Imagerie en direct de la épendymaire Cilia dans les ventricules latéraux du cerveau de souris

L'objectif général de cette procédure est d'observer ex vivo les battements des appendices motr CLIA situés dans les ventricules cérébraux de la souris. Cette observation est réalisée en prélevant d'abord l'ensemble du cerveau, puis en obtenant des sections minces passant par les ventricules latéraux. Ensuite, les tranches sont incubées dans une plaque spéciale à fond en verre contenant un milieu riche en glucose, maintenu à la température corporelle afin de maintenir le tissu en vie pendant l'expérience.

Enfin, les battements des cils sont enregistrés à l’aide d’un microscope à contraste interférentiel différentiel à haute résolution. En définitive, la structure et la localisation des protéines au niveau des cils peuvent être visualisées par imagerie en immunofluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport à notre méthode existante est qu’il s’agit de la première technique permettant de classer les cellules épidermiques en trois groupes distincts selon leurs fréquences de répétition ciliaire et leurs angles caractéristiques.

C'est bien. L'implication de cette technique s'étend vers le traitement de l'hydrocéphalie. En effet, un fonctionnement anormal de la CLIA épidermique entraîne l'accumulation de liquide céphalorachidien dans le cerveau.

Les ventricules. La procédure sera démontrée par Mme Zaha Alam et Mlle Hannah, des étudiantes très talentueuses de notre laboratoire. Commencez par nettoyer la tête d'une souris adulte avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, en partant du sommet de la tête, utilisez des ciseaux et une pince stériles pour retirer la peau et exposer le crâne.

Ensuite, réparez l'os morceau par morceau, en commençant par le côté postérieur et en progressant vers le côté antérieur. Pour retirer le crâne, sélectionnez l'ensemble du cerveau et placez-le dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant un milieu à haute teneur en glucose à 37 degrés Celsius. À l'aide d'une lame bien aiguisée, sectionnez le cerveau selon le plan sagittal médian afin d'obtenir la première section de 100 à 200 microns de chaque moitié.

Ensuite, rincez les sections avec du PBS à 37 degrés Celsius, puis placez immédiatement le tissu à 37 degrés Celsius. Pour imager les sections, placez les tranches de cerveau dans des boîtes de culture en verre de 30 millimètres à fond plat contenant un millilitre de milieu riche en glucose, et réglez l'environnement de la chambre microscopique fermée à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à l'aide d'un objectif à immersion huile de 60 x. Ensuite, focalisez sur les cellules en utilisant la lumière transmise DIC ordinaire.

Ensuite, suivre le mouvement de la bulle de DMEM comme guide pour localiser les cils mobiles. Utiliser le filtre DIC pour sélectionner une zone contenant des cellules saines dotées de cils mobiles dans le ventricule latéral du cerveau. Une fois les cils mobiles identifiés, régler la lumière et la mise au point afin d'obtenir une image satisfaisante.

Ensuite, configurez les paramètres d'acquisition en direct dans le logiciel d'imagerie. Par exemple ici, des images en 24 bits sont acquises avec un bining de la caméra réglé sur un par un, combiné à un objectif de 60 x et un temps d'exposition de cinq à 10 millisecondes. Ouvrez l'ouverture du microscope au niveau optimal pour un temps d'exposition minimal et acquérez les images en contraste interférentiel différentiel (DIC).

Observer les images en direct transmises à la caméra afin d'obtenir une acquisition d'image rapide et immédiate, sans délai. La vitesse des battements cardiaques peut ensuite être calculée en fonction des temps d'exposition minimaux requis pour obtenir un contraste d'image suffisant permettant d'enregistrer la signalisation calcique. Après avoir sectionné le cerveau, rincer brièvement le tissu dans du PBS et incuber immédiatement les sections dans 20 microgrammes par millilitre de lu O2 fraîchement préparé dans une plaque à fond en verre.

Après 30 minutes à 37 degrés Celsius, enregistrez l'oscillation calcique à une fréquence de capture de cinq millisecondes pendant au moins une seconde. D'abord à une longueur d'onde d'excitation de 488 nanomètres, puis à une longueur d'onde d'émission de 515 nanomètres. Pour visualiser les marqueurs cellulaires d'intérêt par microscopie en immunofluorescence, fixez les échantillons dans du paraformaldéhyde 4 % et du saccharose 2 % en tampon PBS pendant 10 minutes.

Laver le tissu trois fois dans du PBS, cinq minutes par lavage. Incuber ensuite les tranches de cerveau dans du Triton X 0,1 % pendant cinq minutes. Après avoir rincé les échantillons comme vient d'être montré, les incuber avec un anticorps primaire de souris anti-tubuline alpha acétylée.

Après un autre lavage au PBS, incuber les échantillons dans de l'anti-IgG-US marqué à la fluorescéine pendant une heure à température ambiante. Enfin, contre-colorer les sections avec du DPI pendant cinq minutes et observer immédiatement les cellules avec le temps d'exposition minimal possible. La présence d'un CLIA pénal est confirmée à l'aide d'un marqueur ciliaire, l'alpha-tubuline acétylée, avec une contre-coloration au DPI. Pour identifier les noyaux, l'analyse du flux de la mobilité d'un CLIA pénal est réalisée en comptant la fréquence de battement et le motif angulaire des cellules en mouvement.

Le CLIA peut ensuite être divisé en l'un des trois groupes selon ces données. Il est important de noter que l'exposition du CLIA à l'éthanol 0,25 % réprime significativement la fréquence de battement du CLIA, indépendamment de son type. Une flexion supplémentaire du CLIA déclenche une signalisation calcique intracellulaire dépendante du cil, ce qui permet la mesure du signal calcique intracellulaire au sein des ventricules cérébraux. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est correctement effectuée.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de manipuler délicatement et efficacement le tissu cérébral, afin de ne pas détruire les ventricules cérébraux après leur développement. Cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine des neurosciences d'explorer la fonction de l'appendice CLIA et du tissu cérébral vivant de souris.