Name: In vitro et in vivo modèle pour étudier ladhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Découvrez l'adhésion bactérienne sous contrainte de cisaillement en utilisant des modèles in vitro et in vivo avec Staphylococcus aureus. Cette méthode permet de visualiser en temps réel les interactions entre bactéries et endothélium vasculaire.

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Ce travail a été soutenu par le Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; &quot;Eddy Merckx subvention de recherche» et le «Sporta recherche Grant&quot; pour cardiologie pédiatrique, UZ Leuven, Belgique (JC); le Center for Molecular and Vascular Biology est soutenu par le Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), par le &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (GOA 2009/13) de l&#39;Université de Louvain et une subvention de Boehringer-Ingelheim recherche.

Les expérimentations animales ont été approuvés par le comité d&#39;éthique de la KU Leuven. 1. Préparation des bactéries in vitro perfusions et expériences in vivo <ol><li> Nous avons utilisé S. aureus souche Newman pour toutes les expériences décrites dans ce manuscrit. S. aureus Newman a été stocké dans Brain Heart Infusion (BHI) avec 10% de glycérol à -80 ° C. </li><li> Utilisez une boucle stérile pour gratter les bactéries congelées off et l&#39;inoculer dans 5 ml bouillon de soja tryptique (TSB) O / N à 37 ° C (600 OD&gt; 3). </li><li> Laver les bactéries par centrifugation (2600 g, RT, 5 min) et remettre en suspension le culot bactérien dans 5 ml de PBS (tampon phosphate salin). </li><li> Préparer une solution à 1 mg / ml de 5 (6) ester de N-hydroxysuccinimidyle carboxy-fluorescéine (carboxy-fluorescéine) dans de l&#39;éthanol. Diluer le / solution à 1 mg ml carboxy-fluorescéine à 150 pg / ml dans de l&#39;eau de qualité laboratoire (par exemple, l&#39;eau MilliQ). Protéger les tubes de lumièreavec une feuille d&#39;aluminium et conserver à -20 ° C. </li><li> Centrifuger les bactéries (2600 xg, RT, 5 min). Remettre en suspension le culot bactérien dans 800 ul de PBS et ajouter 200 ul (concentration finale de 30 ug / ml pour les expériences de perfusion) ou 400 pl (concentration finale 50 pg / ml pour les expériences in vivo) de la / ml solution de carboxy-fluorescéine 150 ug. Protéger les tubes de la lumière avec du papier aluminium et laisser incuber pendant 30 min à température ambiante sur un agitateur. </li><li> Après marquage, bloc avec bovin solution à 6% de sérum albumine (BSA) dans du PBS. </li><li> Diluer à l&#39;aide de bactéries densitométrie optique (DO), une DO600 de 0,65 pour les expériences in vitro (correspondant à environ 3 x 10 8 unités formant des colonies (UFC) / ml pour S. aureus) et une DO 600 de 1,8 pour les expériences in vivo ( correspondant à environ 1 x 10 9 CFU / ml pour S. aureus) dans du PBS. Protéger les tubes de la lumière avec une feuille d&#39;aluminium et laisser sur la glace. </li></ol> 2. Des expériences in vitro perfusion <ol><li> Revêtement de verre Lamelles <ol><li> Diluer le facteur de von Willebrand (VWF) (Haemate P, concentration stock de 2400 pg / ml) dans de l&#39;eau de qualité laboratoire (déminéralisée distillée) à une concentration finale de 50 pg / ml. </li><li> Diluer le collagène dans une solution isotonique de glucose (solution SKF, pH 2.7 à 2.9, tel que fourni par le fabricant) à une concentration finale de 160 ug / ml. </li><li> des lamelles de verre de manteau (24 × 50 mm) avec VWF ou du collagène par 200 ul de déposer le revêtement sur du parafilm et placer la lamelle couvre-objet au-dessus de la gouttelette. La goutte se propage le long de la surface de la lamelle. </li><li> Incuber la lamelle couvre-objet dans un conteneur humidifié pendant 4 heures à température ambiante. Soulevez délicatement les lamelles du parafilm avec une aiguille émoussée. Montez la lamelle dans la partie inférieure de la chambre d&#39;écoulement. </li></ol></li><li> Revêtement de plastique Slips avec les cellules endothéliales <ol><li> Bordereaux Manteau en plastique(1 puits chambre de culture de cellules APC, Sarstedt, Allemagne) avec 1 ml d&#39;une solution de gélatine à 1% dans du PBS et incuber pendant 30 min à 37 ° C. des cellules de semence humaine endotheliales de veine ombilicale (HUVEC) sur les fiches de gélatine revêtues de plastique et les cultiver à 70-80% de confluence. Montez le glissement plastique dans la partie inférieure de la chambre d&#39;écoulement. </li></ol></li><li> Perfusion Experiment REMARQUE: une vue d&#39;ensemble schématique du modèle in vitro de perfusion est représenté sur la figure 1. <ol><li> Effectuer des études in vitro l&#39;adhérence de bactéries dans une chambre d&#39;écoulement de la plaque de micro-parallèle à une contrainte de cisaillement laminaire entre 2,5 dyne / cm 2 et 20 dyne / cm 2 pour simuler des conditions d&#39;écoulement physiologiques. </li><li> Le (conception interne) chambre d&#39;écoulement est constituée d&#39;une structure métallique et une chambre de perfusion faite de plexiglas (poly (méthyl) méthacrylate de méthyle (PMMA)). En le connectant à une pompe à perfusion de haute précision (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, USA), nous pouvons générer des flux de rates entre 0,0001 ul / min et 220,82 ml / min. </li><li> Connecter le tube à la partie supérieure de la chambre d&#39;écoulement et d&#39;injecter dans le tube support. Placez délicatement la partie supérieure de la chambre d&#39;écoulement sur le dessus de la partie inférieure et assembler la chambre d&#39;écoulement. Soyez prudent pour éviter les bulles d&#39;air. Injecter 1 ml de milieu à travers la chambre pour vous assurer que la chambre ne fuit pas et pour éliminer la solution de revêtement en excès. Éviter les bulles d&#39;air. </li><li> Placez la souris sur un coussin chauffant thermo-régulée à 37 ° C sur un plateau de microscope. Etant donné que cette procédure est un terminal, il n&#39;y a pas besoin de procédures aseptiques strictes. Faire une incision près de la veine jugulaire, retirez délicatement le côté droit du muscle col de l&#39;utérus et d&#39;isoler la veine jugulaire du tissu environnant. </li><li> Mettre en place la pompe de perfusion et microscope à fluorescence. réglages de la pompe à perfusion dépendent du diamètre de la seringue et le débit souhaité (voir section 2.4). A partir de maintenant, travailler dans une pièce sombre. </li><li> Revêtement VWF: <ol><li> Remplir une seringue avec des bactéries marquées par fluorescence et de le connecter au tube d&#39;entrée. Éviter les bulles d&#39;air. Démarrer la pompe de perfusion pendant 10 minutes. Le temps de perfusion dépend du taux de cisaillement et le revêtement, les bactéries et moyen utilisés et devrait représenter l&#39;état d&#39;équilibre de l&#39;adhérence. </li><li> Après 10 min, lavé de bactéries non liées par la connexion d&#39;une seringue avec du PBS pour le tube d&#39;entrée et de démarrage de la pompe de perfusion. </li><li> Prenez au moins 15 images ou de vidéos en différents endroits après le processus de lavage. Les bactéries sont de petite taille et potentiellement difficile de se concentrer sur. Avant l&#39;expérience de flux in vitro, le plan focal approprié peut être obtenu en plaçant une goutte de bactéries marquées par fluorescence sur une lamelle couvre-objet et en plaçant la lamelle couvre-objet dans la chambre d&#39;écoulement. Ensuite, recherchez le plan focal approprié et enregistrer les paramètres. Remarque: Au cours de l&#39;expérience de flux in vitro, la capture des images au cours de l&#39;étape de lavage (± 5 min après le début) fait en sorte que seule lasignal pour les bactéries adhérentes est capturé. </li></ol></li><li> Collagène Revêtement: <ol><li> Ajouter 60 pg / ml VWF aux bactéries marquées par fluorescence juste avant de commencer la perfusion. Remplir une seringue avec des bactéries marquées par fluorescence ou des bactéries marquées par fluorescence complété avec 60 ug / ml VWF et de le connecter au tube d&#39;entrée. Éviter les bulles d&#39;air. Répétez les étapes 2.3.5.2 à 2.3.5.3 </li></ol></li><li> Cellules endothéliales: <ol><li> Activer les cellules endotheliales par perfusion avec une solution à 0,1 mM de Ca 2+ -ionophore A23187 (solution mère 10 mM dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO)) dans du DMEM à la même vitesse de cisaillement que la perfusion bactérienne pendant 10 minutes par perfusion avec un 0,1 mm. Répétez les étapes 2.3.5.2 à 2.3.5.3. </li></ol></li></ol></li><li> Calculer le taux de cisaillement et de cisaillement comme suit. taux de cisaillement = 6Q / wh 2 Où: Q: débit en ml / min, w flux: largeur en cm, h: hauteur en cm Contrainte de cisaillement (de τ) = cisaillement ratex viscosité (μ) Où μ: moyenne: 0.01 x sec dynes / cm 2, le sang total: 0,04 x sec dynes / cm 2 </li><li> L&#39;analyse d&#39;image <ol><li> Obtenir des images en direct en utilisant un microscope inversé à fluorescence avec une caméra noir et blanc et de développer l&#39;utilisation de logiciels d&#39;imagerie. Utilisez le temps d&#39;exposition de 1,5 sec. Prenez plusieurs instantanés (au moins 15) réparties de manière aléatoire sur la surface revêtue de la chambre de flux et de les enregistrer dans le format de fichier approprié. </li><li> Effectuer l&#39;analyse d&#39;image avec ImageJ. Soustraire le fond pour enlever milieux lisses continues de l&#39;image (Process - Contexte Soustraire) et définir le seuil à fixer des valeurs limites inférieure et supérieure, la segmentation des images d&#39;échelle de gris en caractéristiques d&#39;intérêt. Mesurer la zone limitée au seuil. </li><li> Comparer adhésion bactérienne, exprimée en partie fluorescente, par exemple, en utilisant un logiciel d&#39;analyse statistique. Comparer les groupes utilisant ANOVA unidirectionnelle ou two-tailed test t de Student. Signaler toutes les valeurs que moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Envisager une valeur p &lt;0,05 significative (* p &lt;0,05; ** p &lt;0,01; *** p &lt;0,001). </li></ol></li></ol> 3. mésentérique perfusion in vivo Modèle <ol><li> Préparation / chirurgie de la souris <ol><li> Jeûner la souris la nuit avant l&#39;expérience, afin de limiter le mouvement de l&#39;intestin. </li><li> Donner une vieille souris 6-8 de la semaine (C57BL / 6) l&#39;analgésie pré-opératoire par une injection sous-cutanée de la buprénorphine (0,1 mg / kg de poids corporel (BW)) 20-30 min avant la chirurgie. </li><li> Anesthésier la souris par injection intra-péritonéale de kétamine (125 mg / kg de poids corporel) et de xylazine (12,5 mg / kg de poids corporel). Vérifiez par la pédale réflexe. Appliquer une pommade vétérinaire pour prévenir la sécheresse. </li><li> Placez la souris sur un coussin chauffant thermo-régulée à 37 ° C sur un plateau de microscope. Etant donné que cette procédure est un terminal, il n&#39;y a pas besoin de ascepti strictprocédures c. Faire une incision près de la veine jugulaire, retirez délicatement le côté droit du muscle col de l&#39;utérus et d&#39;isoler la veine jugulaire du tissu environnant. </li><li> Insérez un cathéter intraveineux 2 français dans la veine jugulaire droite pour perfusion de bactéries marquées par fluorescence ou d&#39;autres solutions. Ouvrez la cavité péritonéale par une incision abdominale médiane et utiliser des cotons-tiges pour répandre le mésentère et de visualiser le artérioles mésentériques et la circulation des veinules. </li><li> Placez la souris sur le côté droit sur une plaque transparente et fixer la canule avec du ruban adhésif. Utilisez une compresse chaude pour éviter l&#39;hypothermie. Pour prévenir la déshydratation du tissu, déposer 500 pi NaCl à 0,9% sur les intestins. </li></ol></li><li> La microscopie à fluorescence de l&#39;adhérence bactérienne à la circulation mésentérique <ol><li> Travailler dans une pièce sombre. Utilisez des cotons-tiges pour immobiliser les navires et de les visualiser sous un microscope inversé. </li><li> Appliquer localement 5 pi d&#39;une solution à 10 mM of le Ca 2+ A23187 -ionophore dissous dans du DMSO. Après 10 secondes, injecter 100 pi bactéries marquées (voir l&#39;étape 1) à travers le cathéter jugulaire. Prenez des photos de time-lapse. Après l&#39;expérience est terminée, euthanasier la souris selon les directives institutionnels approuvés. </li></ol></li><li> Analyse d&#39;image <ol><li> Obtenir des images en direct en utilisant un microscope inversé à fluorescence, capturé à l&#39;aide d&#39;une caméra noir et blanc et développée en utilisant un logiciel d&#39;imagerie. Appliquer le temps d&#39;exposition automatique et l&#39;optimisation de contraste spécifique à l&#39;équipement utilisé. </li><li> Acquérir les images de time-lapse en utilisant l&#39;outil &quot;acquisition&quot; dans la barre d&#39;outils (des acquisitions multidimensionnels - Time) en utilisant 40 cycles de 1 000 images / sec. Enregistrez les images dans un format de fichier image approprié. </li><li> Traiter les images à l&#39;aide de logiciels d&#39;analyse ImageJ pour mesurer la surface de signal fluorescent par image. Définir le seuil à fixer des valeurs limites inférieure et supérieure, la segmentation des images d&#39;échelle de gris dans fonctions d&#39;intérêt. Identifier la région d&#39;intérêt (vaisseau sanguin) et mesurer la zone limitée au seuil et la région d&#39;intérêt. Comparer adhésion bactérienne, exprimée en zone fluorescente utilisant un logiciel statistique ou graphique. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Contrainte de cisaillement est un facteur crucial pour l&#39;adhésion bactérienne précoce de la paroi du vaisseau et de la génération suivante de endovasculaire ou végétations endocardiaques et les infections métastatiques 4,5. Nous avons décrit complémentaire in vitro et dans des modèles in vivo pour étudier la pathogenèse des infections endovasculaires moins de contrainte de cisaillement physiologique. Ces modèles ont permis d&#39;identifier le facteur von Willebrand-binding protein (vWbp) comme le principal S. aureus protéines d&#39;interagir sous flux avec une paroi vasculaire lésée exposer VWF 4. Infections endovasculaires, et l&#39;endocardite infectieuse, en particulier, sont une préoccupation non seulement en raison de l&#39;échec et de la mort organe induite par le sepsis, mais aussi à cause de (&#39;&#39;) métastatiques complications locales et distantes. Pour provoquer l&#39;endocardite infectieuse et les infections métastatiques, les bactéries ont à adhérer à la paroi de la cuve et donc résister à la contrainte de cisaillement de sang qui coule. Plusétudes sur les facteurs de virulence des bactéries ont été réalisées dans des conditions statiques. Cependant, ces interactions établies pourraient ne pas résister à des forces de cisaillement et des études dans des conditions d&#39;écoulement peut révéler de nouveaux facteurs, non comptabilisés précédemment dans interaction bactérie-hôte. Utilisation de la chambre d&#39;écoulement micro-parallèle, nous et d&#39;autres avons montré l&#39;importance de VWF pour l&#39;adhésion vasculaire. Sous la contrainte de cisaillement, VWF progressivement se déploie à partir de sa structure globulaire repos, et expose le domaine A1 qui interagit avec les plaquettes via son récepteur GPIb 6. chambres d&#39;écoulement ont été largement utilisés pour étudier la fonction des plaquettes 7. De manière remarquable, également S. aureus adhérence sous flux nécessite VWF, et en particulier le domaine A1 qui est exposée à un cisaillement. Nous avons identifié vWbp de médiation contraignant VWF. vWbp est une coagulase qui contribue à S. aureus physiopathologie en activant la prothrombine de l&#39;hôte. Staphylothrombine, les resUlting complexe d&#39;une coagulase bactérienne et la prothrombine, convertit le fibrinogène en fibrine insoluble 8,9. Nos études ont montré que seulement vWbp ne pas activer la prothrombine, mais déclenche la formation d&#39;agrégats de bactéries fibrine-plaquettes, qui améliorent l&#39;adhérence aux vaisseaux sanguins sous flux 4,10,11. Le modèle in vitro de la chambre de flux permet d&#39;étudier les différents acteurs de l&#39;adhérence bactérienne aux composants cellulaires ou matrice. Facteurs de virulence bactériennes peuvent être étudiés en utilisant des mutants ou des bactéries exprimant des protéines inoffensives de surface spécifiques. En variante, les inhibiteurs pharmacologiques ou des anticorps bloquants peuvent être ajoutés au milieu dans la chambre d&#39;écoulement. Le rôle des facteurs de l&#39;hôte tels que les différents constituants de la matrice extracellulaire peut être étudiée en utilisant des lamelles avec différents revêtements. Les lamelles peuvent également être recouverts avec des cellules endotheliales, dont l&#39;état d&#39;activation peut être modulée par adjonction de stimulateurs spécifiques. Apart de la paroi vasculaire, la contribution des cellules du sang de l&#39;hôte et des protéines plasmatiques peut être étudiée en ajoutant ces facteurs dans le milieu en écoulement. Par conséquent, différentes conditions de plus en plus complexes peuvent être étudiés dans des conditions normalisées de flux laminaire pour démêler les interactions qui permettent aux bactéries d&#39;adhérer à la paroi du vaisseau in vivo. Interactions identifiés dans le modèle in vitro sont ensuite étudiés dans un modèle animal pour tester leur pertinence dans un organisme complexe. Autres modèles in vivo pour étudier les interactions dynamiques sous écoulement ont été décrits, comme la chambre de hamster pli cutané dorsal 12 et le modèle de cremaster 13. En comparaison, le modèle de perfusion mésentérique décrit ici offre plusieurs avantages en raison de sa facilité d&#39;utilisation, la possibilité de faire varier accueillir fond génétique des souris et d&#39;évaluer les interventions pharmacologiques. En conclusion, les modèles décritsoffrir la possibilité d&#39;étudier des protéines non seulement de S. de surface aureus, mais de nombreux autres micro-organismes dans différents milieux d&#39;accueil, afin de mieux comprendre la pathogenèse des infections vasculaires.

Pour établir des infections endovasculaires, les agents pathogènes ont besoin d’un mécanisme pour adhérer à l’endothélium, qui tapisse la paroi des vaisseaux et la surface interne du cœur, et pour persister et établir une infection malgré l’exposition à la contrainte de cisaillement du sang qui s’écoule rapidement. L’agent pathogène le plus fréquent à l’origine d’infections endovasculaires potentiellement mortelles et d’endocardite infectieuse est Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Diverses molécules adhésives bactériennes liées à la surface médient l’adhésion au tissu hôte en interagissant avec les composants de la matrice extracellulaire. Ces MSCRAMM (composants de surface microbiens reconnaissant les molécules de la matrice adhésive) reconnaissent des molécules telles que la fibronectine, le fibrinogène, le collagène et le facteur de von Willebrand (VWF). Les MSCRAMM sont d’importants facteurs de virulence de S. aureus et sont impliqués dans la colonisation et l’invasion de l’hôte2. La plupart des études sur ces facteurs de virulence ont été réalisées dans des conditions statiques et peuvent donc ne pas être représentatives des infections humaines où l’adhésion initiale de la bactérie se produit dans le sang qui circule. 
Dans le cas des infections du sang, les bactéries doivent surmonter les forces de cisaillement du sang qui circule pour se fixer à la paroi du vaisseau. Les modèles qui étudient l’interaction entre les bactéries et l’endothélium ou le sous-endothélium dans des conditions d’écoulement sont donc particulièrement intéressants. 
Une étude récente a montré que l’adhésion de S. aureus aux vaisseaux sanguins sous contrainte de cisaillement est médiée par le VWF3. La VWF, une protéine opérationnelle du stress de cisaillement, est libérée par les cellules endothéliales lors de l’activation. Le VWF circulant se lie aux fibres de collagène de la matrice sous-endothéliale exposée. Notre groupe a rapporté que la protéine de liaison au facteur von Willebrand (vWbp) de S. aureus est cruciale pour l’adhésion médiée par cisaillement à VWF4. 
Dans cet article, nous présentons un modèle de chambre d’écoulement in vitro où l’adhésion bactérienne à différents composants de la matrice extracellulaire ou aux cellules endothéliales peut être évaluée. Pour valider les résultats à partir de données in vitro, nous avons développé un modèle in vivo qui visualise et quantifie l’interaction directe des bactéries avec la paroi du vaisseau et la formation de thrombus bactéries-plaquettes dans la circulation mésentérique des souris, en utilisant la microscopie vasculaire intravitale en temps réel.

<table><tbody><tr><td>Perfusion cerveau-cœur (BHI)</td><td>BD Plastipak&nbsp ;</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon de soja tryptique (TSB)</td><td>Oxoid</td><td>CM0129</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td>D-PBS</td></tr><tr><td>5(6)-carboxy-fluorescéine N-hydroxysuccinimidyl ester&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21878-25MG-F</td><td>marquage fluorescent</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine fraction V (BSA)</td><td>Roch</td><td>10 735 086 001</td><td></td></tr><tr><td>Haemate-P</td><td>CSL Behring</td><td>PL 15036/0010</td><td>VWF</td></tr><tr><td>Horm collagène</td><td>Takeda</td><td>10500</td><td>collagène</td></tr> 1 <tr><td>puits PCA chambres de culture cellulaire</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td>feuillets plastiques</td></tr><tr><td>Temgesic</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>283716</td><td>bruprénorphine</td></tr><tr><td>Aneskétine (chlorhydrate de kétamine 115 mg/ml (100 mg/ml kétaminum))</td><td>Eurovet</td><td>BE-V136516</td><td>kétamine</td></tr><tr><td>XYL-M 2 % (chlorhydrate de xylazine 23,32 mg/ml (20 mg/ml xylazine)</td><td>)VMD Arendonk</td><td>BE-V170581</td><td>xylazine</td></tr><tr><td>2 cathéter intraveineux français vert</td><td>Portex</td><td>200/300/010</td><td></td></tr><tr><td>0,9 % chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Baxter Healthcare</td><td>W7124</td><td></td></tr><tr><td>coton écouvillons</td><td>International Medical Product</td><td>300230</td><td></td></tr><tr><td>Solution de Ca2+-ionophore A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522-10 MG</td><td></td></tr><tr><td>26 gauge 1 ml seringue&nbsp ; &nbsp ;</td><td>BD Plastipak&nbsp ;</td><td></td><td></td>300013</tr><tr><td>seringue de calibre 26 de 1 ml avec aiguille</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td> Centrifugeuse à <td>injection intra-péritonéale</td></tr><tr><td>5810-R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.320</td><td></td></tr><tr><td>Lamles en verre (24x50)</td><td>VWR</td><td>BB02405A11</td><td>N° d’épaisseur 1</td></tr><tr><td>PHD 2000 Perfusion</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702100</td><td>Pompe à perfusion Harvard de haute précision</td></tr><tr><td>Axio-observer DI</td><td>Carl-Zeiss</td><td>Microscope</td><td></td></tr> <tr><td>à fluorescence inverséeImageJ</td><td>Logiciel</td><td></td><td>de l’Institut national d’analyse de la santé</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 5,0</td><td>Logiciel Graphpad</td> Logiciel <td></td><td>d’analyse</td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Carl-Zeiss&nbsp ;</td><td>Appareil photo</td><td></td> noir et blanc</tr></tbody></table>

in vitro et in vivo modèle pour étudier l&#39;adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

Afin de provoquer des infections endovasculaires et l&#39;endocardite infectieuse, les bactéries ont besoin pour être en mesure d&#39;adhérer à la paroi du vaisseau tout en étant exposés à la contrainte de cisaillement du sang qui coule. Pour identifier les facteurs hôtes bactériennes et qui contribuent à l&#39;adhérence de micro-organismes vasculaire, des modèles appropriés qui étudient ces interactions dans des conditions de cisaillement physiologiques sont nécessaires. Ici, nous décrivons un modèle in vitro de la chambre d&#39;écoulement en ce que permet d&#39;étudier l&#39;adhérence bactérienne aux différents composants de la matrice extracellulaire ou aux cellules endothéliales, et un modèle de microscopie intravitale qui a été développé pour visualiser directement l&#39;adhérence initiale des bactéries à la circulation splanchnique in vivo . Ces méthodes peuvent être utilisées pour identifier les facteurs hôtes bactériennes et nécessaires pour l&#39;adhésion des bactéries sous flux. Nous illustrons la pertinence de la contrainte de cisaillement et le rôle du facteur de von Willebrand pour l&#39;adhésion de Staphylococcus aureus utilisant à la fois in vitro et in vivo dans le modèle.

S. aureus adhésion à VWF, matrice sous-endothéliale et les cellules endothéliales est un phénomène dépendant de la contrainte de cisaillement Pour souligner le rôle de la contrainte de cisaillement dans l&#39;interaction entre S. aureus et VWF, nous avons réalisé des perfusions plus de VWF lamelles recouvertes de différents taux de cisaillement (un aperçu schématique du modèle in vitro de perfusion est donné dans la figure 1. L&#39;adhérence de S. aureus VWF a augmenté avec l&#39;augmentation des taux de cisaillement de 250 sec -1 à 2000 s-1 (Figure 2), ce qui indique que les forces de cisaillement élevées mais ne inhibent renforcent l&#39;adhérence de bactéries à VWF. Afin d&#39;étudier la contribution du VWF à l&#39;adhérence bactérienne au collagène, la principale composante de la matrice sous-endothéliale, nous perfusé marqué par fluorescence S. aureus sur le collagène en présence ou en l&#39;absence de VWF. En l&#39;absence de VWF, l&#39;adhérence de S. uneuréus au collagène diminue avec l&#39;augmentation des taux de cisaillement. Toutefois, lorsque le VWF est présent dans le milieu, l&#39;adhérence de S. aureus a augmenté avec l&#39;augmentation des taux de cisaillement (Figure 3). Le modèle in vitro d&#39;écoulement en nous permet également d&#39;examiner l&#39;adhésion des bactéries aux cellules endothéliales sous flux. Nous perfusé avec HUVEC marqué par fluorescence S. aureus à un taux de cisaillement de 500 à 2000 s -1. Le cas échéant, HUVECs ont été activés avec un Ca 2+ -ionophore, à provoquer la libération du VWF. Activation des cellules endothéliales et la libération subséquente VWF, une adhérence accrue de S. aureus (figure 4A), qui a formé des motifs de chaîne &quot;analogue&quot; typiques de grappes de bactéries marquées par fluorescence alignées dans la direction de la force de cisaillement (figure 4B), ce qui suggère la liaison de bactéries le long d&#39;une molécule linéaire VWF-étiré. Initial in vivoadhésion bactérienne dans les veines splanchniques est médiée par VWF Depuis S. aureus est en mesure d&#39;adhérer à VWF, nous avons utilisé des souris de type sauvage (vWF + / +) et VWF souris déficientes (vWF - / -) pour étudier l&#39;adhésion bactérienne sur la paroi du vaisseau activé in vivo. Vidéomicroscopie en temps réel des veines splanchniques permis la visualisation in vivo de circuler marqué par fluorescence S. aureus (Vue d&#39;ensemble schématique du modèle in vivo de perfusion est représenté sur la figure 5). Après l&#39;activation pharmacologique de l&#39;endothélium par le Ca2 + -ionophore, nous avons observé une accumulation locale rapide des bactéries et des agrégats de bactéries individuelles à la paroi de la cuve de souris WT (Vidéos supplémentaire de 1 et 2). Presque aucune adhésion des bactéries n&#39;a été observée sur la paroi de la cuve du vWF activé -deficiesouris nt (vidéo supplémentaire 3) par rapport à l&#39;adhérence chez les souris WT (Figure 6). L&#39;absence de VWF diminue la capacité de S. aureus à adhérer à la paroi du vaisseau activé. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation schématique du modèle de flux in vitro. Le modèle d&#39;écoulement vitro dans un modèle multifonctionnel, ce qui permet l&#39;étude des différents mécanismes qui dépendent de cisaillement telle que l&#39;adhérence bactérienne à la matrice sous-endothéliale, mais aussi la formation thrombus. La chambre d&#39;écoulement micro-parallèle est placée sur une lamelle couvre-objet (plastique ou verre) avec différents revêtements de protéines et de cellules endotheliales. L&#39;adhérence des bactéries différentes (orange et points gris) peut être analysé, et l&#39;impact de la présence de protéines de plasma, les plaquettes et le sang total peut être évalué. Des marqueurs fluorescents pour les plaquettes (bleu) ou ovales fibrinogfr (strings bleu) peut être utilisé en combinaison avec différents inhibiteurs (ovales noires) de distinguer les facteurs bactériens et d&#39;accueil. Des images représentatives de l&#39;adhésion bactérienne de S. aureus au collagène revêtement en présence (en bas) ou l&#39;absence (en haut) du VWF sont présentées (barre d&#39;échelle est de 100 um). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Figure 2. L&#39;adhérence de S. aureus à VWF augmente avec l&#39;augmentation des taux de cisaillement. Micro-parallèle perfusion de la chambre d&#39;écoulement au-dessus de VWF enrobé (50 pg / ml) marqué par fluorescence avec S. aureus Newman au taux de cisaillement de 250 à 2.000 sec -1 (sec -1) dans le milieu (n&gt; 5). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> Figure 3. L&#39;adhérence de S. aureus à sous-endothélium est dépendante de cisaillement et VWF. Micro-parallèle perfusion de la chambre d&#39;écoulement au-dessus de collagène revêtu (160 ug / ml) marqué par fluorescence avec S. aureus Newman au taux de cisaillement de 250 à 2.000 sec -1 en moyenne (n&gt; 5). VWF (60 ug / ml) était présent dans le milieu spécification. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. ** P &lt;0,01. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Figure 4. L&#39;adhérence de S. aureus aux cellules endothéliales activées est dépendante cisaillement. chambre d&#39;écoulement perfusion de Micro-parallèle sur les cellules endothéliales. (A) les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine ont été activés avec le Ca2 + A -ionophore23 187 (0,1 mM) suivie d&#39;une perfusion de 10 min marqué par fluorescence S. aureus Newman au taux de cisaillement de 500 à 2.000 sec -1 en moyenne (n&gt; 5). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. * P &lt;0,05. (B) Image de la micro-parallèle chambre d&#39;écoulement perfusion sur HUVEC activées avec S. aureus à un taux de cisaillement de 1000 sec -2. S. aureus forme des chaînes de ± 200 microns de longueur, ce qui suggère l&#39;adhésion à multimères VWF (barre d&#39;échelle est de 100 um). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> Figure 5. Un aperçu schématique du modèle de perfusion mésentérique in vivo. Un droit de cathéter de la veine jugulaire (ligne jaune) est inséré pour l&#39;administration de fluorbactéries escently marqués (points orange), des anesthésiques supplémentaires ou d&#39;autres composants tels que les inhibiteurs pharmaceutiques et des anticorps. La cavité peritoneale est ouverte et le mésentère, réparties de visualiser les vaisseaux sanguins (artériels et veineux) sous un microscope à fluorescence. Après l&#39;activation pharmacologique de l&#39;endothélium par un -ionophore Ca2 +, ce qui induit la libération de VWF, les bactéries peuvent être injectés à travers le cathéter de la veine jugulaire. Vidéo en temps réel intravasculaire microscopie permet la visualisation in vivo de circulation bactéries marquées par fluorescence et de la formation résultant de bactéries-plaquettaires thrombus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> Figure 6. L&#39;adhérence initiale de S. aureusà l&#39;endothélium activé in vivo est médiée par VWF In vivo veineuse modèle de perfusion mésentérique avec C57BL / 6- VWF + / + et C57BL / 6- VWF -. / - souris. L&#39;adhérence de S. marqué par fluorescence aureus à la paroi du vaisseau actif localement est significativement plus faible dans Vwf - / - souris. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. *** P &lt;0,001, n&gt; 7. <img alt="Vidéo Figure 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> Vidéo 1: adhérence en temps réel de S. aureus à la paroi du vaisseau activé dans + / + souris VWF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a> Vidéo 2: la formation d&#39;agrégats en temps réel et l&#39;embolisation de S. aureus dans Vwf des souris + / +. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a> <img alt="Vidéo Figure 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> Vidéo 3: adhérence en temps réel de S. aureus à la paroi du vaisseau activé dans Vwf - / -. In vivo souris modèle de perfusion mésentérique avec Vwf + / + et Vwf souris - / -. Cinq ul d&#39;une -ionophore Ca2 + (10 mM) a été applied dans la région du lit vasculaire visualisée. Une suspension de carboxy-fluorescéine S. aureus a été injecté à travers le cathéter jugulaire. La circulation mésentérique a été visualisée sous un microscope inversé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a>

Pour étudier l’interaction des bactéries avec les vaisseaux sanguins sous contrainte de cisaillement, une chambre d’écoulement et un modèle de microscopie intravitale mésentérique in vivo sont décrits qui permettent de disséquer les facteurs bactériens et hôtes contribuant à l’adhésion vasculaire.

In vitro et in vivo modèle pour étudier l&#39;adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier l'interaction entre les bactéries et l'endothélium ainsi que le sous-endothélium sous contrainte de cisaillement. Cette étude est réalisée en marquant les bactéries de manière fluorescente afin de les visualiser en temps réel par microscopie vidéo dans un deuxième temps. Une chambre d'écoulement in vitro est utilisée pour analyser les différents acteurs impliqués dans l'adhésion des bactéries en écoulement aux composants cellulaires ou matriciels.Ensuite, les interactions identifiées dans le modèle in vitro sont étudiées dans le modèle de perfusion mésentérique in vivo afin de tester leur pertinence dans un organisme complexe. Les résultats montrent que Staphylococcus aureus est capable d'adhérer aux cellules endothéliales activées ainsi qu'à la sous-endothélium sous contrainte de cisaillement. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans l'association d'un modèle in vitro et d'un modèle in vivo, qui se complètent pour étudier la pathogenèse des infections endovasculaires sous contrainte de cisaillement. Ces méthodes permettent de répondre à des questions clés dans le domaine des maladies infectieuses et de la biologie vasculaire, telles que la manière dont l'endocardite infectieuse et les infections métastatiques s'établissent sous une contrainte de cisaillement physiologique. Nous détaillons ici une procédure au cours de laquelle Malin, une technicienne spécialisée dans le travail animalier de notre laboratoire, commence par préparer le colorant fluorescent utilisé pour suivre les bactéries.Ajoutez 150 microlitres d'une solution fluorescente carboxy stock dans 850 microlitres d'eau de qualité laboratoire et mélangez. Conservez la solution à l'abri de la lumière à moins 20 degrés Celsius jusqu'à ce qu'elle soit nécessaire. Ensuite, faites tomber en pellet un culot de cinq millilitres de S. reus.Les bactéries cultivées pendant la nuit dans un bouillon de soja tryptique sont lavées une fois avec du PBS, puis resuspendues. Au nouveau culot dans 800 microlitres de PBS, ajouter 200 microlitres de la solution de colorant pour des expériences de perfusion in vitro, ou 400 microlitres de la solution de colorant. Pour les expériences in vivo, couvrir les tubes avec du papier d'aluminium afin d'éviter la photodégradation du colorant et incuber sur un agitateur pendant 30 minutes à température ambiante.Ensuite, ajoutez une solution d'albumine sérique de bovin à 6 % dans du PBS au mélange afin de bloquer la liaison non spécifique. Vérifiez la concentration des cellules à l’aide de la cytométrie optique et diluez les bactéries dans du PBS à différentes concentrations selon leur application. Une fois diluées, protégez les tubes de la lumière et placez-les sur de la glace.Diluer le facteur de von Willebrand dans de l'eau de qualité laboratoire jusqu'à une concentration finale de 50 microgrammes par millilitre. Diluer également le collagène dans une solution de glucose isotonique jusqu'à une concentration finale de 160 microgrammes par millilitre. Ensuite, déposer 200 microlitres de chaque revêtement sur une bande de paraforme.Placer les lamelles au-dessus des gouttes afin de les recouvrir des protéines. Incuber les lamelles dans un récipient humidifié pendant quatre heures à température ambiante. Ensuite, soulever délicatement les lamelles du paraforme à l’aide d’une aiguille contondante et monter la lamelle dans la partie inférieure d’une chambre à écoulement pour les expériences avec les cellules endothéliales ; recouvrir des lamelles en plastique d’un millilitre de solution de gélatine à 1 % dans le PBS et les incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.Ensuite, ensemencer des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine sur les lamelles en plastique recouvertes de gélatine et les cultiver jusqu'à une confluence de 70 à 80 %. Placer la lamelle recouverte de protéine ou la lamelle en plastique recouverte de cellules endothéliales dans la partie inférieure de la chambre à flux. Puis relier les tubulures d'entrée et de sortie à la partie supérieure de la chambre à flux et connecter la tubulure de sortie à un récipient de déchets.Placer délicatement la partie supérieure de la chambre d'écoulement sur la partie inférieure et assembler la chambre d'écoulement, tout en évitant la formation de bulles d'air. Injecter un millilitre de milieu à travers la chambre pour s'assurer qu'elle ne fuit pas et pour éliminer l'excès de solution d'encollage.Ensuite, préparez la pompe à perfusion pour une seringue d'un millilitre afin qu'elle débite à 75 microlitres par minute. Dans une pièce sombre, remplissez une seringue d'un millilitre avec un millilitre de bactéries marquées au fluorochrome et insérez-la dans la pompe à perfusion. Connectez la sortie de la seringue à l'entrée de la chambre d'écoulement.En prenant soin d'éviter les bulles d'air, lancez la pompe d'infusion pendant 10 minutes à raison de 75 microlitres par minute. Après 10 minutes, retirez la première seringue et connectez une seringue d'un millilitre contenant du PBS ou du DMEM au tube d'entrée. Commencez l'infusion, faites circuler le liquide et rincez pendant 10 minutes afin d'éliminer les bactéries non liées.Une fois rincé, laisser la pompe à perfusion en marche et acquérir au moins 15 images en noir et blanc, en utilisant un temps de pose de 1,5 seconde, à des emplacements aléatoires répartis sur la surface revêtue de la chambre d'écoulement. À l’aide d’un logiciel d’analyse d’image tel qu’Image J, soustraire le fond afin d’éliminer les fonds continus et uniformes de l’image, puis définir le seuil pour ajuster les valeurs de seuil inférieur et supérieur, ce qui permet de segmenter les images en niveaux de gris en fonction des éléments d’intérêt. Ensuite, mesurer la surface limitée au seuil nouvellement défini et enregistrer cette valeur, appelée surface fluorescente, pour chaque échantillon.Jeûner les souris de huit semaines pendant la nuit précédant l'expérience afin de réduire les mouvements intestinaux. Le jour de l'expérience, commencer par injecter 0,1 milligramme de buprénorphine par kilogramme de poids corporel en tant qu'analgésique. Ensuite, anesthésier la souris et appliquer un onguent sur les yeux.Placer la souris sur le tapis chauffant à température contrôlée sous le microscope stéréoscopique et vérifier que la souris ne présente aucun réflexe palpébral. Réaliser une incision d’un centimètre parallèlement à la veine jugulaire. Retirer la partie droite du muscle cervical, puis isoler la veine jugulaire des tissus environnants.Insérez un cathéter intraveineux de deux French dans la veine jugulaire droite et fixez-le en place à l’aide de points de suture. Ensuite, pratiquez une incision abdominale médiane pour ouvrir la cavité péritonéale. Placez la souris sur son côté droit sur une plaque transparente et fixez la canule avec du ruban adhésif.Retirer délicatement les intestins à l’aide de coton-tiges et étaler le mésein. Afin de visualiser la circulation artériolaire et veineuse méseinique. Placer une poche chaude sur la souris pour prévenir l’hypothermie et ajouter 500 microlitres de NaCl 0,9 % sur les intestins toutes les 30 minutes pour éviter la déshydratation du tissu.Utilisez des cotons-tiges pour immobiliser les vaisseaux et les visualiser au microscope inversé. Ensuite, appliquez par voie topique cinq microlitres d'une solution de 10 millimolaire d'ionophore de calcium quatre dissoute dans le DMSO. Ceci induira la libération du facteur de Von Willebrand par les cellules endothéliales des vaisseaux.Après 10 secondes, injecter 100 microlitres des bactéries marquées au fluorochrome par le cathéter jugulaire. À ce moment, commencer à acquérir des images en laps de temps, en utilisant l'outil d'acquisition dans la barre d'outils avec 40 cycles à 1000 images par seconde. Une fois l'acquisition d'images terminée, euthanasier la souris conformément aux directives institutionnelles.Enregistrer les images dans un format de fichier image approprié, puis traiter les images à l'aide du logiciel d'analyse ImageJ comme décrit précédemment. Afin de mettre en évidence le rôle des contraintes de cisaillement sur l'adhésion bactérienne, des perfusions de Staphylococcus aureus ont été réalisées à différents taux de cisaillement sur des lamelles recouvertes de facteur de Von Willebrand. Lorsque les taux de cisaillement augmentent, l'adhésion bactérienne augmente également, indiquant que les forces de cisaillement élevées n'inhibent pas l'adhésion, mais la renforcent. En l'absence de facteur de Von Willebrand, l'adhésion de Staphylococcus aureus au collagène diminue avec l'augmentation des taux de cisaillement.Cependant, lorsque le facteur Von Vand était présent dans le milieu, l'adhésion des bactéries augmentait avec les taux de cisaillement croissants ; les cellules endothéliales activées par un ionophore du calcium afin de libérer le facteur Vand présentaient une adhérence bactérienne significativement plus élevée que les cellules non activées. De plus, les bactéries formaient des motifs typiques en forme de chaînettes, constitués d'agrégats bactériens marqués de manière fluorescente, alignés dans la direction de la force de cisaillement, suggérant une liaison des bactéries le long d'une molécule de VWF étirée linéairement. Afin de tester l'effet du facteur Von Vbr in vivo, les cellules endothéliales de la circulation mésentérique furent activées pour libérer le facteur von Vbr, puis des cellules bactériennes marquées de manière fluorescente furent introduites dans la circulation sanguine. Les bactéries adhérèrent localement à la paroi vasculaire activée et formèrent des agrégats.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez mieux comprendre comment étudier l'interaction entre les bactéries et la paroi vasculaire sous contrainte de cisaillement, en marquant fluorescentemment les bactéries et en les visualisant à la fois dans une chambre d'écoulement in vitro et dans un modèle in vivo de perfusion mésentérique intravitale. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine des infections cardiovasculaires pour explorer l'interaction entre les agents pathogènes et la paroi vasculaire dans l'endocardite infectieuse et les infections métastatiques.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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