Name: Génération de Recombinant Human IgG anticorps monoclonaux à partir de cellules immortalisées Classé B (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Découvrez la production d'anticorps monoclonaux IgG humains à partir de cellules B immortalisées par le virus Epstein-Barr. Cette méthode permet d'étudier les réponses immunitaires et les mécanismes auto-immuns.

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Contrat de recherche Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) à (GN-G.). Bourse de l&#39;Organisation néerlandaise pour la recherche &quot;Graduate School of Neuroscience Program translationnelle&quot; scientifique (022005019) à (CH). Les subventions du Fonds Prinses Beatrix (Projet WAR08-12) et l&#39;Association Française contre les Myopathies à (PM-M.); ainsi que par un Veni Communauté de l&#39;Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (916.10.148) une bourse de la Fondation du cerveau des Pays-Bas (FS2008 (1) -28) et le Prinses Beatrix Fonds (Projet WAR08-12) (à ML ). Nous remercions Jozien Jaspers pour son aide dans le B-tri cellulaire par cytométrie de flux.

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<li>Losen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+myasthenia+gravis+by+preventing+acetylcholine+receptor+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+making+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">A novel method for making human monoclonal antibodies.</a> J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).</li>
<li>Traggiai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells%3A+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).</li>
<li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+induced+clonal+expansion+in+immortalized+B+cells+from+the+peripheral+blood+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients.</a> J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).</li>
<li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+individual+immune+responses+elicited+by+in+vitro+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Different individual immune responses elicited by in vitro immunization.</a> Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).</li>
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<li>Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monoclonal+antibodies+by+immortalization+of+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).</li>
<li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+human+B+cells%3A+analysis+of+B+cell+repertoire+and+production+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies.</a> Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).</li>
<li>Strober, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell+growth.+Curr+Protoc+Immunol+%2F+edited+by%5BTitle%5D)+AND+%22John+E.+Coligan+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by.</a> John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A(2001).</li>
<li>Ibrahim, S. F., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and cell sorting.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).</li>
<li>Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+feeder+cells+on+the+X-ray+sensitivity+of+human+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother+Oncol%22%5BJournal%5D)">Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells.</a> Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).</li>
<li>Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Epstein-Barr+virus+growth-transformed+lymphoblastoid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> J Vis Exp. (57), 3321(2011).</li>
<li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+detection+in+automated+DNA+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis.</a> Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Dans ce manuscrit, toutes les étapes de la production d&#39;anticorps IgG à partir de PBMC humaines sont présentés en détail. Ce protocole comprend certains avantages par rapport aux techniques déjà publiés. L&#39;un des avantages est que l&#39;anticorps produit conserve les chaînes lourdes et légères correspondant à la paire initiale dans le clone de cellule B. L&#39;identification des anticorps IgG peut être effectué dans tout type de donneur humain, et il n&#39;y a pas besoin d&#39;exacerbation de la réponse immunita...

Le but de cet article est de décrire en détail une méthodologie pour générer et caractériser des anticorps monoclonaux IgG humaines obtenues à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP) humaines. L&#39;intérêt d&#39;étudier des anticorps humains a augmenté dans de nombreux domaines de recherche. En particulier, de nombreux groupes de recherche sont intéressés à la pathologie causée par des auto-anticorps 1-3. Nous avons cloné et caractérisé pathogènes auto-anticorps 1. L&#39;étude d&#39;auto-anticorps peut aider à identifier leurs objectifs et d&#39;élaborer des stratégies thérapeutiques, par exemple, en utilisant des anticorps concurrents 4. En outre, l&#39;étude d&#39;anticorps humains peut aussi être d&#39;intérêt dans d&#39;autres domaines de la recherche, à savoir, pour évaluer la réponse immunitaire après la vaccination 5, pour caractériser le profil d&#39;anticorps d&#39;individus qui ont été exposés et qui sont devenus résistants aux pathogènes spécifiques 6 ou pour étudier ce qui anticorps sont enle répertoire naturel 7,12. Plusieurs techniques ont été développées pour produire des anticorps monoclonaux humains recombinants 12/08; la plupart d&#39;entre eux utilisent phage display et l&#39;immortalisation des cellules B. L&#39;utilisation de la présentation par des phages a été largement appliquée pour la découverte de nouveaux anticorps 13. Cependant, il présente un inconvénient majeur, à savoir que les paires de chaînes lourdes et légères de l&#39;immunoglobuline humaine devenue dissociés dans le processus. Production d&#39;hybridomes à cellules B humaines ou de transformation EBV remédie à cet inconvénient. Nous utilisons l&#39;infection des cellules thymiques B par l&#39;EBV en combinaison avec une stimulation cellulaire polyclonale B par l&#39;intermédiaire des récepteurs Toll-like 9 (TLR-9) 6,12. Dans cet article, nous décrivons en détail la technologie que nous utilisons pour le développement d&#39;anticorps humains IgG, avec un aperçu complet de toutes les étapes de l&#39;isolement de la CMSP vitro génération d&#39;anticorps. Cetteprotocole peut être utilisé pour l&#39;analyse de tout type de profil IgG humaine. Dans notre laboratoire, les cellules B produisant des anticorps IgG ont été séparés avec succès à partir du reste de PBMC après triage. Cinquante cellules B trié 8 peuvent ensuite être étalées dans des plaques multi-puits et immortalisées par EBV et TLR-9 activation, de l&#39;expansion clonale de cellules B individuelles. Comme cellules nourricières, les fibroblastes provenant de tissu de poumon embryonnaire humain ont été utilisées, WI38 de lignées cellulaires, ce qui facilite la visualisation des cellules B immortalisées. A partir de ces cellules B, les séquences des chaînes lourdes et légères de l&#39;immunoglobuline peuvent être obtenues par PCR, et les gènes d&#39;anticorps clones dans immunoglobuline G vecteurs d&#39;expression et produites in vitro. Grâce à cette technique, les anticorps simples avec exactement la même séquence anticorps trouvés chez le donneur peuvent être étudiés.

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077&nbsp ;</td>Solution de <td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>contenant du polysaccharose et du diatrizoate de sodium</td></tr><tr><td>Trieur de cellules FACSAria II&nbsp ;</td><td>BD Biosciences&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 plaques micro puits à fond en U&nbsp ;</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen&nbsp ;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>Surnageant contenant 30 % v/v d’EBV de la lignée cellulaire B95-8 &nbsp ;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1612</td><td>3,4 x 108 exemplaires/ml</td></tr><tr><td>CpG2006&nbsp ;</td><td>Invivogen</td><td>ODN 7909</td><td></td></tr><tr><td>Wi38 cellules&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90020107</td><td></td></tr><tr><td>Interleukine-2</td><td>Roche&nbsp ;</td><td></td><td></td>10799068001</tr><tr><td>plaques ELISA</td><td>Greiner Bio-One, Microlon</td><td>655092</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure F(ab')2 Fragment de chèvre Anti-IgG humaines, Fc&gamma ; Spécifique à un fragment (non conjugué)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-008</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre à 4 % (bloqueur de qualité buvard)&nbsp ;</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>IgG humaines&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>I 2511</td><td>Immunoglobuline purifiée IgG HUMAINE, 5,6 mg/ml</td></tr> F<tr><td>(ab)2 IgG Fc&gamma de chèvre ; (conjugué à la peroxydase (PO))</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-036-008</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur ELISA (Perkin Elmer 2030)&nbsp ;</td><td>Perkin Elmer&nbsp ;</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Rabbit anti-Human IgM conjugué à la peroxydase, Fc5&micro ; &nbsp ; </td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>309-035-095</td><td></td></tr><tr><td>Système de synthèse directe de l’ADNc pour cellules SuperScript&nbsp ;</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>18080-200</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit d’isolement d’ARN hautement pur&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Kit système de transcription inverse</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Taq DNA polymérase</td><td>TAKARA</td><td>R001A</td><td></td></tr><tr><td>Amorces (2 &mu ; l)</td><td>Agarose ultrapure Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>100 bp échelle</td><td>Invitrogen</td><td>15628-019</td><td></td></tr><tr><td>Quantité One 4.5.2 (Gel Doc 2000)</td><td>Biorad</td><td>170-8100</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 kit de séquençage de cycle&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>plaque réactionnelle de 0,1 ml (MicroAMP Optical 96 puits)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur génétique ABI300&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>cellules compétentes DH5&alpha ; (E. coli)</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp)</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg1</td><td></td></tr><tr><td>pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp)&nbsp ;</td><td>Invivogen</td><td>pfusess-hchg4</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hk (3 875 pb)</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hclk</td><td></td></tr><tr><td>pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3 883 pb)&nbsp ;</td><td>Invivogen</td><td>pfuse2ss-hcll2</td><td></td></tr><tr><td>Milieu SOC</td><td>Invitrogen</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>Milieu gélosé à base de LB complété par Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)</td>Milieu liquide à base de Terrific Broth (TB) <td>Invivogen</td><td>fas-zn-s</td><td></td></tr><tr><td>complété par Zeocin (Fast-Media Zeo TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-zn-l</td><td></td></tr><tr><td>DNA Miniprep kit&nbsp ;</td><td>Omega Bio Technology</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop (spectrophotomètre ND1000)</td><td>Milieu</td> gélosé à base de Nanodrop <td></td><td></td></tr><tr><td>LB complété par de la blasticidine (Fast-Media Blast Agar)</td>Milieu liquide <td>à base d’Invivogen</td><td>fas-bl-s</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth (TB) complété par de la blasticidine (Fast-Media Blast TB)</td><td>Invivogen</td><td>fas-bl-l</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>20 000 U/ml, en 10x NEBuffer EcoRI</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td>10 000 U/ml, en 10x NEBuffer 2.1</td></tr><tr><td>2-Log échelle d’ADN</td><td>New England Biolabs</td><td>N3200S</td><td>0.1-10.0 kb, 1 000 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180S</td><td>10 000 U/ml, dans 10x CutSmart Buffer&nbsp ;</td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553S</td><td>10 000 U/ml, dans 10x NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0174S</td><td>5 000 U/ml, dans 10x CutSmart Buffer&nbsp ;</td></tr><tr><td>FastAP Phosphatase alcaline thermosensible</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>1 U/&micro ; l, dans 10x FastAP Buffer</td></tr><tr><td>DH5&alpha ; cellules compétentes&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>18263-012</td><td></td></tr><tr><td>PE souris anti-IgG humaines</td><td>BD Pharmingen</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone : HIB22</td><td>Fisher scientific</td><td>BDB563942</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp ;</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de recombinant human igg anticorps monoclonaux à partir de cellules immortalisées classé b

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

La découverte de nouvelles méthodes pour générer des anticorps monoclonaux humains est un domaine de recherche actif qui est important pour les sciences fondamentales et appliquées, y compris le développement d’immunothérapies. Cependant, les techniques d’identification et de production de ces anticorps ont tendance à être ardues et parfois la paire de chaînes lourde et légère des anticorps est dissociée. Ici, nous décrivons un protocole relativement simple et direct pour produire des anticorps monoclonaux recombinants humains à partir de cellules mononucléées du sang périphérique humain en utilisant l’immortalisation avec le virus d’Epstein-Barr (EBV) et l’activation du récepteur 9 de type Toll. Avec une coloration adéquate, les lymphocytes B produisant des anticorps peuvent être isolés pour une immortalisation ultérieure et une expansion clonale. Les transcrits d’anticorps produits par les clones de lymphocytes B immortalisés peuvent être amplifiés par PCR, séquencés en paires de chaînes lourdes et légères correspondantes et clonés en vecteurs d’expression d’immunoglobulines. Les anticorps obtenus avec cette technique peuvent être des outils puissants pour étudier les réponses immunitaires humaines pertinentes, y compris l’auto-immunité, et créer la base de nouvelles thérapies.

Le déclenchement de tri après coloration des cellules positives CD22 et IgG est montré à la figure 1 Dans cette image le domaine des cellules doubles positives -. Lymphocytes B producteurs d&#39;anticorps IgG - est sélectionné pour trier tous ces cellules dans un tube séparé. Dans l&#39;analyse, environ 1% du total des CMSP correspondent à cette population positive double. Le nombre de cellules triées obtenus dépendra du nombre de cellules obtenues à l&#39;article 1. Les dif...

La synthèse d’anticorps monoclonaux humains est la première étape des études visant à démêler les mécanismes physiopathologiques des réponses immunitaires médiées par les auto-anticorps. Nous avons mis au point un protocole pour générer des anticorps monoclonaux d’immunoglobuline G (IgG) humaines recombinantes à partir de lymphocytes B triés dans le sang, y compris l’isolement de lymphocytes B, le clonage d’anticorps et la synthèse in vitro.

Génération de Recombinant Human IgG anticorps monoclonaux à partir de cellules immortalisées Classé B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

L'objectif général de cette procédure est de cloner et d'exprimer des anticorps produits par des cellules B. Cela est réalisé en isolant tout d'abord des cellules B à partir d'un tissu source pertinent, comme le sang ou le thymus. La deuxième étape consiste à effectuer des faits et à sélectionner la population de cellules B positive pour la production d'IgG.Ensuite, les cellules sont immortalisées par infection avec le virus d'Epstein-Barr, associée à l'activation du récepteur de type Toll 9 par le C-P-G-O-D-N 2006, puis maintenues en culture. Les étapes finales consistent à isoler l'ARN à partir de clones qui se révèlent positifs pour la production d'IgG par Eliza, puis à générer de l'ADN complémentaire à partir des chaînes lourde et légère de l'IgG. Enfin, les séquences d'IgG peuvent être clonées dans des vecteurs d'expression mammaliens afin de produire de grandes quantités d'IgG humaine monoclonale.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la technologie d'affichage sur phage, est que l'appariement original des chaînes lourde et légère des IgG n'est pas perdu. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de l'auto-immunité, telles que la découverte et la caractérisation fonctionnelle d'auto-anticorps pathogènes. N'oubliez pas que le travail avec des échantillons provenant de patients et avec le virus EBV peut présenter des risques.Le virus EB est un agent pathogène humain et des précautions telles que le niveau de sécurité viral deux et le port d'équipements de protection adéquats doivent toujours être prises lors de l'exécution de ces étapes. Avant de colorer les CPM, les ensemencer dans un flacon de 25 centimètres carrés contenant six millilitres de milieu RPMI 1640 complet et les laisser récupérer toute la nuit. Après le blocage et le lavage des cellules, recueillir les CPM dans un tube avec un demi-millilitre de milieu et les centrifuger. Ensuite, resuspendre les cellules dans le tampon d'étiquetage et les compter.Ensuite, préparez deux tubes FACS contenant 5 millions de cellules dans 200 microlitres de tampon. Ajoutez 10 microlitres d'anticorps anti-CD22 P-E-R-C-P ou 40 microlitres d'anticorps anti-IgG PE, puis laissez incuber 30 minutes sur glace et à l'abri de la lumière. Lavez, filtrez, puis triez les cellules. L'objectif est de dénombrer les cellules doublement positives.Commencez par diluer les P BMC triés à raison d'une cellule par microlitre dans le milieu complet RPMI 1640, complété avec l'ajout de CPG 2006 et du VEB. Ensuite, dans une hotte, ensemencez 110 microlitres de la dilution cellulaire contenant le VEB et le CPG 2006 dans deux puits d'une plaque de 96 puits à fond rond préalablement ensemencée avec des cellules WI 38 irradiées. L'infection avec 50 cellules par puits est optimisée et augmente la probabilité d'obtenir un anticorps monoclonal.Cependant, nous recommandons de confirmer cela par une PCR. Après une semaine d'incubation, examiner les cellules au microscope pour observer la croissance des cellules B. Après deux semaines, changer le milieu : aspirer lentement 90 microlitres de milieu de chaque puits et les transférer dans une nouvelle plaque.Pour tester la production d'IgG par Eliza. Ensuite, ajouter à nouveau 100 microlitres de milieu frais supplémenté, contenant de l'IL deux, à chaque puits. Continuer la surveillance de la croissance des clones pendant leur troisième et quatrième semaine de croissance.Répéter le changement de milieu chaque semaine. Consulter le protocole écrit pour les méthodes d'expansion clonale. Vérifier le surnageant provenant des changements de milieu pour la production d'IgG à l'aide d'un dosage immunoenzymatique ou ELISA.Commencez par préparer les plaques ELIZA afin de distribuer dans chaque puits 50 microlitres d'anticorps anti-Fc humain de chèvre, dilués au 1/200 dans du tampon d'encodage. Après une incubation suivie d'un lavage de la plaque, bloquez les puits avec 100 microlitres de tampon de blocage par puits et incubez de nouveau la plaque. À l'issue de l'incubation de blocage, éliminez le liquide de la plaque en la tapotant sur une serviette en papier.Une fois la plaque préparée, diluez les surnageants avec quatre volumes de RPMI. Ensuite, pour les contrôles standards, effectuez une dilution en série de la solution d'IgG humaine dans le RPMI, allant de 1000 nanogrammes par millilitre à 15,6 nanogrammes par millilitre.Inclure également un témoin. Appliquer 50 microlitres du surnageant ou de l'étalon dans chaque puits et incuber la plaque ELIZA pendant une heure à 37 degrés Celsius de la même manière ; des plaques Eliza S supplémentaires peuvent être préparées pour analyser des dilutions plus poussées des surnageants afin d'évaluer l'affinité des anticorps. Après l'incubation, laver la plaque.Ensuite, ajouter à chaque puits 50 microlitres de tampon d'incubation contenant le fragment Fab2 conjugué à la peroxydase. Après une autre heure d'incubation et un autre lavage, ajouter 100 microlitres de solution de substrat contenant le TMB à chaque puits. Incuber ensuite la plaque pendant un maximum de 10 minutes, jusqu'à ce que la coloration bleue apparue se stabilise.Ensuite, arrêtez la réaction et mesurez l'absorption. Tout surnageant de clone dont l'absorbance mesurée dépasse de trois écarts-types celle du témoin négatif est considéré positif.Pour les anticorps IgG humains, la spécificité antigénique peut être détectée par des tests supplémentaires. Commencez par suivre le protocole écrit afin de synthétiser l'ADN complémentaire à partir des clones positifs. Ensuite, préparez des PCR pour les chaînes lourdes kappa et lambda de l'IgG.Dans les résultats, repérez la chaîne lourde entre 400 et 550 paires de bases. Repérez la chaîne légère entre 300 et 400 paires de bases. Si elles ne sont pas présentes, utilisez un microlitre des produits comme matrice pour une autre PCR.Les nouveaux produits doivent se situer dans la plage appropriée. Ensuite, procédez au clonage des meilleurs produits. Tout d'abord, séquen&ccedil;ez-les. Leurs &eacute;lectroph&eacute;rogrammes doivent &ecirc;tre propres et correspondre &agrave; une s&eacute;quence unique d'immunoglobuline.Suivre le protocole écrit. Cloner le produit PCR purifié dans un microgramme d'ADN plasmidique. Veiller à effectuer la ligation toute la nuit à 16 degrés Celsius.À l'aide de la ligase ADN T4, préparez les cellules HX dans du DMEM complémenté et faites-les croître jusqu'à une confluence de 75 % dans des flacons de culture de 75 centimètres carrés. Pour chaque transfection de chaîne lourde et chaîne légère, préparez un mélange contenant 1,75 millilitre de DMEM sans sérum, 4,5 microgrammes de vecteur de chaîne lourde, 3 microgrammes de vecteur de chaîne légère et 50 microlitres de solution de polyéthylène. Ajoutez délicatement ce mélange sur une plaque de cellules HX et agitez doucement la solution pour la répartir uniformément sur la plaque.Incubez la plaque toute la nuit, puis commencez à collecter les milieux de culture chaque jour, en les rempla&ccedil;ant par un milieu sans s&eacute;rum. Le milieu contient les anticorps et peut &ecirc;tre r&eacute;cup&eacute;r&eacute; quotidiennement pendant quatre jours apr&egrave;s que les pBMCs positifs pour CD22 et IgG aient &eacute;t&eacute; tri&eacute;s par cytom&eacute;trie en flux.La zone des cellules doublement positives, les cellules B produisant des anticorps IgG, a été collectée séparément pour expansion. Environ 1 % des PBMC appartenaient à cette population doublement positive. Après cinq semaines de transformation par EBV et de stimulation par CPG 2006, des clones immortalisés ont été isolés.Les cellules nourricières WI 30 présentent une forme fibroblastique plus allongée, et les clones de lymphocytes B apparaissent comme de très petites cellules rondes se développant en agrégats au centre de la plaque multipuits à fond rond. Le surnageant des clones en croissance a été testé par un ELIZA dirigé contre l’IgG. Un clone positif a été évalué sur un ELI, avec une valeur supérieure de trois écarts-types par rapport à la valeur du témoin négatif.Au moins trois surnageants provenant d'un clone positif ont donné un résultat positif dans le ELI. Les anticorps d'un clone positif ont été séquencés après clonage des régions variables et constantes des chaînes lourde et lambda d'immunoglobuline ; les régions variables et constantes des chaînes lourde et légère ont pu être caractérisées. Suite à cette procédure.D'autres méthodes, telles que le séquençage, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires comme l'utilisation des anticorps, des gènes, la diversité génétique, etc. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'auto-immunité pour explorer les maladies, les pathologies et les stratégies thérapeutiques pertinentes pour des maladies auto-immunes telles que la myasthénie grave. Les implications de cette technique s'étendent à la diagnostic et au traitement de maladies telles que la myasthénie grave, car la découverte d'anticorps pathogènes peut conduire au développement de nouveaux traitements, tels que des anticorps compétiteurs dépourvus d'activité inflammatoire.

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