Name: Mesure de dommages et réparation de lADN dans les splénocytes de souris Après chronique In Vivo Lexposition à de très faibles doses de bêta et gamma Rayonnement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-03T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Apprenez à mesurer les dommages et la réparation de l'ADN dans les splénocytes de souris après exposition chronique à de faibles doses de rayonnement bêta et gamma par cytométrie en flux.

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Les auteurs tiennent à souligner la contribution de nos collègues Sandrine Roch-Lefèvre et Eric Grégoire de l’Institut de radioprotection et de sûreté nucléaire (Paris, France). Ces travaux ont été appuyés par le programme des Sciences et de la Technologie du gouvernement du Canada des Laboratoires Nucléaires Canadiens (Chalk River, Ontario, Canada), du Groupe des propriétaires de CANDU (Toronto, Ontario, Canada), de la Commission canadienne de sûreté nucléaire et de l’Institut de radioprotection et de sûreté nucléaire (Paris, France).

Toutes les procédures de manutention et de traitement souris doivent se conformer aux règles édictées par les programmes de l&#39;Assemblée législative et / ou soins des animaux et approuvées par un comité de protection des animaux. Toutes les méthodes décrites dans le présent protocole ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux, avec l&#39;approbation du comité de protection des animaux. ATTENTION: Tous les travaux avec la radioactivité (y compris, mais non limité à la manipulation de tritium, γ-irradiation externe, la manipulation des tissus animaux radioactifs, déchets de litière) devrait adhérer aux règles énoncées par les autorités de l&#39;Assemblée législative et / ou de radioprotection et être effectuée par des personnes autorisées le personnel dans un laboratoire et / ou des installations certifiées. 1. animale Travail <ol><li> Groupement animal <ol><li> Si les souris arrivent d&#39;une organisation externe, acclimater les animaux pendant au moins 10 jours dans l&#39;animalerie. Si l&#39;étude comprend plusieurs groupes de traitement, veiller à ce que le fournisseur des animaux peut envoyer all les animaux comme un seul lot. </li><li> Allouer au hasard les souris à des groupes de 10 souris par groupe de traitement. Si vous utilisez des souris mâles de la souche C57BL / 6, ont le fournisseur des animaux pré-organiser la randomisation de très jeunes C57BL / 6 mâles dans leur établissement pour atténuer les problèmes d&#39;agressivité. </li></ol></li><li> Exposition chronique de souris à β-Internal Radiation <ol><li> Préparer des concentrations de travail de tritium (10 kBq / L et 1 MBq / L) dans l&#39;eau potable de la souris en diluant le stock initial de HTO et OBT (un mélange de proline tritiée, l&#39;alanine et la glycine acides aminés) des solutions. </li><li> Validate les concentrations finales de tritium dans l&#39;eau de boisson par mesure de la radioactivité en utilisant un compteur à scintillation liquide. Ajuster la concentration, si nécessaire. </li><li> Traiter les animaux pendant un mois en fournissant un accès ad libitum à l&#39;eau de tritium. Si l&#39;eau de traitement est faible au cours de la période de deux semaines, ajouter plus d&#39;eau. Sinon, changer bouteilles à deux semaines. </li><li> Traiter imposture irradié commandesouris identique. Gardez-les dans une pièce séparée «propre» ou sur une grille séparée &quot;propre&quot; sous pression d&#39;air positive pour éviter la contamination croisée tritium dans l&#39;air. </li></ol></li><li> Exposition chronique de souris externe à γ-radiations Remarque: γ-irradiation installation / équipement varie en fonction de l&#39;emplacement. </li><li> En utilisant des méthodes de dosimétrie disponibles, déterminer les distances à partir d&#39;une source de rayonnement γ qui ont des champs de rayonnement produisant les doses désirées. Assurer l&#39;homogénéité de champs de rayonnement dans les zones couvrant les cages pour animaux. Remarque: 1,7 Gy / h est équivalente à un taux de dose produite par une MBq / L de tritium dans le corps. </li><li> Exposer les souris en plaçant les cages de souris à des distances déterminées à l&#39;étape 1.3.1 pour un mois. Réduire interruption quotidienne de γ-irradiation à 30 min. Utilisez dosimètres à thermoluminescence pour mesurer des doses totales absorbées. </li></ol> 2. sacrifices et d&#39;échantillonnage <ol&gt; <li> Élaborer des instruments chirurgicaux stériles, 60 mm boîtes de Pétri avec insérées crépines cellulaires 70 microns, 15 ml et tubes de 1,5 ml, milieu RPMI supplémenté avec 5% de sérum fœtal bovin (FBS) et le lieu tout dans une enceinte de sécurité biologique. Assurer la stérilité du travail est cruciale. </li><li> Distribuer 5 ml de milieu RPMI dans chaque boîte de Pétri de 60 mm. </li><li> Sacrifiez souris en utilisant une méthode approuvée par le comité de protection des animaux. La dislocation cervicale est un bon choix pour le travail de splénocyte décrites dans ce protocole. Toutefois, si des échantillons de sang pour les autres essais (par exemple, pour le mFISH, le micronoyau de bloc de cytochalasine ou d&#39;autres dosages de genetoxicity commune) sont nécessaires, utiliser ponction intra-cardiaque après l&#39;anesthésie à l&#39;isoflurane. </li><li> Placez l&#39;animal en décubitus dorsal, la tête vers le loin de vous. Vaporiser la souris vers le bas avec 70% d&#39;éthanol. En utilisant des pinces, saisir la peau antérieurement à l&#39;ouverture de l&#39;urètre et de faire une petite incision avec des ciseaux dans la région périnéale. <ol&gt; <li> De cette incision, couper le long de la ligne médiane ventrale de la cavité de la poitrine, en faisant attention à ne couper la peau et non la paroi musculaire dessous. Disséquer la peau loin de la ligne médiane. </li><li> Saisir la paroi abdominale avec une pince et couper le long de l&#39;axe médian de la paroi musculaire à ouvrir la cavité abdominale. </li></ol></li><li> Exciser la rate par une légère saisissant avec des pinces stériles et en tirant doucement sur elle, tout en réduisant simultanément loin le tissu conjonctif avec des ciseaux. </li><li> Coupez un petit morceau de la rate (environ 1/10 de la rate) et placer dans un tube de 1,5 ml. Aligner congeler dans de l&#39;azote liquide pour un stockage ultérieur à -80 ° C pour des analyses supplémentaires. </li><li> Passer le reste de la rate dans un tamis cellulaire à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Petri de 60 mm avec 5 ml de milieu RPMI pré-distribué. </li><li> Passez à la prochaine souris. Remarque: Extrait rates peuvent être conservés dans des boîtes de 60 mm avec les médias (pour un maximum de 2 heures), tandis que le reste des souris sont sacrificéd. En fonction du nombre de participants, entre 5 et 15 souris peuvent être traitées en une seule journée. </li></ol> 3. Préparation de cultures splénocytes <ol><li> Homogénéiser la rate en hachant l&#39;intérieur d&#39;un tamis cellulaire avec des pinces stériles avec une extrémité recourbée. </li><li> Retirer le filtre de la cellule et de recueillir la suspension de cellules filtré à partir de la boîte de 60 mm dans un tube de 15 ml. </li><li> Rincer la crépine de cellules avec 5 ml de milieu pour collecter le reste des cellules. </li><li> Tubes à centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml de RPMI. </li><li> Tubes à centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Décanter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml de RPMI. </li><li> Transfert 4 ml de suspension de cellules dans un ballon de culture de 25 ml de tissu et la déplacer dans un incubateur à CO2 (37 ° C, 5% de CO2, 80% d&#39;humidité) </li></ol> 4. Remettre en question l&#39;irradiation et de fixation <ol><li> Transférer lereste 1 ml de suspension cellulaire de l&#39;étape 3.8 dans un tube de 1,5 ml sur la glace et centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. dommages à l&#39;ADN mesurée dans cet échantillon représentera les dommages induite par le traitement et t = 0 point de données pour la construction d&#39;une courbe de réparation d&#39;ADN. </li><li> Aspirer soigneusement le surnageant en utilisant une pompe à vide. Doucement remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon TBS (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 2,7 mM). </li><li> Tubes à centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer soigneusement le surnageant en utilisant une pompe à vide. Doucement remettre en suspension le culot dans 300 pi de TBS. </li><li> Tout en mélangeant au vortex à faible vitesse, ajouter 700 ul de -20 ° C 100% d&#39;éthanol. Fermer le couvercle et retourner plusieurs fois pour mélanger. </li><li> Conserver les échantillons à -20 ° C. Splénocytes fixes dans l&#39;éthanol peuvent être conservés à -20 ° C pendant au moins 12 mois sans perte notable dans le signal γH2AX. </li><li> Irradier les cultures de splénocytes de l&#39;étape 3.8 avec un γ-rad difficile<html> dose de iation de 2 Gy à un débit de dose ≥ 200 mGy / min à l&#39;aide disponible dispositif d&#39;irradiation. Remarque: Le but de cette irradiation est d&#39;induire l&#39;ADN ORD pour contester la machinerie de réparation. Les rayons X peuvent également être utilisés à cette fin. </li><li> Remettre immédiatement les cultures à un incubateur à CO2. </li><li> 1 heure après la difficile irradiation 2 Gy, retirez les cultures de l&#39;incubateur à une enceinte de sécurité biologique. Pour prélever un échantillon aliquote représentant, doucement remettre en suspension les cellules à l&#39;aide d&#39;une pipette et le transfert de 1 ml de la suspension cellulaire à un tube de 1,5 ml sur de la glace. Remettre les cultures de cellules à un incubateur à CO 2. </li><li> Tubes à centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer soigneusement le surnageant en utilisant une pompe à vide. Doucement remettre en suspension le culot dans 1 ml de TBS. </li><li> Répétez les étapes 4.3 à 4.5. </li><li> 24 heures après la 2 Gy γ-irradiation difficile, la récolte et la fixer à 24 heures = échantillon tel que décrit à l&#39;étape 4/8 à 4/10. </li></ol>TLE &quot;&gt; 5. immunofluorescence marquage avec Anti-γH2AX Anticorps Remarque: En règle générale, 15 - 30 échantillons par jour peuvent être immunofluorescence étiquetés et analysés par cytométrie de flux en un seul passage. Pour assurer une comparaison exacte entre les groupes de traitement, y compris l&#39;échantillon (s) de chaque groupe. Voir aussi la référence 16 pour plus de détails. <ol><li> Préparer un ensemble marqué de tubes pour le nombre d&#39;échantillons à traiter et les placer sur la glace. Utilisez 12 x 75 mm tubes en verre non plafonnés. La stérilité est pas nécessaire pour ce travail. Inclure un échantillon de contrôle historiques supplémentaires pour le marquage avec l&#39;anticorps secondaire seulement (&quot;Ab 2e seulement&quot;). Utilisez cet exemple de commande historique dans tous les cytométrie de flux de fonctionner au sein d&#39;une étude. </li><li> Ajouter 0,5 ml de glace-froid SCT à chaque tube. </li><li> Retirer splénocytes fixes de -20 ° C, vortex pendant 5 secondes et de transférer une aliquote de 0,5 ml à tubes préparés avec le SCT. Placez le reste des échantillons de nouveau dans -20 ° C stockage etgarder comme un échantillon de sauvegarde. </li><li> splénocytes de centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans 1 ml de glace-froid du TBS contenant 1% de FBS </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans 1 ml de tampon TST (0,05% de Triton X-100, 2% de FBS dans du TBS). Incuber pendant 20 min sur de la glace. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans 200 pl d&#39;anticorps anti-γH2AX primaire dilué 1: 150 dans du tampon TST. Utilisez 200 pi de TST pour le &quot;2e Ab seulement&quot; échantillon de contrôle. </li><li> tubes de position sur un agitateur rotatif à un angle de 45 - 60 ° et agiter pendant 1,5 h à 300 g à RT. </li><li> Bien que les tubes sont en incubation, préparer un volume suffisant (200 ul / échantillon) de l&#39;anticorps secondaire anti-souris de chèvre conjugué à Alexa-488 à une dilution de 1: 200 dans du tampon TST. Remarque: Tous les travaux impliquant Alexa-488anticorps conjugué (étapes 5.10 à 5.16 ci-dessous) doit être effectuée dans des conditions de faible luminosité et des échantillons étiquetés doit être protégé de la lumière en enveloppant les tubes dans une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Une fois que le 1,5 heures d&#39;incubation est terminée, ajouter 1 ml de TBS glacée contenant 2% de FBS à chaque tube et centrifuger à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans 1 ml de TBS contenant 2% de FBS. </li><li> Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans 200 pl de la solution d&#39;anticorps secondaire de l&#39;étape 5.8. </li><li> Incuber les échantillons sur une plate-forme agitation pendant 1 h comme dans l&#39;étape 5.7. </li><li> Ajouter 1 ml de glace-froid du TBS contenant 1% de FBS. </li><li> Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement culot dans 1 ml de glace-froid SCT. </li><li> Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot dans 0,5 ml de TBS contenant 50 ug / mliodure de propidium. </li><li> Incuber pendant 5 min à température ambiante à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Analyser les échantillons sur un cytomètre de flux en utilisant des protocoles spécifiques à l&#39;instrument 16. Lisez au moins 10 000 cellules par échantillon. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents connus.

Le protocole présenté dans ce document est utile pour la réalisation à grande échelle de la souris dans les études in vivo portant sur ​​les effets génotoxiques des faibles niveaux de divers agents chimiques et physiques, y compris les rayonnements ionisants. Notre installation unique et spécifique des animaux exempts de pathogènes équipé d&#39;un irradiateur GammaBeam 150 et une salle d&#39;irradiation longue de 30 mètres permet la réalisation d&#39;études long de la vie impliquant des irradiations fa...

Une importante controverse sur les effets nocifs potentiels de doses soit faibles ou très faibles de rayonnement et de la peur de publique de rayonnement, tirée par les images des bombardements atomiques d&#39;Hiroshima et de Nagasaki et de rares accidents de centrales nucléaires ionisants (exacerbée par les médias de masse), a conduit à de très la réglementation et les normes qui sont potentiellement pas scientifiquement justifiée radioprotection stricte. Au cours des trois dernières décennies, de nombreux rapports ont documenté à la fois l&#39;absence de nuisibles et la présence d&#39;effets biologiques potentiellement bénéfiques induits par une faible dose rayonnement 1-4. Le principal facteur de risque pour la santé de rayonnement est la probabilité de cancer, estimé sur la base des études épidémiologiques des survivants de la bombe atomique recevant des doses élevées ou moyennes de rayonnement. Extrapolation linéaire de ces données (dites linéaire sans seuil ou modèle LNT) est utilisé pour estimer les risques de cancer à faibles doses. Cependant, cette approche n&#39;a pas reçu l&#39;acceptation scientifique mondialet est fortement débattue 5. Il est évident que d&#39;autres études sont nécessaires pour clarifier cette question et peut-être améliorer les normes de radioprotection. Ces études devraient impliquer des traitements chroniques (meilleur rapprochement des expositions environnementales et professionnelles), dans des modèles animaux in vivo (meilleure pour les effets pour la santé humaine) et en extrapolant ces points extrêmes que les taux de lésions de l&#39;ADN, réparation de l&#39;ADN et la mutagénèse. Il est connu que l&#39;ADN est la cible principale pour endommager les effets des rayonnements et incomplètes ou mal-réparation peut conduire à la mutagenèse et le développement du cancer 6. Cassures double-brin d&#39;ADN (ORD) sont l&#39;un des types les plus délétères de lésions de l&#39;ADN et peuvent conduire à la mort cellulaire et la tumorigenèse 7. Il est donc important de pouvoir mesurer de manière fiable et précise le niveau de l&#39;ORD après l&#39;exposition au rayonnement à faible dose et / ou d&#39;autres facteurs de stress, tels que les polluants chimiques. L&#39;un des marqueurs les plus sensibles et spécifiquesde l&#39;ADN DSB histone H2AX phosphorylée est appelé γH2AX 8, mais d&#39;autres marqueurs et procédés ont été suggérés 9,10. On estime que des milliers de molécules d&#39;H2AX, dans le voisinage d&#39;un ORD induite, sont impliqués dans la formation de γH2AX permettant la détection de l&#39;individu ORD par marquage immunofluorescent avec un anticorps et la microscopie à fluorescence anti-γH2AX 11. La réaction est très rapide, atteignant son maximum entre 30 et 60 min. Il existe des preuves que γH2AX facilite la réparation de l&#39;ADN de l&#39;ORD en attirant d&#39;autres facteurs de réparation des sites de pauses et en modifiant la structure de la chromatine pour ancrer extrémités d&#39;ADN cassées et fournir un accès à d&#39;autres protéines de réparation (12) examinés dans. À la fin de la réparation de l&#39;ADN de l&#39;ORD, γH2AX se dé-phosphorylée et / ou subit une dégradation, et des molécules d&#39;H2AX nouvellement synthétisées remplacer γH2AX dans les zones touchées de la chromatine 10. La formation et la perte de γH2AX surveillance peut,par conséquent, fournir une estimation précise de l&#39;ADN de l&#39;ORD cinétique de réparation. Cette approche a été utilisée pour étudier la réparation de l&#39;ORD dans diverses lignées cellulaires tumorales humaines irradiées avec des doses élevées de niveaux résiduels ORD rayonnement et son taux et ont été corrélée à la radiosensibilité 13-15. Nous avons modifié cette approche expérimentale et appliquée à une étude in vivo de la souris pour examiner les effets des faibles doses de γ- chronique et β-irradiation sur les niveaux d&#39;ADN de l&#39;ORD et la réparation (Figure 1). Tout d&#39;abord, nous démontrons une méthode pour effectuer une exposition chronique à long terme des souris à β-rayonnement soit émis par le tritium (hydrogène 3) sous la forme d&#39;eau tritiée (HTO) ou que le tritium lié organiquement (OBT) dissous dans l&#39;eau potable . Les deux formes sont attendus pour accumuler et / ou distribuer différemment dans le corps et, par conséquent, de produire différents effets biologiques. Les deux formes sont les dangers potentiels dans l&#39;industrie nucléaire. Ce traitementva de pair avec une exposition chronique à γ-rayonnement à un débit de dose équivalente pour permettre une comparaison correcte des deux types de rayonnement, qui est crucial pour l&#39;évaluation de leur efficacité biologique relative. Le bêta-rayonnement est constitué d&#39;électrons, ce qui rend très différente de la γ-rayonnement, les photons de haute énergie. En raison de cette différence, Β-rayonnement représente danger pour la santé essentiellement interne et peut produire des effets biologiques différents par rapport à γ-rayonnement. Cette complication a donné lieu à des controverses importantes sur la réglementation de l&#39;exposition à la β-rayonnement émis par HTO. Ainsi, les niveaux réglementaires de HTO dans l&#39;eau potable pour le public varient de 100 Bq / L en Europe à 75.000 Bq / L en Australie. Il est donc important de comparer les effets biologiques de HTO à des doses équivalentes de γ-irradiation. Deuxièmement, le taux de l&#39;ADN de l&#39;ORD est mesurée dans les splénocytes isolés lors de l&#39;achèvement des expositions chroniques à l&#39;aide immunofluorescence marqué γH2AX détectered par cytométrie de flux. Ceci permet l&#39;évaluation de l&#39;importance des dégâts infligés par les ADN exposition in vivo. Cependant, il est raisonnable de s&#39;attendre à ce que de telles expositions de bas niveau ne peuvent pas produire des taux détectables d&#39;ADN ORD; à la place, quelques changements cachés / réponses peuvent être attendus qui pourraient affecter la capacité des cellules à réparer les dommages de l&#39;ADN. Ces changements, si trouvé, peuvent être soit de stimulation (produisant un effet bénéfique) ou inhibiteur (produisant un effet délétère). Le protocole proposé permet de révéler de tels changements en contestant les splénocytes extraites avec une forte dose de rayonnement qui produit une quantité importante de dommages (par exemple, 2 Gy produisant environ 50 ADN ORD par cellule ou d&#39;un 3 -. Augmentation de 5 fois dans le niveau de γH2AX totale) . Par la suite, la formation et la perte de γH2AX, reflétant l&#39;initiation et l&#39;achèvement de la réparation DSB, est surveillée par cytométrie de flux. De cette façon, non seulement de base et des niveaux d&#39;ADN ORD induites par le traitement peuvent être mesurés, maisaussi son effet potentiel sur la capacité des cellules à répondre et les dommages de réparation de l&#39;ADN induite par des taux de stress beaucoup plus élevés.

<table><tbody><tr><td>HTO : eau tritiée, [3H]</td><td>obtenue localement à partir d’un réacteur nucléaire&nbsp ;</td><td></td><td>activité stock-stock 3,7 GBq/mL ;&nbsp ; peut être remplacé par du HTO de Perkin Elmer</td></tr><tr><td>OBT : Alanine, L-[3-3H] : tritium organiquement lié (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET348005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT : Glycine, [2-3H] : tritium organiquement</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET004005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>OBT : Proline, L-[2,3-3H] : tritium organiquement lié (OBT)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET323005MC</td><td>1 mCi/ml (185 MBq)</td></tr><tr><td>d’eau tritiée, [3H] (HTO)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET001B005MC</td><td>substitut du HTO d’origine locale&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>L’irradiateur GammaBeam 150</td><td>d’Énergie atomique du Canada limitée</td>, <td>fabriqué localement</td><td>, peut être remplacé par une autre source de rayonnement g d’activité suffisamment faible.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td>Hyclone RPMI 1640 avec L-Glutamine et HEPES 500mL</td></tr> sérum <tr><td>fœtal bovin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1051-100ML</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-gH2AX, clone JBW301</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 chèvre anti-souris Anticorps</td> Life <td>Technologies (anciennement Invitrogen)</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>propidium iode</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>éthanol</td><td>Alcools commerciaux</td><td>P006-EAAN</td><td>Bouteilles de 500 ml Éthanol absolu</td></tr><tr><td>Tubes de 1,5 ml Tubes</td> de <td>microcentrifugation</td><td>Fisher Scientific</td><td>2682550</td></tr><tr><td>de 15 ml Tubes de 15 ml Tubes</td><td>à centrifuger stériles en polypropylène</td> <td>Fisher Scientific</td><td>05-539-5</td></tr><tr><td>azote liquide</td><td>Linde</td><td>P110403</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm tubes en verre non bouchés</td> Fisher <td>Scientific</td><td>K60B1496126</td><td>tubes jetables en verre borosilicaté avec bout lisse</td></tr><tr><td>Fioles T25 VWR</td><td></td><td>CA15708-120</td><td>nunc tisue culture 25ml flacon (fournisseur n° 156340)</td></tr><tr><td>ciseaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>14068-12</td><td>ciseaux Wagner 12 cm pince tranchante/</td></tr><tr><td>tranchante, </td><td>Fine Science Tools</td><td>droit 11008-13</td><td>Pince Semken 13 cm,</td></tr><tr><td>pince droite, courbe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-12</td><td>Pince à motif étroit 12 cm,</td></tr><tr><td>bombe de Pétri 60 mm</td><td>VWR</td><td>CA25382-100</td><td>BD Falcon Boîte de culture tissulaire 60 filtres à cellules de 15 mm</td></tr><tr><td>, 70 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Filtres à cellules Falcon 50/caisse</td></tr><tr><td>Recette PBS : 1 comprimé dissous dans 200 ml d’eau déminéralisée, ajuster le pH à 7,4 si nécessaire.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td>Comprimés salins tamponnés au phosphate</td></tr><tr><td>Recette TBS : pour faire 10x stock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 g TRIS HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3253-1KG</td><td>Chlorhydrate de Trizma</td></tr><tr><td>88 g NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Chlorure de sodium</td></tr><tr><td>2 g KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Chlorure</td></tr> <tr><td>de potassiumDissoudre dans 1 L d’eau déminéralisée, ajuster le pH à 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de dommages et réparation de l&#39;adn dans les splénocytes de souris après chronique<em&gt; in vivo</em&gt; l&#39;exposition à de très faibles doses de bêta et gamma rayonnement

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

L&#39;exposition aux rayonnements à faible dose peut produire une variété d&#39;effets biologiques qui sont différentes en quantité et de la qualité des effets produits par de fortes doses de rayonnement. Aborder les questions relatives à la sécurité de la santé environnementale, professionnelle et publique d&#39;une manière appropriée et justifiée scientifiquement repose largement sur la capacité de mesurer avec précision les effets biologiques des polluants à faible dose, tels que des substances chimiques et des rayonnements ionisants. dommages à l&#39;ADN et la réparation sont les plus importants indicateurs précoces de risques pour la santé en raison de leurs conséquences à long terme potentiels, tels que le cancer. Ici, nous décrivons un protocole pour étudier l&#39;effet de l&#39;exposition in vivo chronique à de faibles doses de γ- et β-rayonnement sur ​​les dommages de l&#39;ADN et la réparation dans les cellules de rate de souris. En utilisant un marqueur couramment acceptée de cassures de l&#39;ADN double-brin, phosphorylée H2AX histone appelé γH2AX, nous démontrons comment il peut être utilisé pour évaluer non seulement les niveaux de dommages à l&#39;ADN, mais change ausside la capacité de réparation de l&#39;ADN potentiellement produite par une faible dose de l&#39;exposition in vivo. La cytométrie en flux permet une mesure rapide, précise et fiable des immunofluorescence marqué γH2AX dans un grand nombre d&#39;échantillons. ADN double-brin de réparation des cassures peut être évaluée en exposant splénocytes extraites à une dose stimulante de 2 Gy pour produire un nombre suffisant de cassures de l&#39;ADN pour déclencher la réparation et en mesurant l&#39;induit (1 h post-irradiation) et les dommages de l&#39;ADN résiduel (24 heures post-irradiation). Lésions de l&#39;ADN résiduel serait indicative de réparation incomplète et le risque d&#39;instabilité génomique à long terme et le cancer. Combiné avec d&#39;autres analyses et points d&#39;extrémité qui peuvent être facilement mesurés dans cette étude in vivo (par exemple, des aberrations chromosomiques, des fréquences de micronoyaux dans les réticulocytes de la moelle osseuse, l&#39;expression des gènes, etc.), cette approche permet une évaluation précise et contextuelle des effets biologiques de facteurs de stress de bas niveau.

La figure 2 montre des exemples de cytométrie de flux graphiques attendues pour splénocytes préparés en utilisant le procédé décrit ici. Les cellules sont d&#39;abord déclenchés sur la base du &lt;électronique scatter volume côté&gt; nuage de points (figure 2A et 2D; volume électronique est équivalente à diffusion vers l&#39;avant). FL3 / propidium histogrammes iode (Figure 2B et 2E) confirment la distribution du cycle cellulaire normal...

Un protocole pour évaluer les changements dans les niveaux de dommages à l’ADN et la capacité de réparation de l’ADN qui peuvent être induits par l’irradiation chronique in vivo à faible dose dans les lymphocytes de la rate de souris, en mesurant l’histone phosphorylée H2AX, un marqueur des cassures double brin de l’ADN, à l’aide de la cytométrie en flux est présenté.

Mesure de dommages et réparation de l&#39;ADN dans les splénocytes de souris Après chronique<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;exposition à de très faibles doses de bêta et gamma Rayonnement

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de mesurer les lésions de l'ADN et leur réparation induites dans les cellules de la rate de souris par une exposition chronique in vivo à de faibles doses de rayonnement bêta ou gamma. Pour ce faire, on expose d'abord les souris à une irradiation bêta interne ou gamma externe afin de provoquer d'éventuelles modifications des lésions de l'ADN et de leur réparation. Dans un deuxième temps, les PLE cytes sont isolés et irradiés avec une forte dose de défi de rayonnement gamma induisant des lésions de l'ADN détectables, ce qui permet de suivre la réparation de l'ADN.Au fil du temps, les cellules spléniques sont ensuite marquées immunologiquement de manière fluorescente contre la γH2AX afin de permettre la quantification des dommages de l'ADN. En fin de compte, les dommages de l'ADN provoqués par des doses de rayonnement gamma aigu aussi faibles que 10 centigray peuvent être mesurés par cytométrie en flux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la radioprotection, telles que : les faibles doses de rayonnement généralement rencontrées dans des contextes professionnels, médicaux ou publics augmentent-elle

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Apprenez à mesurer les dommages et la réparation de l'ADN dans les splénocytes de souris après exposition chronique à de faibles doses de rayonnement bêta et gamma par cytométrie en flux.

Mesure de dommages et réparation de lADN dans les splénocytes de souris Après chronique In Vivo Lexposition à de très faibles doses de bêta et gamma Rayonnement (Vidéo) | JoVE Journal

Mesure de dommages et réparation de l'ADN dans les splénocytes de souris Après chronique

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