Name: Infusion stéréotaxique des oligomères bêta-amyloïde dans les Hippocampus souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Apprenez l'infusion stéréotaxique des oligomères bêta-amyloïde dans le gyrus denté de l'hippocampus chez la souris. Cette méthode permet d'étudier les effets toxiques de l'Aβ1-42 sur les neurones en temps réel.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national des troubles neurologiques et des maladies accorder NS081333 (à CMT), subvention Association des NIRG-10-171721 d&#39;Alzheimer et de l&#39;Institut national de santé mentale subvention MH096702 (UH), et l&#39;Institut national sur le vieillissement, la recherche financée par la maladie d&#39;Alzheimer Centre à l&#39;Université Columbia subvention pilote AG008702 (à YYJ et JB).

Remarque: Pour toute expérimentation animale, institutionnel et des lignes directrices nationales pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire ont été suivies. 1. Préparer Instruments chirurgicaux et solutions pour la chirurgie <ol><li> Autoclave tous les instruments chirurgicaux en acier inoxydable. </li><li> Préparer éthanol à 70% en diluant 200 preuve éthanol absolu avec d&#39;eau déminéralisée stérile pour biologie moléculaire distillée. </li><li> Fixez l&#39;aiguille 29 G à la seringue Hamilton. Nettoyez l&#39;intérieur de Hamilton seringue et l&#39;aiguille par l&#39;élaboration et l&#39;eau éjection nanopure plusieurs reprises pendant 1 min. Répétez cette procédure avec 70% d&#39;éthanol. <ol><li> Retirer le piston et l&#39;aiguille de la seringue Hamilton. Sécher à l&#39;air les pièces dans une hotte O à flux laminaire / N. </li><li> Irradier l&#39;aiguille et la seringue avec de la lumière ultraviolette pendant 30 minutes avant utilisation. </li></ol></li><li> Préparer une solution saline de NaCl par dissolution dans de l&#39;eau de qualité moléculaire à un poids final de concentration volumique de 0,9%. Sterilize la solution par filtration à travers le filtre de 0,2 um pores. </li></ol> 2. Préparer oligomères Aß 1-42 <ol><li> Monomerize et remettre en suspension humaine recombinante Aß 1-42 dans le DMSO à 5 mm exactement comme décrit dans la publication de la Loi »et d&#39;autres 13. </li><li> Diluer 5 mM de peptide Aß 1-42 avec stérile (1x) PBS à 100 pM, le jour avant la chirurgie. </li><li> Bien mélanger la solution par trituration. </li><li> Incuber Aß 1-42 solution pendant 12 heures à 4 ° C. Note: solutions de contrôle telles que la dilution DMSO dans du PBS ou brouillés / inverser Aß 1-42 peptide doit être préparé de la même manière que Aß 1-42. </li></ol> 3. déterminer les coordonnées d&#39;injection <ol><li> Les adultes atlas du cerveau de la souris pour déterminer l&#39;exact antérieure-postérieure (AP), médial-latéral (ML), et dorso-ventral (DV) Coordonnées de la région du cerveau 14 d&#39;intérêt. Nonte: Pour illustrer cette technique, nous avons choisi le gyrus denté de l&#39;hippocampe comme la cible avec les coordonnées suivantes dans le bregma: AP, -2,00 mm; ML, ± 1,3 mm; DV, -2,2 mm. Le signe négatif de la valeur AP indique qu&#39;il est de 2,00 mm postérieure du bregma. Le signe ± précédant la valeur ML indique la direction à gauche et à droite du centre. Enfin, le signe négatif précédant la DV indique qu&#39;il se déplace sur le ventre de la surface du cerveau. </li></ol> 4. Réglage cadre stéréotaxique <ol><li> Porter un masque chirurgical du visage, blouse de laboratoire propre, et des gants chirurgicaux stériles. </li><li> Essuyez instrument stéréotaxique et l&#39;adaptateur de souris avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Lay down champ opératoire stérile sur le comptoir. </li><li> Placer l&#39;instrument stéréotaxique avec adaptateur de la souris sur le dessus du drap chirurgical stérile. </li><li> Essuyez le tampon de chauffage de la souris avec 70% d&#39;éthanol. Placez le coussin chauffant sur le lit de cadre stéréotaxique. Utilisez but labora généralebande d&#39;étiquetage tory à bande vers le bas le coussin chauffant sur le lit de l&#39;adaptateur de la souris. <ol><li> Fixez le coussin chauffant à la pompe de recirculation d&#39;eau chaude selon les instructions du fabricant. </li><li> Tournez sur la pompe de recirculation d&#39;eau chaude et de régler la température à 37 ° C, puis attendre jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne la température. </li></ol></li><li> Fixez le 50 ul Hamilton seringue avec une aiguille 29 G sur le cadre stéréotaxique par vissage sur l&#39;arbre d&#39;injection vertical motorisé selon les instructions du fabricant. </li><li> Allumez le stérilisateur de perles et d&#39;attendre jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne la température préréglée du fabricant. Note: Ceci est utilisé pour la stérilisation des instruments en acier inoxydable entre les animaux. Il faut 20 secondes instruments de contact avec les billes de stérilisation. </li><li> Tournez sur la plaque chaude et mettez-le à 42 ° C et placer une cage vide propre sommet. </li><li> Alors que la seringue Hamilton est fixé sur le cadre stéréotaxique utiliser le stéréotaxique motorisé injector de dresser la solution 1-42 Aß. Remarque: Dresser plus de 4 pi de la solution dans la seringue, puis utiliser l&#39;injecteur stéréotaxique pour régler le volume d&#39;injection. Actionner l&#39;injecteur selon les instructions du fabricant. </li></ol> 5. Préparation des animaux <ol><li> Déterminer le poids de la souris en utilisant la balance. </li><li> Anesthésier la souris avec de la kétamine / xylazine cocktail à 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg par injection intrapéritonéale xylazine (IP). Surveiller la profondeur de l&#39;anesthésie par la perte de pincement de l&#39;orteil réflexe. </li><li> Après la souris est sous sédatif prendre la tondeuse à cheveux et de se raser la tête pour exposer la peau sur le crâne. </li><li> Placez la souris au-dessus du coussin chauffant au-dessus du lit stéréotaxique. </li><li> Utilisez la spatule pour ouvrir la bouche et placez les incisives à l&#39;intérieur de la garde de dents. Fixer le nez sur le visage de la souris. Serrer doucement et pas trop serré. </li><li> PosiTion les traverses de l&#39;oreille bilatéraux dans conduit auditif pour fixer la tête. Déplacez chaque barre transversale jusqu&#39;à ce qu&#39;il frappe le crâne, puis tourner la vis pour le verrouiller. <ol><li> Pour vous assurer que la tête est fixée utiliser votre index pour pousser doucement sur la tête. Si la tête est bien fixé, il ne donnera pas à déplacer ou lorsqu&#39;il est pressé. </li></ol></li><li> Appliquez une goutte de crème pour les yeux ou collyre pour les yeux pour les garder humides. Assurez-vous que les yeux sont humides tout au long de la procédure chirurgicale. </li><li> Pour désinfecter le site chirurgical utiliser des cotons-tiges stériles pour appliquer la solution de bétadine à la peau sur le crâne, suivie par 70% d&#39;éthanol. Effectuez la bétadine alternatif et 70% d&#39;éthanol nettoyage 2 fois plus. </li></ol> 6. Chirurgie et Infusion <ol><li> Utiliser un scalpel pour faire une incision de 2-3 mm sur la ligne médiane du cuir chevelu, puis utiliser une paire de ciseaux fines droites de prolonger la ligne d&#39;incision à 1,0-1,5 cm pour exposer la suture sagittale, bregma et lambda du crâne, monuments dont les coordonnées stéréotaxiques sont basées sur. Utilisez micro pinces pour garder la peau de l&#39;autre. Remarque: Les positions de Bregma et lambda sont expliqués dans les atlas du cerveau de souris &quot;le cerveau de la souris dans stéréotaxique Coordonnées&quot; 14. </li><li> Prenez un coton-tige, la tremper dans une solution saline stérile, et l&#39;utiliser pour nettoyer le crâne. Ensuite, utilisez un coton-tige propre et sec pour sécher le crâne. </li><li> Utilisez un stylo à pointe fine stérile pour marquer un point sur le bregma. Utilisez le micromanipulateur stéréotaxique pour positionner la seringue Hamilton de sorte que la pointe de l&#39;aiguille touche juste le point sur le bregma. <ol><li> Enregistrez le DV coordonner. </li><li> Pour vérifier si l&#39;axe AP du crâne est de niveau déplacer la seringue Hamilton arrière de sorte que la pointe de l&#39;aiguille touche le point de lambda. </li><li> Notez la position de DV. Assurez-vous que coordonne le DV pour bregma et lambda sont à moins de 0,5 mm. Remarque: L&#39;objectif est de minimiser la différence DV entre bregma et lambda. </li></ol></li><li> Utilise lesicromanipulator pour retourner la pointe de l&#39;aiguille de la seringue Hamilton de retour à la dot de bregma. </li><li> Notez la position de départ AP. </li><li> Calculer la position AP se terminant en soustrayant 2,00 mm de l&#39;AP à partir de coordonnées. </li><li> Utilisez le micromanipulateur pour repositionner l&#39;aiguille de seringue Hamilton à la finale AP coordonner. </li><li> Enregistrez le courant ML coordonner. </li><li> Calculer la gauche et la droite se terminant ML coordonne en ajoutant ou soustrayant 1,3 mm à partir de la ML de coordonnées. </li><li> Utilisez le micromanipulateur pour déplacer l&#39;aiguille de la seringue Hamilton soit le ML se terminant coordonner. <ol><li> Touchez la pointe de l&#39;aiguille à la surface du crâne sur les deux coordonnées terminant ML et d&#39;enregistrer les coordonnées de DV et assurez-vous que les valeurs sont à moins de 0,5 mm. Remarque: L&#39;objectif est de minimiser la différence DV entre les deux coordonnées se terminant ML. </li><li> Alors que lors d&#39;une fin de coordonner tirer l&#39;aiguille jusqu&#39;à 0,5-1 cm sur le crâne. Prenez un stylo à pointe fine stérile pour marquer un point sur ee surface du crâne. Répétez cette étape pour le côté opposé du crâne. </li></ol></li><li> Balancez la seringue Hamilton clair sur le chemin. </li><li> Fixez 0,8 mm tête de forage à la perceuse. Prendre la perceuse à deux mains, mettre les coudes sur la surface de la table pour la stabilité, et la position de la tête de forage légèrement au-dessus du point de sharpie sur le côté gauche ou droit ML coordonnent. Activer la perceuse, abaisser la pointe du foret sur la surface du crâne d&#39;introduire un trou dans le crâne. Répétez cette étape pour le côté controlatéral. Remarque: Certains saignements peut se produire des trous nouvellement introduites. Si il ya un saignement puis utilisez un coton-tige sec et propre pour tamponner le sang. </li><li> Déplacez la seringue Hamilton de retour en position sur l&#39;un des trous ML nouvellement introduites. Abaissez l&#39;aiguille Hamilton juste après le crâne. À ce stade, veillez à ne pas perforer le cerveau. Pour vous assurer que l&#39;aiguille a passé le crâne prendre votre index et poussez doucement l&#39;aiguille contre le crâne à faire sure l&#39;aiguille ne quitte pas le trou. </li><li> Enregistrez le DV à partir de coordonnées. </li><li> Calculer le DV se terminant coordonner en soustrayant 2,2 mm de la DV à partir de coordonnées. </li><li> Abaissez l&#39;aiguille vers le DV se terminant coordonner. </li><li> Activer la pompe d&#39;injection stéréotaxique pour pomper 4 pi de Aß 1-42 dans le gyrus denté à un taux de 0,5 pl / min. </li><li> Lorsque la perfusion est terminée laisser l&#39;aiguille reste en place pour une 1 min supplémentaire pour minimiser le reflux de la solution sur le site d&#39;injection. </li><li> Déplacer l&#39;aiguille de l&#39;autre côté du cerveau et répétez les étapes 6.13 à 6.18. </li></ol> 7. Retrait des animaux et Soins postopératoires <ol><li> Dévissez les barres d&#39;oreilles et garde le visage / nez. Retirer la souris de l&#39;appareil. </li><li> Utilisez une pince étudiants de modèle standard pour tirer fermer le cuir chevelu, puis sceller la plaie avec de suture. </li><li> Injecter 1 ml de solution saline stérile dans la souris via IP pour l&#39;hydratation. </li><li> Dansprojet buprénorphine (0,1 mg / kg) sous-cutanée pour soulager la douleur. </li><li> Maintenir la souris dans la cage vide et propre mis sur le dessus de 42 ° C la plaque chaude jusqu&#39;à ce qu&#39;il se réveille, puis retourner dans sa cage de boîtier avec suffisamment de nourriture et d&#39;eau. </li><li> Administrer la buprénorphine par injection sous-cutanée toutes les 12 heures pendant 3 jours pour soulager la douleur. </li></ol> 8. Suture Enlèvement <ol><li> Anesthésier la souris avec de la kétamine / xylazine cocktail à 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg xlyazine par IP. Note: Ceci est fait 7-10 jours après la chirurgie. </li><li> Utilisez une pince étudiants de modèle standard et de ciseaux fins droites pour éliminer la suture. </li><li> Injecter 1 ml de solution saline stérile dans la souris via IP pour l&#39;hydratation. </li><li> Maintenir la souris dans une cage vide et propre mis sur le dessus de 42 ° C la plaque chaude jusqu&#39;à ce qu&#39;il se réveille, puis retourner dans sa cage de boîtier avec suffisamment de nourriture et d&#39;eau. </li></ol> Sacrifice et le traitement des tissus 9. animale <ol><li> Anesthésier la souris et le perfuse avec 4% de paraformaldehyde 15, retirez le cerveau, et de les traiter pour cryosectioning 16. Remarque: Le calendrier de sacrifice animal dépend de l&#39;expérimentateur. Cependant, pour nos études, nous avons choisi 7 et 14 jours après la chirurgie. </li></ol>

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<li>Thakker-Varia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropeptide+VGF+is+reduced+in+human+bipolar+postmortem+brain+and+contributes+to+some+of+the+behavioral+and+molecular+effects+of+lithium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).</li>
<li>Greferath, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+cholinergic+forebrain+neurons+and+improved+spatial+learning+in+p75+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice.</a> The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).</li>
<li>Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+GABAergic+and+cholinergic+neurons+in+the+rat+diagonal+band%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band.</a> Neuroscience. 17 (2), 439-451 (1986).</li>
<li>Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+innervation+of+the+rat+dentate+gyrus%3A+an+immunocytochemical+and+electron+microscopical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study.</a> Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).</li>
<li>Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+mediates+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+memory%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta mediates memory formation.</a> Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Pour parvenir à une injection Aß 1-42 succès l&#39;expérimentateur ou le chirurgien doit: 1) utiliser une technique aseptique; 2) identifier correctement la région du cerveau d&#39;intérêt avec des coordonnées précises; 3) être en mesure de sécuriser convenablement la souris dans le cadre stéréotaxique avec le cerveau nivelé dans l&#39;axe AP et ML; 4) ont la capacité de faire fonctionner le micromanipulateur avec précision; 5) assurer des soins post-opératoire appropriée. Si ces étapes clés sont suivies, la ...

les dépôts amyloïdes de plaques, qui sont composés de bêta-amyloïde (Aß 1-42), sont un élément clé de la pathologie de la maladie d&#39;Alzheimer (MA). De nombreuses études ont montré que des niveaux élevés ou toxiques d&#39;oligomères Aß recombinant 1-42 susciter la mort neuronale, la dystrophie synaptique, la perte et la dysfonction; ainsi que l&#39;apprentissage et la mémoire déficits 1-4. Les régions du cerveau touchées comprennent l&#39;hippocampe, le cortex et des structures sous-corticales telles que le cerveau antérieur basal et 5,6 de l&#39;amygdale. À ce jour, il existe des modèles de souris transgéniques multiples qui tentent de simuler l&#39;Aß 1-42 pathologie de la MA. Selon la souche de ces animaux se révéler utile pour l&#39;examen de sélection caractéristiques pathologiques de la MA. Malheureusement, à l&#39;exception de deux lignées transgéniques, APP23 et 5XFAD, ces souris ne répliquent intégralement la perte neuronale, un aspect clé de la MA. Même avec la perte neuronale observée dans APP23 et 5XFAD, l&#39;obser de mort neuronalecb était subtil, dépend de l&#39;âge, et isolée à quelques régions de sélectionner 7,8. La perfusion directe de oligomères Aß 1-42 dans le cerveau de souris de type sauvage fournit un excellent modèle in vivo, qui reproduit l&#39;aspect de la mort neuronale de amyloidopathy 1,9,10. Contrairement aux modèles de souris transgéniques communément utilisées, la Aß 1-42 oligomère modèle de perfusion est idéal pour l&#39;élévation aiguë Aß 1-42 niveaux de manière spatiale et temporelle. L&#39;avantage d&#39;utiliser les souris de type sauvage pour ce modèle évite les effets de compensation ou secondaires potentiels des mutations introduites dans les lignées de souris transgéniques. Des études antérieures ont montré que la perfusion des niveaux toxiques de Aß 1-42 dans l&#39;hippocampe provoque la mort des neurones au voisinage du point d&#39;injection pendant 1 semaine 1. En outre, cohérent avec l&#39;observation que Aß 1-42 est toxique pour les neurones cholinergiques du cerveau antérieur du 11 basaleneurone cholinergique population (BFCN) qui fait saillie à l&#39;hippocampe est diminuée de 20 à 50% dans un délai de sept à quatorze jours suivant la bêta-amyloïde chez la souris 1,10 infusion, ce qui permet effectivement aux examens de circuit neuronal isolé dans le cerveau. Depuis projet BFCN ipsilatéralement le gyrus denté de l&#39;hippocampe 12, pour le contrôle de la partie / véhicule et oligomères Aß 1-42 solutions les plus peut être injecté sur chaque côté du cerveau permettant d&#39;effectuer des comparaisons entre les hémisphères droit et gauche et 1. Dans ce rapport, nous allons fournir une méthodologie chirurgicale et l&#39;injection détaillé pour C57BL / 6J de type sauvage adultes. Cette souche de souris est choisi en raison de sa large utilisation dans la recherche. Techniquement, une région du cerveau peut être ciblé pour perfusion, mais ici, nous allons utiliser le gyrus denté de l&#39;hippocampe comme cible pour illustrer la technique.

<table><tbody><tr><td>Kétamine HCl (100 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1049007</td><td>100 mg de kétamine pour 1 kg</td></tr><tr><td>d’animal Xylazine (20 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>non disponible</td><td>10 mg de xylazine pour 1 kg d’animal</td></tr><tr><td>Buprenex (0,3 mg/ml)</td><td>Henry Schein Medical</td><td>1217793</td><td>0,1 mg de buprenex pour 1 kg d’animal</td></tr><tr><td>A&beta ; 1-42</td><td>David Teplow/UCLA</td><td>non disponible</td><td>100 &mu ; M; Cette amyloïde a été utilisée dans l’article</td></tr><tr><td>A&beta ; 1-42</td><td>Bachem</td><td>H-1368</td><td>Peut être utilisé à la place de l’amyloïde du laboratoire Teplow</td></tr><tr><td>A&beta ; 1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-80B</td><td>Peut être utilisé à la place de l’amyloïde du laboratoire Teplow</td></tr><tr><td>Scrambled A&beta ; 1-42</td><td>American Peptide</td><td>62-0-46B</td><td>Peut être utilisé comme peptide de contrôle pour comparer A&beta ; 1-42</td></tr><tr><td>NU4 Antibody (anticorps amyloïde oligomère)</td><td>Don de William Klein/Northwestern U.</td><td>non disponible</td><td>Dilution 1:2 000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-oligomère amyloïde&nbsp ; (Lapin polyclonal)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB9234</td><td>Peut être utilisé à la place de Nu4 ; doit être testé par l’utilisateur final</td></tr><tr><td>6E10 Anticorps (souris monoclonale) (anticorps amyloïde)</td><td>Biolegend</td><td>sig-39320</td><td>Dilution 1:1 000</td></tr><tr><td>Anticorps ChAT (chèvre polyclonale)</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td>dilution 1:100</td></tr><tr><td>DeadEnd Système TUNEL fluorométrique</td><td>Promega</td><td>G3250</td> Suivez <td>les instructions du fabricant pour utiliser</td></tr><tr><td>le réactif anti-décoloration Prolong Gold avec DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>À utiliser lors de lames de lamelles</td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>non disponible</td><td>solution à 2 %</td></tr><tr><td>d’éthanol absolu (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-4</td><td>Pour la fabrication d’éthanol à 70 % pour l’assainissement et la désinfection</td></tr><tr><td>Novex 10-20 % Tricine gel</td><td>Life Technologies</td><td>EC6625BOX</td><td>Pour séparer A&beta ; 1-42</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC1675</td><td>Pour faire fonctionner les gels de tricine 10-20 %</td></tr><tr><td>Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC3675</td><td>Pour le transfert de gels de tricine 10-20 %</td></tr><tr><td>SuperSignal Western Blot Enhancer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46640</td><td>Pour améliorer A&beta ; Signal 1-42 ; suivre le protocole du fabricant</td></tr><tr><td>Protran BA79 Membrane buvard en nitrocellulose, 0,1 &mu ; m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10402088</td><td>Pour le transfert de gels de tricine à 10-20 %</td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td>Électrophorèse aparatus pour l’utilisation de gels à 10-20 % de tricine</td></tr><tr><td>GenTeal Lubricant Eye Gel</td><td>Novartis</td><td>non disponible</td><td>Pour garder les yeux de la souris humides pendant la chirurgie ; peut être trouvé dans les pharmacies locales &#160 ; </td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>Refresh Optive Lubricant Eye Drops</td><td>Allergan</td><td>non disponible</td><td>Pour garder les yeux de souris humides pendant la chirurgie ; peut être trouvé dans les pharmacies locales ; Peut être utilisé à la place de GenTeal</td></tr><tr><td>Bétadine</td><td>Stoelting</td><td>50998</td><td>Pour assainir et désinfecter</td></tr><tr><td>Spatule ronde/effilée&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>82027-490</td><td>Pour l’ouverture de la bouche</td></tr><tr><td>de l’animal Bulldog Serrefines Pinces (Dims. de la mâchoire 9X1,6 mm ; Longueur 28 mm)</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>18050-28</td><td>En option ; Pour maintenir la peau du cuir chevelu séparée pendant l’injection</td></tr><tr><td>Ciseaux fins droits (tranchant 25 mm ; Longueur 11,5 cm)</td><td>Outils de science fine</td><td>14060-11</td><td>Pour couper le cuir chevelu</td></tr>#<tr><td>3 Manche de scalpel</td><td>Outils de science fine</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>#11 Lame chirurgicale</td><td>Outils de science fine</td><td>10011-00</td><td>Pour faire une incision du cuir chevelu</td></tr><tr><td>Pince à motif standard d’étudiant (Dims. de pointe 2,5 x 1,5 mm ; Longueur 11,5 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91100-12</td><td>Pour maintenir le cuir chevelu fermé pendant la suture</td></tr><tr><td>Trimmer Combo Kit</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201</td><td>Pour raser les cheveux</td></tr><tr><td>T/Pump Recirculateur d’eau chaude&nbsp ;</td><td>Kent Scientific&nbsp ;</td><td>TP-700</td><td>Pour réchauffer l’animal pendant la chirurgie</td></tr><tr><td>Coussin de mine de guerre réutilisable (5 » x 10 »)</td><td>Kent Scientific&nbsp ;</td><td>TPZ-0510FEA</td><td>Pour le fixer au recirculateur d’eau chaude T/Pump afin de réchauffer l’animal pendant l’opération</td></tr><tr><td>Micro foret sans fil</td><td>Stoelting</td><td>58610</td><td>Utilisez des meules en acier de 0,8 mm pour percer des trous dans le crâne</td></tr><tr><td>Instrument stéréotaxique standard de laboratoire avec souris et Adaptateur pour rat néonatal</td><td>Stoelting</td><td>51615</td><td></td></tr><tr><td>Juste pour souris Instrument stéréotaxique</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td>Peut l’utiliser à la place de Stoelting Cat. #51615</td></tr><tr><td>Injecteur stéréotaxique Quintessential</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Stérilisateur à billes de verre sec</td><td>Stoelting</td><td>50287</td><td>Pour stériliser les instruments en acier inoxydable</td></tr><tr><td>Champ chirurgical stérile (18" x 26")</td><td>Stoelting</td><td>50981</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Seringue 50 ml, Modèle 705 RN SYR, NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7637-01</td><td>Pour l’injection cérébrale ; utiliser différentes seringues pour différentes solutions</td></tr><tr><td>29 G Aiguille, petit moyeu RN NDL</td><td>Hamilton Company</td><td>7803-06</td><td>Pour fixer à la seringue Hamilton pour l’injection cérébrale</td></tr><tr><td>1 ml BD Tuberculin Seringues</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>Pour l’administration d’anesthésie et de solution saline</td></tr><tr><td>Aiguille 30 G (0,5")</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td>Pour l’administration d’anesthésie et de solution saline</td></tr><tr><td>Balance électronique portable de la série CS (Ohaus)</td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>Pour peser les animaux afin de déterminer la dose d’anesthésie</td></tr><tr><td>Plaque chauffante (Plaque supérieure Dims. 7.25x7.25 in)</td><td>VWR</td><td>47751-148</td><td>Pour réchauffer les animaux après la chirurgie</td></tr><tr><td>Suture en soie Sofsilk C-1 Coupe 3/8, 12 mm</td><td>Covidien</td><td>S1173</td><td>Pour fermer la plaie</td></tr><tr><td>Adhésif tissulaire Vetbond (3M)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-361931</td><td>En option : pour aider à la fermeture de la plaie ; À utiliser avec une suture.</td></tr><tr><td>Applicateurs stériles à tige en bois à pointe de coton</td><td>Fisher scientific</td><td>22-029-488</td><td>Pour le nettoyage et le séchage des plaies chirurgicales</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>12-550-15</td><td>Pour le prélèvement de coupes cérébrales</td></tr><tr><td>VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393241</td><td>Pour le montage de lames de microscope</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Seringue Filter 0.2 &mu ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>194-2520</td><td>Pour la stérilisation d’une solution saline</td></tr><tr><td>Marqueurs cutanés stériles à double pointe de Viscot Medical</td><td>Medline</td><td>VIS1422SRL91</td><td>Pour le marquage des coordonnées sur le crâne</td></tr></tbody></table>

infusion stéréotaxique des oligomères bêta-amyloïde dans les hippocampus souris

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

La maladie d&#39;Alzheimer est une maladie neurodégénérative qui affecte le vieillissement de la population. Une caractéristique clé neuropathologiques de la maladie est la sur-production de bêta-amyloïde et le dépôt de plaques amyloïdes bêta dans les régions du cerveau des personnes souffrantes. Tout au long des années, les scientifiques ont généré de nombreux modèles de souris de la maladie d&#39;Alzheimer qui tentent de reproduire la pathologie bêta-amyloïde. Malheureusement, les modèles de souris seulement imitent de manière sélective les caractéristiques de la maladie. La mort neuronale, un effet important dans le cerveau des patients atteints de la maladie d&#39;Alzheimer, est visiblement défaut dans ces souris. Par conséquent, nous et d&#39;autres avons employé une méthode d&#39;infuser directement espèces oligomères solubles de bêta-amyloïde - formes de bêta-amyloïde qui ont été prouvés pour être plus toxique pour les neurones - stéréotaxique dans le cerveau. Dans ce rapport, nous utilisons mâles C57BL / 6J pour documenter cette technique chirurgicale de l&#39;augmentation des niveaux bêta-amyloïde dans une région du cerveau sélectionnez. Lecible de perfusion est le gyrus denté de l&#39;hippocampe, car cette structure du cerveau, ainsi que le cerveau antérieur basai qui est connectée par le circuit cholinergique, représente l&#39;un des domaines de dégénérescence dans la maladie. Les résultats de l&#39;élévation de bêta-amyloïde dans le gyrus denté par l&#39;intermédiaire d&#39;infusion stéréotaxique révèlent une augmentation de la perte de neurones dans le gyrus denté pendant 1 semaine, alors qu&#39;il ya une augmentation concomitante de la mort cellulaire et cholinergique perte de neurones dans la branche verticale de la bande diagonale de Broca du cerveau antérieur basal. Ces effets sont observés jusqu&#39;à 2 semaines. Nos données suggèrent que le modèle actuel de perfusion bêta-amyloïde fournit un modèle de souris alternative à aborder la mort des neurones spécifiques de la région en une base à court terme. L&#39;avantage de ce modèle est que les bêta-amyloïde peut être élevé d&#39;une manière spatiale et temporelle.

Le présent procédé de préparation d&#39;oligomères Aß humaine recombinante 1-42 donne espèces oligomères solubles, comprenant des monomères, des dimères, des trimères et des tétramères (figure 1A). Ce faible poids moléculaire espèces Aß 1-42, mais pas les fibrilles et les plaques, ont été présentés dans de nombreux réglages pour être plus toxique pour les neurones 1,4,9,17-19. Pour déterminer si oui ou non oligomères Aß 1-42 induit la mort des neurones dans le...

Ici, nous présentons un protocole pour la perfusion cérébrale stéréotaxique directe de bêta-amyloïde. Cette méthodologie fournit un modèle murin vivo alternatif pour aborder les effets à court terme de la bêta-amyloïde sur les neurones cérébraux.

Infusion stéréotaxique des oligomères bêta-amyloïde dans les Hippocampus souris

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

L’objectif global de cette procédure est d’injecter de manière stéréotaxique un Liga mérique bêta 1 42, dans le gyrus denté de l’hippocampe. Ceci est accompli en préparant d’abord une liga meric, une solution bêta 1 42. La deuxième étape consiste à déterminer les coordonnées d’injection.Ensuite, chirurgicalement, exposez le crâne de l’animal et introduisez-y deux trous pour l’insertion de l’aiguille. La dernière étape consiste à déplacer l’aiguille de la seringue dans sa position finale et à perfuser un bêta 1 42. Enfin, la méthode d’injection stéréotaxique Abeta 1 42 est utilisée pour examiner les effets toxiques d’Abeta 1 42 chez un animal vivant.Le principal avantage de cette technique par rapport aux modèles de souris transgéniques Abeta 42 existants est que l’ALA 42 oligomère peut être élevé de manière spéciale et temporelle et reproduire de manière fiable la pathologie de mort cellulaire qui fait défaut dans les modèles de souris transgéniques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la maladie d’Alzheimer, telles que la façon dont les processus pathologiques se propagent dans la maladie d’Alzheimer. Pour commencer cette procédure, rasez la tête d’une souris anesthésiée pour exposer la peau.Ensuite, placez la souris sur un coussin chauffant dans un cadre stéréotaxique. Fixez ensuite ses incisives dans le protège-dents et un embout nasal sur le visage de la souris. Après cela, positionnez les barres d’oreille dans le mauss auditif afin de sécuriser la tête pour vérifier.Si la tête est bien fixée, appuyez doucement dessus et assurez-vous qu’elle ne bouge pas. Appliquez ensuite une pommade sur les deux yeux pour garder l’humidité. Après cela, désinfectez le site chirurgical en appliquant de la bétadine sur la peau du crâne, suivie de 70 % d’éthanol avec des cotons-tiges stériles.Effectuez deux fois de plus le nettoyage alterné à la bétadine et à l’éthanol. Faites maintenant une incision de deux à trois millimètres dans la ligne médiane du cuir chevelu avec un scalpel. Utilisez des ciseaux fins droits pour étendre la ligne d’incision à environ 1,0 centimètre afin d’exposer la suture sagittale bgma et lambda du crâne.Après cela, utilisez des pinces pour séparer la peau. Nettoyez le crâne avec un coton-tige stérile, imbibé de solution saline stérile. Utilisez ensuite un coton-tige propre et sec pour sécher le crâne.Ensuite, marquez un point. Sur le Bre ma, positionnez la seringue Hamilton à l’aide du micro manipulateur de sorte que la pointe de l’aiguille touche juste le point sur le bgma. Enregistrez ensuite la coordonnée DV marquez un point sur le point Lambda, assurez-vous que l’axe AP du crâne est de niveau en déplaçant la seringue vers l’arrière jusqu’au point Lambda.La pointe de l’aiguille doit toucher le point Lambda comme elle l’a fait pour le point bgma. Après cela, enregistrez la position DV. Les coordonnées DV pour Bre, MA et Lambda doivent être à moins de 0,5 millimètre.Remettez maintenant la pointe de l’aiguille sur le point BMA. Enregistrez la position AP de départ. Calculez ensuite la position finale du PA en soustrayant deux millimètres du PA de départ.Coordonnez et repositionnez l’aiguille de la seringue à la coordonnée AP finale. Ensuite, enregistrez les coordonnées ML actuelles. Calculez les coordonnées ml finales gauche et droite en ajoutant ou en soustrayant 1,3 millimètre au ml de départ.Coordonnez et déplacez l’aiguille de la seringue jusqu’aux coordonnées ML finales. Touchez la pointe de l’aiguille à la surface du crâne sur les deux coordonnées ML finales et assurez-vous que les coordonnées DV sont à moins de 0,5 millimètre. Pendant qu’à la fin ml coordonné, tirez l’aiguille vers le haut, 0,5 à un centimètre au-dessus du crâne.Marquez un point sur le crâne avec un marqueur à pointe extra fine de couleur foncée. Répétez cette étape pour le côté controlatéral du crâne. Éloignez ensuite la seringue.Percez un trou sur le ml gauche ou droit. Coordonnez sur le crâne à l’aide d’un foret de 0,8 millimètre. Répétez cette étape pour le côté controlatéral.Ensuite, déplacez la seringue dans l’un des trous nouvellement introduits. Abaissez l’aiguille juste au-delà du crâne et veillez à ne pas percer le cerveau pour vous assurer que l’aiguille a dépassé le crâne. Poussez doucement l’aiguille contre le crâne pour vous assurer que l’aiguille ne sort pas du trou.Ensuite, enregistrez les coordonnées DV de départ. Calculez la fin dv. Coordonnez en soustrayant 2,2 millimètres du DV.Coordinate de départ et abaissez l’aiguille jusqu’au db final.Coordonnez puis réglez la pompe d’injection stéréotaxique pour infuser quatre microlitres d’un bêta 1 42 dans le gyrus denté à un taux de 0,5 microlitre par minute. Après la perfusion, laissez l’aiguille en place pendant une minute supplémentaire pour minimiser le reflux de la solution hors du site d’injection. Après cela, déplacez l’aiguille de l’autre côté du cerveau et répétez la procédure.Maintenant, dévissez les barres d’oreille. Utilisez une pince à motif standard pour fermer le cuir chevelu et sceller la plaie avec la suture. Retirez le protège-nez et retirez la souris.Injectez initialement un millilitre de solution saline stérile dans la souris pour l’hydratation et injectez de la buprénorphine à raison de 0,1 milligramme par kilogramme par voie sous-cutanée pour soulager la douleur. Ensuite, transférez la souris dans une cage vide et propre posée sur une plaque chauffante à 42 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle se réveille. Ensuite, retournez la souris dans sa cage d’habitation avec beaucoup de nourriture et d’eau.Cette figure montre l’infusion d’un bêta 1 42 et d’un véhicule dans les gyrus dentés gauche et droit respectifs d’une souris âgée de neuf mois. Les lignes brisées représentent le tractus d’injection et les flèches montrent le gyrus denté effondré. Dans la semaine qui a suivi l’injection d’Abeta 1 42, le gyrus denté présentait des niveaux élevés d’Abeta 1 42 dans la couche moléculaire et la couche cellulaire polymorphe près du site d’injection à sept et 14 jours.Abeta 1 42 a provoqué une augmentation de la coloration positive du tunnel et une diminution de l’épaisseur du gyrus denté, confirmant les effets neurodégénératifs d’Abeta 1 42. Ici, un fluoro aurifère traceur rétrograde a été co-injecté avec Abeta 1 42 dans le gyrus denté. Sept jours après l’injection, du fluorgold a été détecté dans le cerveau antérieur basal, suggérant le transport rétrograde du marqueur via les neurones cholinergiques.Des neurones positifs au fluorgold dans le cerveau antérieur basal ont été choisis pour la quantification. Sept jours après l’injection, Abeta 1 42 a provoqué une augmentation du tunnel et une diminution du chat. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 30 minutes si elle est effectuée correctement.Après cette procédure, d’autres méthodes peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que des études de mécanismes moléculaires pour aborder l’effet mécaniste de la perfusion amyloïde sur le cerveau. Je tiens à vous remercier d’avoir regardé notre vidéo et j’espère que la méthode vous sera utile dans vos expériences.

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Une caractéristique de la maladie d'Alzheimer est l'élévation de...

Préparation des oligomères β-amyloïde 1-42 Et induction de la plasticité synaptique Dépréciation sur les coupes d&#39;hippocampe

Cette vidéo présente une technique de perfusion continue d’anticorps spécifiques du peptide bêta-amyloïde (Aβ) dans l’hippocampe d’un rat. L’étude utilise l’implantation d’un système de canule bilatérale pour une perfusion contrôlée d’anticorps spécifiques du peptide Aβ couplée à la perfusion d’oligomères solubles Aβ (Aβo) dans l’hippocampe du rat afin d’étudier les interactions entre les oligomères et les anticorps.

Perfusion contrôlée d’anticorps spécifiques du peptide Aβ et d’oligomères Aβ dans l’hippocampe du rat

Cette vidéo démontre l'infusion stéréotaxique précise de bêta-amyloïde dans le gyrus denté pour établir un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. La détermination précise des coordonnées et l'administration contrôlée des protéines bêta-amyloïdes entraînent une dégradation neuronale, perturbent le traitement de la mémoire et contribuent au développement de la maladie d'Alzheimer.

Perfusion cérébrale stéréotaxique directe de protéines bêta-amyloïdes pour un modèle de maladie d’Alzheimer

Source : Arango-Lievano, M. et. al., Imagerie longitudinale in vivo de la cerebrovasculature : pertinence pour les maladies du SNC. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo montre l’imagerie in vivo à deux photons pour visualiser des plaques amyloïdes marquées par fluorescence et un système vasculaire cérébral. La fluorescence bleue marque les plaques, tandis que la fluorescence verte met en évidence les vaisseaux sanguins cérébraux. Une carte 3D de la région d’intérêt et une imagerie en mosaïque à haute...

Imagerie in vivo de vaisseaux cérébraux et de plaques amyloïdes dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer

Source : Slezia, A. et al. L’administration électrophorétique d’acide γ-aminobutyrique (GABA) dans un foyer épileptique prévient les convulsions chez la souris. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre l’administration électrophorétique d’acide gamma-aminobutyrique (GABA) pour inhiber l’activité convulsive chez une souris anesthésiée. Il décrit les étapes impliquées dans l’implantation de la sonde, l’enregistrement de l’activité neuronale, l’induction des crises et l’administration contrôlée de...

Administration électrophorétique de GABA dans le foyer épileptique d’une souris anesthésiée

Les microARN ont des rôles importants dans la structure et la fonction du cerveau. Nous décrivons ici une méthode pour appliquer miRNA hippocampe surexpression par injection stéréotaxique d'un lentivirus miRNA exprimant ingénierie. Cette approche peut servir comme un moyen relativement rapide pour évaluer...

Injection stéréotaxique de micro-ARN exprimant lentivirus à la souris hippocampe CA1 Région et l&#39;évaluation du résultat comportemental

Le amyloïde-β (Aß) -injected modèle animal permet à l'administration d'une quantité et d'espèces de fragments Aß défini et réduit les différences individuelles au sein de chaque groupe d'étude. Ce protocole décrit l'injection intracérébroventriculaire (ICV) de Aß sans instrument stéréotaxique, ce qui permet la production d'anomalies du comportement de type Alzheimer chez les souris normales.

Injection intracérébroventriculaire de Peptides amyloïde-ß chez les souris normales à Provoquer Pleinement Déficits cognitifs de type Alzheimer

Cet article illustre comment l’expression des récepteurs des neurotransmetteurs peut être quantifiée et le modèle analysé au niveau des synapses avec des éléments pré et postsynaptiques identifiés en utilisant une combinaison de transduction virale d’outils optogénétiques et la technique d’immunomarquage de la réplique de congélation-fracture.

Combiné optogénétiques et Cryo-fracture Replica immunomarquage examiner l&#39;aménagement spécifique à l&#39;entrée de Glutamate Receptors dans l&#39;amygdale Souris

Pour étudier les effets d’Aβo in vivo, nous avons développé un modèle basé sur des perfusions répétées d’Aβo soluble dans l’hippocampe couplées à une perfusion continue d’anticorps Aβo (6E10) dans l’hippocampe à l’aide de pompes osmotiques pour contrer l’effet neurotoxique d’Aβo.

Neurodégénérescence dans un modèle animal de chronique bêta-amyloïde Oligomère Infusion est contrecarré par Antibody traitement Infused avec les pompes osmotiques

En chirurgie de survie in utero chez la souris permet la manipulation moléculaire de l'expression des gènes pendant le développement. Nous décrivons ici l'utilisation de l'imagerie à haute fréquence à ultrasons pour guider l'injection de vecteurs rétroviraux dans le cerveau de souris au jour embryonnaire (E) 9.5.

Guidée par échographie microinjection dans le cerveau antérieur souris In Utero À E9.5

Apprenez l'infusion stéréotaxique des oligomères bêta-amyloïde dans le gyrus denté de l'hippocampus chez la souris. Cette méthode permet d'étudier les effets toxiques de l'Aβ1-42 sur les neurones en temps réel.

Infusion stéréotaxique des oligomères bêta-amyloïde dans les Hippocampus souris

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