Mesure de dommages et réparation de l'ADN dans les splénocytes de souris Après chronique In Vivo L'exposition à de très faibles doses de bêta et gamma Rayonnement

Un protocole pour évaluer les changements dans les niveaux de dommages à l’ADN et la capacité de réparation de l’ADN qui peuvent être induits par l’irradiation chronique in vivo à faible dose dans les lymphocytes de la rate de souris, en mesurant l’histone phosphorylée H2AX, un marqueur des cassures double brin de l’ADN, à l’aide de la cytométrie en flux est présenté.

L’objectif général de l’expérience suivante est de mesurer les dommages et la réparation de l’ADN induits dans les cellules de la rate de souris par une exposition chronique in vivo à de faibles doses de rayonnement bêta ou gamma. Ceci est réalisé en exposant d’abord les souris à une irradiation bêta interne ou gamma externe pour déclencher des changements potentiels dans les dommages et la réparation de l’ADN. Dans un deuxième temps, les cytes PLE sont isolés et irradiés avec une dose élevée de rayonnement gamma induisant des dommages détectables à l’ADN pour permettre la surveillance de la réparation de l’ADN.

Au fil du temps, les cellules de la rate sont ensuite immunomarquées par fluorescence contre gamma H deux A x pour permettre la quantification des dommages à l’ADN. En fin de compte, les dommages à l’ADN produits par des doses de rayonnement gamma aigu aussi faibles que 10 degrés centigrades peuvent être mesurés par cytométrie en flux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la radioprotection, telles que les faibles doses de rayonnement généralement rencontrées dans un cadre professionnel, médical ou public augmentent-elles réellement la probabilité d’effets néfastes sur la santé tels que le cancer ?

Les principaux avantages de notre technique par rapport aux méthodes existantes telles que le comptage des foyers gamma H deux A X à l’aide de la microscopie immunofluorescente sont que notre technique nécessite beaucoup moins de temps pour l’analyse, ce qui la rend adaptée aux études animales à grande échelle, et elle réduit le biais lié à l’opérateur dans la quantification gamma H deux A X. Les implications de cette technique s’étendent à la personnalisation de la médecine et de la radiothérapie du cancer et à la possibilité de déterminer les radiosensibilités individuelles des patients à l’aide des lymphocytes du sang périphérique pour ajuster le schéma posologique de la radiothérapie du patient. Bien que cette méthode donne un aperçu de la toxicité des rayonnements, elle peut également être appliquée à d’autres études telles que l’étude de la toxicité des polluants chimiques environnementaux ou les mécanismes fondamentaux de la formation et de la réparation des dommages à l’ADN chez la souris in vivo.

Pour l’irradiation bêta interne, traiter les animaux pendant un mois par AD libitum accès à de l’eau de tritium pour l’irradiation gamma externe. Placez toute la cage de souris à la distance appropriée d’une source de rayonnement gamma pour correspondre au débit de dose de l’exposition au tritium. Initier et maintenir l’exposition pendant un mois.

Utilisez des dosimètres à thermoluminescence pour mesurer les doses totales d’absorption à la fin de l’exposition. Le jour du prélèvement de la rate, placez une passoire cellulaire à l’intérieur d’une petite boîte de Pétri vide par animal et ajoutez cinq millilitres de milieu RPMI dans chaque boîte. Ensuite, placez une souris euthanasiée en position couchée et vaporisez les poils avec de l’éthanol à 70 % lorsque l’animal a été complètement trempé.

À l’aide d’une pince, saisissez la peau en avant de l’ouverture urétrale et faites une petite incision dans la région périnéale à partir de cette incision. Coupez le long de la ligne médiane ventrale jusqu’à la cavité thoracique, en prenant soin de ne couper que la peau et non la paroi musculaire en dessous. Disséquez la peau en l’éloignant de la ligne médiane.

Puis saisir la paroi abdominale avec des pinces. Coupez le long de l’accès médian du muscle pour ouvrir la cavité abdominale. Localisez la rate et saisissez-la légèrement avec une pince stérile.

Ensuite, tirez doucement sur le tissu tout en jurant simultanément sur le tissu conjonctif. Retirer environ un dixième de la rate pour les analyses en aval. Transférez ensuite le reste du tissu dans l’une des passoires cellulaires jusqu’à deux heures après que toutes les rates ont été prélevées.

Utilisez des pinces incurvées stériles pour hacher chacun des tissus à l’intérieur de leurs passoires cellulaires individuelles. Lorsque les rates ont été suffisamment homogénéisées, retirez les crépines et transférez la suspension cellulaire filtrée dans des tubes de 15 millilitres. Rincez chacune des passoires avec cinq millilitres supplémentaires de fluide, en tirant les lavages avec le reste des suspensions cellulaires et centrifugez les cellules deux fois Resus, en suspendant les granulés dans 10 millilitres de RPMI frais chacun après le premier essorage.

Après le deuxième tour. Remettre les granulés en suspension dans cinq millilitres de RPMI et transférer quatre millilitres des suspensions cellulaires résultantes dans des flacons de culture tissulaire de 25 millilitres pour une incubation à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec 80 % d’humidité. Transférez le reste des suspensions de cellules dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre et des cellules de centrifugation de quatre degrés Celsius.

À l’aide d’une pompe à vide, aspirez soigneusement les surnageants et remettez doucement les granulés en suspension dans un millilitre de tampon TBS et faites tourner à nouveau les cellules après avoir aspiré à nouveau le supinate. Reese suspend les granulés dans 300 microlitres de TBS chacun. Puis, tout en vortex à basse vitesse, à 700 microlitres de moins 20 degrés Celsius, 100 % d’éthanol dans chaque tube.

Retournez les tubes plusieurs fois pour mélanger davantage. Conservez ensuite les échantillons à moins 20 degrés Celsius pendant 12 mois maximum. Pour induire des cassures double brin de l’ADN pour défier la machinerie de réparation.

Culture d’irradiateur avec deux gris de rayonnement gamma à un débit de dose égal ou inférieur à 200 mini gras par minute. Immédiatement après le défi, retournez la culture dans l’incubateur de CO2. Une heure plus tard, transférez la culture irradiée dans une enceinte de sécurité biologique et utilisez une pipette pour remettre doucement les cellules en suspension.

Transférez un millilitre de la suspension cellulaire résultante dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace, puis faites tourner les cellules. Utilisez la pompe à vide pour aspirer soigneusement le supinate, puis réanimez doucement les granulés en suspension dans un millilitre de TBS. Ensuite, après un deuxième lavage au TBS, fixez les cellules dans de l’éthanol comme nous venons de le démontrer pour un stockage à moins 20 degrés Celsius pour l’analyse immunofluorescente des cellules.

Tout d’abord, ajoutez 0,5 millilitre de TBS glacé dans les tubes d’échantillon appropriés. L’aliquote vortex suivante Eloqua, un fixe de moins 20 degrés Celsius a stocké les cytes SPL pendant cinq secondes. Ensuite, transférez 0,5 millilitre de cellules dans les tubes appropriés et faites-les tourner doucement, remettez doucement les granulés en suspension dans un millilitre de TBS glacé contenant 1 % de FBS et de cellules centrifuges.

Encore une fois, incubez les échantillons dans un millilitre de tampon TST par tube sur de la glace pendant 20 minutes. Après avoir fait tourner les cellules, à nouveau, mettez les granulés en suspension dans 200 microlitres d’anticorps primaires anti gamma H deux ax. Positionnez ensuite le tube sur un agitateur rotatif à un angle de 45 à 60 degrés pendant 1,5 heure à 300 fois G et à température ambiante à la fin de l’incubation.

Lavez les échantillons deux fois dans un millilitre de TBS glacé contenant 2 % de FBS. Ensuite, mettez les granulés en suspension dans 200 microlitres d’anticorps secondaires fraîchement préparés sur la plate-forme d’agitation. Après une heure, laver les cellules dans un millilitre de glace appelée TBS contenant 1 % FBS, suivi d’un lavage dans un millilitre de glace appelé TBS seul.

Enfin, remettre en suspension les pastilles dans 0,5 millilitre de TBS contenant de l’iodure de PROPIDIUM Dans ces graphiques, des résultats cytométriques en flux représentatifs sont présentés Les cellules ont d’abord été contrôlées en fonction de leur côté volume électronique. La coloration à l’iode de propidium par diffusion a confirmé que les échantillons de contrôle et de provocation par rayonnement présentaient une distribution normale du cycle cellulaire. Alors que la mesure du signal gamma H deux ax a démontré une augmentation plus de deux fois de la cassure double brin de l’ADN dans les deux cellules grises irradiées par rapport aux témoins non traités ici, les niveaux relatifs de gamma H deux AX dans les cytes de souris, une heure après l’exposition ex vivo à des doses faibles ou élevées de rayonnement gamma, sont montrés comme prévu.

Une forte induction triple de cassures double brin a été détectée après le défi à deux gris. Une augmentation légère mais statistiquement significative a été observée après l’exposition à 0,1 gray, ce qui indique une sensibilité suffisante de la méthode. Le motif de fluorescence marqué en forme de foyer observé par la microscopie indique que le signal provient de l’ADN individuel : des cassures double brin dans la chromatine CH, validant la spécificité de la coloration.

Ici, le niveau de cassures double brin de l’ADN présenté par les cytes PLE récoltés sur des souris exposées à un mois d’eau tritiée est montré. Bien que le traitement ait entraîné une augmentation de 10 % du niveau basal gamma H deux A X, le changement n’était pas statistiquement significatif. De plus, aucune différence dans la formation mesurée et la perte de gamma H deux axes.

Après le défi représentant la cinétique de l’ADN, la réparation des freins double brin a été observée entre les cellules des souris traitées à l’eau tritiée et le contrôle. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de respecter les règles et règlements établis par votre association locale de radioprotection et d’utiliser un laboratoire ou une installation certifiée où des projets de souris à grande échelle peuvent être réalisés en utilisant des sources de rayonnement internes et externes. Une fois maîtrisées, ces techniques ne nécessitent qu’environ un jour et demi par 10 souris si elles sont correctement exécutées.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser l’analyse cytométrique en flux de l’expression de Gamma H deux A X pour mesurer les cassures et la réparation des brins de doublet d’ADN induites in vivo par l’exposition à de faibles doses de tritium ou de rayonnement gamma. En plus de cette procédure, d’autres méthodes telles que M FISH dans les lymphocytes sanguins, le dosage du micronoyau de la moelle osseuse et le R-T-Q-P-C-R pour mesurer l’expression des gènes de réponse au stress peuvent être utilisées pour évaluer les risques pour la santé associés à l’exposition à de faibles doses de rayonnement.