Génération de Recombinant Human IgG anticorps monoclonaux à partir de cellules immortalisées Classé B

L'objectif général de cette procédure est de cloner et d'exprimer des anticorps produits par des cellules B. Cela est réalisé en isolant tout d'abord des cellules B à partir d'un tissu source pertinent, comme le sang ou le thymus. La deuxième étape consiste à effectuer des faits et à sélectionner la population de cellules B positive pour la production d'IgG.

Ensuite, les cellules sont immortalisées par infection avec le virus d'Epstein-Barr, associée à l'activation du récepteur de type Toll 9 par le C-P-G-O-D-N 2006, puis maintenues en culture. Les étapes finales consistent à isoler l'ARN à partir de clones qui se révèlent positifs pour la production d'IgG par Eliza, puis à générer de l'ADN complémentaire à partir des chaînes lourde et légère de l'IgG. Enfin, les séquences d'IgG peuvent être clonées dans des vecteurs d'expression mammaliens afin de produire de grandes quantités d'IgG humaine monoclonale.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la technologie d'affichage sur phage, est que l'appariement original des chaînes lourde et légère des IgG n'est pas perdu. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de l'auto-immunité, telles que la découverte et la caractérisation fonctionnelle d'auto-anticorps pathogènes. N'oubliez pas que le travail avec des échantillons provenant de patients et avec le virus EBV peut présenter des risques.

Le virus EB est un agent pathogène humain et des précautions telles que le niveau de sécurité viral deux et le port d'équipements de protection adéquats doivent toujours être prises lors de l'exécution de ces étapes. Avant de colorer les CPM, les ensemencer dans un flacon de 25 centimètres carrés contenant six millilitres de milieu RPMI 1640 complet et les laisser récupérer toute la nuit. Après le blocage et le lavage des cellules, recueillir les CPM dans un tube avec un demi-millilitre de milieu et les centrifuger. Ensuite, resuspendre les cellules dans le tampon d'étiquetage et les compter.

Ensuite, préparez deux tubes FACS contenant 5 millions de cellules dans 200 microlitres de tampon. Ajoutez 10 microlitres d'anticorps anti-CD22 P-E-R-C-P ou 40 microlitres d'anticorps anti-IgG PE, puis laissez incuber 30 minutes sur glace et à l'abri de la lumière. Lavez, filtrez, puis triez les cellules. L'objectif est de dénombrer les cellules doublement positives.

Commencez par diluer les P BMC triés à raison d'une cellule par microlitre dans le milieu complet RPMI 1640, complété avec l'ajout de CPG 2006 et du VEB. Ensuite, dans une hotte, ensemencez 110 microlitres de la dilution cellulaire contenant le VEB et le CPG 2006 dans deux puits d'une plaque de 96 puits à fond rond préalablement ensemencée avec des cellules WI 38 irradiées. L'infection avec 50 cellules par puits est optimisée et augmente la probabilité d'obtenir un anticorps monoclonal.

Cependant, nous recommandons de confirmer cela par une PCR. Après une semaine d'incubation, examiner les cellules au microscope pour observer la croissance des cellules B. Après deux semaines, changer le milieu : aspirer lentement 90 microlitres de milieu de chaque puits et les transférer dans une nouvelle plaque.

Pour tester la production d'IgG par Eliza. Ensuite, ajouter à nouveau 100 microlitres de milieu frais supplémenté, contenant de l'IL deux, à chaque puits. Continuer la surveillance de la croissance des clones pendant leur troisième et quatrième semaine de croissance.

Répéter le changement de milieu chaque semaine. Consulter le protocole écrit pour les méthodes d'expansion clonale. Vérifier le surnageant provenant des changements de milieu pour la production d'IgG à l'aide d'un dosage immunoenzymatique ou ELISA.

Commencez par préparer les plaques ELIZA afin de distribuer dans chaque puits 50 microlitres d'anticorps anti-Fc humain de chèvre, dilués au 1/200 dans du tampon d'encodage. Après une incubation suivie d'un lavage de la plaque, bloquez les puits avec 100 microlitres de tampon de blocage par puits et incubez de nouveau la plaque. À l'issue de l'incubation de blocage, éliminez le liquide de la plaque en la tapotant sur une serviette en papier.

Une fois la plaque préparée, diluez les surnageants avec quatre volumes de RPMI. Ensuite, pour les contrôles standards, effectuez une dilution en série de la solution d'IgG humaine dans le RPMI, allant de 1000 nanogrammes par millilitre à 15,6 nanogrammes par millilitre.

Inclure également un témoin. Appliquer 50 microlitres du surnageant ou de l'étalon dans chaque puits et incuber la plaque ELIZA pendant une heure à 37 degrés Celsius de la même manière ; des plaques Eliza S supplémentaires peuvent être préparées pour analyser des dilutions plus poussées des surnageants afin d'évaluer l'affinité des anticorps. Après l'incubation, laver la plaque.

Ensuite, ajouter à chaque puits 50 microlitres de tampon d'incubation contenant le fragment Fab2 conjugué à la peroxydase. Après une autre heure d'incubation et un autre lavage, ajouter 100 microlitres de solution de substrat contenant le TMB à chaque puits. Incuber ensuite la plaque pendant un maximum de 10 minutes, jusqu'à ce que la coloration bleue apparue se stabilise.

Ensuite, arrêtez la réaction et mesurez l'absorption. Tout surnageant de clone dont l'absorbance mesurée dépasse de trois écarts-types celle du témoin négatif est considéré positif.

Pour les anticorps IgG humains, la spécificité antigénique peut être détectée par des tests supplémentaires. Commencez par suivre le protocole écrit afin de synthétiser l'ADN complémentaire à partir des clones positifs. Ensuite, préparez des PCR pour les chaînes lourdes kappa et lambda de l'IgG.

Dans les résultats, repérez la chaîne lourde entre 400 et 550 paires de bases. Repérez la chaîne légère entre 300 et 400 paires de bases. Si elles ne sont pas présentes, utilisez un microlitre des produits comme matrice pour une autre PCR.

Les nouveaux produits doivent se situer dans la plage appropriée. Ensuite, procédez au clonage des meilleurs produits. Tout d'abord, séquençez-les. Leurs électrophérogrammes doivent être propres et correspondre à une séquence unique d'immunoglobuline.

Suivre le protocole écrit. Cloner le produit PCR purifié dans un microgramme d'ADN plasmidique. Veiller à effectuer la ligation toute la nuit à 16 degrés Celsius.

À l'aide de la ligase ADN T4, préparez les cellules HX dans du DMEM complémenté et faites-les croître jusqu'à une confluence de 75 % dans des flacons de culture de 75 centimètres carrés. Pour chaque transfection de chaîne lourde et chaîne légère, préparez un mélange contenant 1,75 millilitre de DMEM sans sérum, 4,5 microgrammes de vecteur de chaîne lourde, 3 microgrammes de vecteur de chaîne légère et 50 microlitres de solution de polyéthylène. Ajoutez délicatement ce mélange sur une plaque de cellules HX et agitez doucement la solution pour la répartir uniformément sur la plaque.

Incubez la plaque toute la nuit, puis commencez à collecter les milieux de culture chaque jour, en les remplaçant par un milieu sans sérum. Le milieu contient les anticorps et peut être récupéré quotidiennement pendant quatre jours après que les pBMCs positifs pour CD22 et IgG aient été triés par cytométrie en flux.

La zone des cellules doublement positives, les cellules B produisant des anticorps IgG, a été collectée séparément pour expansion. Environ 1 % des PBMC appartenaient à cette population doublement positive. Après cinq semaines de transformation par EBV et de stimulation par CPG 2006, des clones immortalisés ont été isolés.

Les cellules nourricières WI 30 présentent une forme fibroblastique plus allongée, et les clones de lymphocytes B apparaissent comme de très petites cellules rondes se développant en agrégats au centre de la plaque multipuits à fond rond. Le surnageant des clones en croissance a été testé par un ELIZA dirigé contre l’IgG. Un clone positif a été évalué sur un ELI, avec une valeur supérieure de trois écarts-types par rapport à la valeur du témoin négatif.

Au moins trois surnageants provenant d'un clone positif ont donné un résultat positif dans le ELI. Les anticorps d'un clone positif ont été séquencés après clonage des régions variables et constantes des chaînes lourde et lambda d'immunoglobuline ; les régions variables et constantes des chaînes lourde et légère ont pu être caractérisées. Suite à cette procédure.

D'autres méthodes, telles que le séquençage, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires comme l'utilisation des anticorps, des gènes, la diversité génétique, etc. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'auto-immunité pour explorer les maladies, les pathologies et les stratégies thérapeutiques pertinentes pour des maladies auto-immunes telles que la myasthénie grave. Les implications de cette technique s'étendent à la diagnostic et au traitement de maladies telles que la myasthénie grave, car la découverte d'anticorps pathogènes peut conduire au développement de nouveaux traitements, tels que des anticorps compétiteurs dépourvus d'activité inflammatoire.