique et non dans le tissu ou le sang environnant. Ceci peut être visualisé au cours de la micro-injection en utilisant un colorant rouge de phénol (figure 1A). Alternativement, si bactéries marquées sont injectées, une analyse ra...

Ici, nous présentons un protocole pour la génération et l’imagerie d’une infection bactérienne localisée dans la vésicule otique du poisson zèbre.

Imagerie non invasive de la réponse immunitaire innée dans un modèle de poisson zèbre larves de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

L'objectif général de cette procédure est d'injecter par microinjection des larves de poisson zèbre avec un agent pathogène bactérien, Streptococcus IEA, afin d'obtenir une imagerie en direct non invasive de la réponse immunitaire de l'hôte. Cette opération s'effectue tout d'abord en chargeant l'aiguille de microinjection avec une suspension bactérienne, puis en alignant des larves de poisson zèbre anesthésiées sur le moule d'injection en agarose. Ensuite, la suspension bactérienne est injectée par microinjection dans la vésicule otique des larves.Ensuite, les larves injectées sont montées dans de l'agarose à bas point de fusion. Enfin, les cellules immunitaires de l'hôte sont marquées par photo-étiquetage pour un suivi facile, et l'infection est observée à l'aide d'un microscope confocal. En définitive, l'injection microscopique de Streptococcus iniae dans la vésicule otique, ainsi que le photo-étiquetage et la microscopie confocale qui suivent, sont utilisées pour étudier la réponse immunitaire de l'hôte chez les larves de poisson zèbre.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'injection dans la veine caudale, est que l'injection dans la

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Embryons de poisson zèbre transparent ont prouvé hôtes modèle utile pour visualiser et les interactions entre l'étude fonctionnellement les cellules immunitaires innées et bactéries pathogènes intracellulaires, tels...

L&#39;infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

Le développement rapide, de petite taille et la transparence du poisson zèbre sont des atouts considérables pour l'étude du contrôle immunitaire innée de...

L&#39;imagerie non invasive de la candidose disséminée chez les larves poisson zèbre

Source : Zhang, X., et al. Un modèle d’embryon de poisson-zèbre pour la visualisation in vivo et l’analyse intravitale de l’infection à Staphylococcus aureus associée aux biomatériaux. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre l’imagerie par fluorescence d’embryons de poisson-zèbre injectés avec Staphylococcus aureus, permettant de quantifier la progression de l’infection et la distribution bactérienne pour évaluer l’impact des microsphères de biomatériaux sur les interactions hôte-pathogène in...

 Imagerie par fluorescence de l’infection bactérienne associée aux biomatériaux chez les embryons de poisson-zèbre

Source : Zhang, X. et. al., Un modèle d’embryon de poisson-zèbre pour la visualisation in vivo et l’analyse intravitale de l’infection à Staphylococcus aureus associée aux biomatériaux. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo présente un modèle d’embryon de poisson-zèbre pour étudier les infections liées aux biomatériaux implantés. L’injection de microsphères de polystyrène à Staphylococcus aureus améliore la survie bactérienne, confirmant le rôle de promotion des infections des matériaux implantés.

Analyse in vivo d’infections bactériennes associées à des implants à l’aide d’embryons de poisson-zèbre

Cette vidéo démontre le suivi du recrutement des leucocytes à l’aide de larves de poisson-zèbre transgéniques exprimant une protéine fluorescente verte photoconvertible. La pré-injection de bactéries marquées à un colorant fluorescent rouge dans la vésicule otique et l'induction de la photoconversion permettent d'observer la migration, la phagocytose et la dispersion des leucocytes dans tout le corps, fournissant des informations précieuses sur la dynamique de la réponse immunitaire.

Suivi des leucocytes basé sur la photoconversion chez le poisson-zèbre transgénique infecté par des bactéries

La vidéo montre une technique de dispositif de blessure et de piégeage de poisson-zèbre pour observer l’infection par des agents pathogènes fongiques marqués par fluorescence chez les larves de poisson-zèbre. L’infection initiale attire les macrophages et, à mesure que l’infection persiste, le recrutement des neutrophiles progresse au site d’injection.

Une technique zWEDGI pour visualiser les larves de poisson-zèbre infectées par des agents pathogènes fongiques

La réponse immunitaire innée protège contre l'infection par des organismes pathogènes. Un élément essentiel de la réponse immunitaire innée, l'explosion respiratoire des phagocytes, génère des espèces réactives de l'oxygène qui tuent les micro-organismes envahisseurs. Nous décrivons un essai de stimulation du métabolisme oxydatif qui quantifie les espèces réactives de l'oxygène produites lors de la réponse immunitaire innée est chimiquement induite.

Quantification de la réponse du Rafale respiratoire comme indicateur d&#39;Innate Immune Health chez le poisson zèbre

Etudier les premiers événements de la progression de cellules prénéoplasiques et l'interaction immunitaire innée des cellules est essentiel pour comprendre et traiter le cancer. Ici, nous décrivons une méthode pour induire une condition transformations de cellules epitheliales et de la formation d'image en temps réel de l'interaction subséquente immunitaire inné avec des cellules exprimant HRAS G12V cellules de la peau chez les larves de poisson zèbre.

Imagerie en direct d&#39;Innate immunitaire et prénéoplasiques Interactions cellulaires L&#39;utilisation d&#39;un système d&#39;expression / UAS inductible Gal4 dans des larves de poisson zèbre peau

Les embryons de poisson-zèbre optiquement transparents sont largement utilisés pour étudier et visualiser en temps réel les interactions entre les micro-organismes pathogènes et les cellules immunitaires innées. La micro-injection de Mycobacterium abscessus, combinée à l’imagerie par fluorescence, est utilisée pour examiner les caractéristiques pathogènes essentielles telles que la formation de la moelle épinière chez les embryons de poisson-zèbre.

Décrypter et de l&#39;imagerie et la pathogenèse de Cording<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Dans embryons de poissons zèbres

Des modèles systémiques et localisés d’infection par le virus de la grippe A humaine sont présentés. À l’aide d’un modèle d’infection systémique, le poisson-zèbre peut être utilisé pour dépister les médicaments antiviraux. À l’aide d’un modèle d’infection localisée, le poisson-zèbre peut être utilisé pour caractériser les réponses des cellules immunitaires de l’hôte.

Utilisation de modèles Zebrafish de grippe humaine A Infections au virus pour le dépistage médicaments antiviraux et Caractériser hôte réponses immunitaires cellulaires

La présente étude décrit un modèle d’embryon de poisson zèbre pour visualisation in vivo et l’analyse intravitale d’infection associée aux biomatériaux au fil du temps basée sur la microscopie de fluorescence. Ce modèle est un système prometteur en complément des modèles animaux mammifères tels que les modèles de souris pour l’étude des infections associées aux biomatériaux in vivo.

Un modèle d’embryon de poisson zèbre pour In Vivo visualisation et analyse Intravitale du biomatériau associée à Staphylococcus aureus Infection

Découvrez la microinjection de Streptococcus iniae dans la vésicule otique de larves de Danio rerio pour imager la réponse immunitaire innée en temps réel. Cette méthode permet d'étudier les interactions hôte-pathogène.

Imagerie non invasive de la réponse immunitaire innée dans un modèle de poisson zèbre larves de

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