Visualisation des chondrocytes intercalation et directionnel prolifération clonale via Zebrabow analyse cellulaire dans le cartilage de l'embryonnaire Meckel

L’objectif général de l’expérience suivante est de visualiser l’interconnexion et l’extension des chondrocytes via l’analyse de cellules clonales en arc zébré. Ceci est réalisé en générant une ligne M SOX 10 ERT deux arcs zébrés cris pour réaliser une recombinaison spécifique des tissus dans le cartilage crânien, le visage et les embryons pour l’analyse clonale. Ensuite, les embryons sont pulsés avec du tamoxifène au stade 10, donc au stade d’acarien pendant trois heures afin d’induire le processus de recombinaison.

Ensuite, les embryons sont sélectionnés pour l’expression de l’activité CRE et de l’expression fluorescente rouge fort ou RFP, et les embryons sont montés pour l’imagerie du cartilage craniofacial C. Les résultats montrent une analyse cellulaire multispectrale des chondrocytes crânio-faciaux basée sur l’imagerie confocale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme le S dans la coloration bleue ou les lignées transgéniques telles que so et GFP ou SOX et kde, est que l’arc zébré nous permet d’observer et de suivre spécifiquement les populations de cellules clonales impliquées dans la formation d’un organe.

Pour vous préparer à la collecte d’embryons le premier jour, installez plusieurs paires mâles et femelles de sox, 10 ERT deux poissons zèbres transgéniques Cris M dans des bassins d’accouplement divisés entre cinq et 18h00 le lendemain après avoir vérifié au microscope optique que les embryons ont atteint le stade 10 de cellulite sous un microscope fluorescent avec un filtre RFP. Isolez les embryons rouge vif et transférez-les dans une nouvelle boîte de Pétri avec du milieu E trois frais pour induire la recombinaison Cree. Ajoutez une solution d’hydroxytamoxifène de 10 micromolaires dans la boîte de Pétri et incubez les embryons à 28,5 degrés Celsius pendant trois heures.

Ensuite, décantez la solution de tamoxifène dans un récipient à déchets biologiques et utilisez E trois pour laver les embryons plusieurs fois après avoir incubé les embryons pendant la nuit jusqu’au 28 à 29, donc au stade d’acariens, transférez les embryons dans une solution de PTU E trois et retournez-les dans l’incubateur. Pour visualiser les structures craniofaciales C complètement développées, sélectionnez des embryons à quatre DPF avec un signal rouge intense et une expression Cree jaune dans la rétine. Après avoir anesthésié un embryon dans Trica, selon le protocole textuel, transférez-le dans une boîte de Pétri contenant une goutte de méthylcellulose sur une lame confocale propre.

Déposez une goutte de Méthylcellulose fraîche et utilisez un embout de micro chargeur pour monter l’embryon positionné dorsalement tout en prenant soin de ne pas le toucher directement avec une lamelle de 25 par 25. Couvrez l’embryon et utilisez la lamelle pour manipuler l’embryon si nécessaire. Pour imager l’embryon, utilisez un objectif à lentille sèche 20x.

Pour faire la mise au point sur le sujet, appuyez sur la touche L 100 du microscope, puis sélectionnez la touche de configuration confocale. Cliquez sur auto et sélectionnez l’appel d’offres pour le premier canal, le GFP pour le deuxième canal et l’appel d’offres ou la marchandise M pour le troisième canal. Fermez ensuite la fenêtre.

Activez les canaux deux et trois avant de cliquer sur le bouton de suppression du verrouillage. Cliquez ensuite sur play pour commencer l’analyse. Après avoir ajusté les paramètres, capturez les images souhaitées et enregistrez-les au format logiciel confocal ainsi qu’au format TIF pour le traitement d’image par canal.

Pour effectuer l’imagerie CFP, désactivez les canaux deux et trois et activez le canal un sans modifier la zone de mise au point. Réajustez les paramètres de numérisation avant de capturer des images, enregistrez les images comme décrit ci-dessus et effectuez le traitement d’image comme décrit par le panoramique et ses collègues, comme illustré ici. La visualisation traditionnelle du cartilage par coloration bleue de l’ensemble du mont Sian a été inestimable pour observer le cartilage de mekel en développement et couramment utilisée pour visualiser l’organisation cellulaire finale afin d’analyser plus en détail les chondrocytes en développement au fil du temps.

L’utilisation de lignées transgéniques SOX 10 kda a été utilisée pour étudier la migration, la convergence et l’extension cellulaires chez les embryons vivants en utilisant l’imagerie en direct de la lignée transgénique zebra bow m. Pour étudier plus en détail l’organisation des chondrocytes dans la structure squelettique craniofaciale C, on révèle le processus d’interconnexion et d’allongement des chondrocytes qui médie l’extension et la croissance du cartilage de Meckel. Cette figure montre la mâchoire inférieure de l’arc zèbre UI M Sox 10 ERT, deux embryons transgéniques Cris entre 3D PF et cinq jours après la fécondation.

La mâchoire inférieure est mieux représentée ventralement pour permettre une vue claire de l’organisation cellulaire dans le cartilage du mélès, comme illustré ici. Les couleurs stables et héritées permettent un traçage facile de la lignée et une cartographie du destin cellulaire de la crête neurale crânienne. La cellule bleue unique semble migrer et s’interpoler avec ses cellules voisines, puis s’allonge le long de l’axe antérieur postérieur pour former un site chondra de forme uniforme, conservant ainsi la forme globale du cartilage de la mèle lorsqu’il s’étend vers l’avant.

Cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine du développement du chat pour examiner le chondro dans la formation squelettique du poisson-zèbre.