Name: Production de Nurr-1 anticorps polyclonaux spécifiques gratuit de réactivité croisée contre son étroite homologues, Nor1 et Nur77 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Découvrez comment produire des anticorps polyclonaux Nurr-1 spécifiques sans réactivité croisée contre Nor1 et Nur77. Cette méthode d'ingénierie des anticorps améliore la spécificité pour l'immunologie.

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Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH (NS070577 et NS084869).

Remarque: La composition de toutes les solutions citées ci-dessous peut être trouvé dans le tableau Matériaux / Équipement. 1. Protéine A Colonne Antibody Purification <ol><li> Equilibrer une colonne de protéine de spin et de tous les tampons nécessaires à la température ambiante pendant 15 minutes avant de commencer la procédure. </li><li> Diluer le sérum immun 1: 1 avec de l&#39;IgG de la protéine A Binding Buffer. (5 ml de sérum est recommandé). </li><li> Tapoter doucement une colonne de protéine de spin sur la paillasse pour déloger toute résine qui peut être logé dans le capuchon. Retirez le couvercle supérieur et enclenchez doucement la fermeture de fond. Placer la colonne dans un tube collecteur de 15 ml et laisser la solution de stockage se vider. </li><li> Ajouter 5 ml de protéine A IgG Binding Buffer et laissez la solution se vider. </li><li> Appliquer le sérum immun dilué dans la colonne et recueillir l&#39;écoulement. Pour de meilleurs résultats, ajouter un volume d&#39;échantillon qui contient une concentration d&#39;anticorps inférieure à 80% d&#39;anticorps se liant à la capacit de la colonney. </li><li> Laver la colonne avec 15 ml de protéine A ou IgG Binding Buffer jusqu&#39;à ce que l&#39;absorbance à 280 nm est inférieur à 0,1. </li><li> Ajouter 100 pi de tampon de neutralisation à cinq tubes de prélèvement étiquetés. </li><li> Ajouter 5 ml de tampon d&#39;élution d&#39;IgG de la protéine A et la colonne recueillir fractions de 1 ml dans chacun des tubes contenant 100 pi de tampon de neutralisation. </li><li> Mesurer l&#39;absorption de chaque fraction à 280 nm et des fractions piscine avec une absorbance supérieure à 0,5. Gardez les fractions regroupées sur la glace jusqu&#39;à ce que prêt pour la dialyse. </li><li> Régénérer la colonne en ajoutant 8 ml d&#39;IgG tampon d&#39;élution et laissez la solution de circuler à travers la colonne. </li><li> Rincer la colonne avec une solution Binding Protein A jusqu&#39;à ce que les IgG éluant pH revient à 7.4. </li><li> Stocker la colonne par addition de 5 ml de solution de stockage (azoture de sodium à 0,02% dans du PBS). Lorsque environ 3 ml restent dans la colonne, bouchon de fond et de sécuriser le capuchon supérieur. Rangez la colonne à 4 ° C. </li><li> Déterminer la longueur oun tube de dialyse f nécessaire selon les instructions du fabricant. Utilisation de 16 mm de diamètre de tube plat utiliser 5,47 cm de longueur de tube par ml de solution à dialyse. Couper le tube et rincer avec du PBS pH 7,4 pendant 15 à 30 min. </li><li> Pliez et coupez une extrémité du tube de dialyse, transférer l&#39;IgG commun fractions contenant un tube de dialyse équilibrées dans PBS pH 7,4 et fermer l&#39;autre extrémité. </li><li> Dialyser à température ambiante contre 200 volumes de PBS, pH 7,4 pendant 2 heures. </li><li> Changez le tampon de dialyse (PBS fraîche pH 7,4) et dialyse pendant 2 h à température ambiante. </li><li> Changez le tampon de dialyse (PBS fraîche pH 7,4) et dialyse pendant la nuit à 4 ° C. </li><li> Conserver la solution d&#39;anticorps dialysée à 4 ° C jusqu&#39;au moment de procéder à d&#39;autres étapes de purification. </li><li> Évaluer la concentration d&#39;anticorps en utilisant son absorption à 280 nm et le coefficient d&#39;absorption molaire d&#39;anticorps à 280 nm de 210 000 M -1 cm -1 12. </li></ol> 2. Couplage de protéines LBD de couplage Aminolink Résine <ol><li> Préparer deux colonnes, l&#39;une pour l&#39;autre et Nor1 pour Nur77. Suivez le même protocole pour les deux protéines. </li><li> Décongeler la protéine à être couplé à la résine sur de la glace. Déterminer la concentration en protéine en utilisant le coefficient d&#39;extinction molaire et son absorbance à 280 nm 12. <ol><li> En variante, en utilisant un essai de détermination de protéine tel que le dosage de l&#39;acide bicinchoninique 13. Si la protéine est dissoute dans un tampon Dialyser ou tampon contenant une amine échange contre le tampon de couplage. Si la protéine est dans un tampon approprié (pas d&#39;amines libres) diluer 4 fois en tampon de couplage. </li></ol></li><li> Utiliser 2 ml de résine pour 2 mg de protéine. Toutes les étapes qui suivent sont fournies à résine de 2 ml dans une colonne de 10 ml. Jusqu&#39;à 10 mg de protéine peut être lié par 1 ml de résine (2 ml de 1: une suspension). </li><li> Préparer une colonne de 10 ml d&#39;une fritte en le poussant vers le bas et l&#39;exécution du PBS pH 7,4 à travers elle. Cap til fond de la colonne et ajouter 2 ml de tampon de couplage. </li><li> Ajouter le volume désiré de suspension (4 ml d&#39;obtenir 2 ml de résine) à la colonne, retirez le bouchon de fond et laisser le drain de la colonne. Rincer la colonne avec un total de 6 ml (volume 3) résine-lit de tampon de couplage et de laisser la colonne se vider. Après le tampon de couplage a drainé, remplacer le bouchon de fond. </li><li> Ajouter 2-4 ml de protéine en suspension dans de couplage de tampon à la colonne (conserver une partie aliquote de la solution de protéine afin d&#39;évaluer l&#39;efficacité de couplage par comparaison de la concentration en protéine de l&#39;éluat de l&#39;étape 2.11 en utilisant soit l&#39;absorbance à 280 nm ou le dosage bicinchoninique) . Cap et à la fin sur l&#39;extrémité mélanger pour avoir une solution homogène. </li><li> Peser un 1,8 ml microtube vide et passer à la hotte. Soigneusement transférer NaCNBH3 (environ 0,05 g) dans le tube pré-pesé. Fermer le tube et peser le tube contenant NaCNBH3. Ne pas ouvrir le tube extérieur de la hotte. </li><li> Sur la base du poids deNaCNBH3 transféré dans le tube, préparer une solution 5 M par addition de 1 M de NaOH. Le poids moléculaire du NaCNBH3 est 62,84 g donc 0,05 g est égal à (0,05 / 62,84 = 7,96 x 10 -4 mole) 7,96 x 10 -4 moles. Pour obtenir une solution add 5 M (7,96 x 10 -4 / 5) 159 pl de 1 M NaOH. </li><li> Mesurer le volume total de la réaction qui a le volume de résine en considération. Ajouter 10 pi de 5 M NaCNBH3 par ml de réaction. <ol><li> Par exemple: pour un volume de réaction de 4 ml ajouter 40 pi de 5 M NaCNBH3. Pour 1 ml de résine et 3 ml de protéine ajoutée, le volume total est de 4 ml. </li></ol></li><li> Cap de la colonne et à la fin mélanger plus fin. Fixer la colonne sur un agitateur de tube et laisser la réaction continuer pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Dans la matinée, porter la colonne à la hotte chimique et soigneusement enlever le bouchon comme certains gaz peut s&#39;être formée. Égoutter la colonne dans un tube propre et économiser l&#39;éluat pour mesurer la protéine concentration en utilisant l&#39;absorbance à 280 nm de 12 procédé ou le dosage de l&#39;acide bicinchoninique et le comparer avec la concentration de protéine de départ dans l&#39;étape 2.6. </li><li> Laver la résine avec 4 ml de tampon de couplage et de laisser le drain de la colonne. </li></ol> 3. Blocage sites restants <ol><li> Laver la résine avec 4 ml de tampon de trempe. Égoutter et remettre le bouchon en bas. Ajouter 2 ml de tampon de trempe et suspendre la résine. </li><li> Évaluer le volume total de réaction en mesurant le volume de la résine et le volume de tampon de trempe, puis ajouter 10 ul de 5 M NaCNBH3 par ml de volume réactionnel. </li><li> Mélanger délicatement à la température ambiante pendant 30 min fin sur la fin. Après 30 minutes, amener la colonne dans la hotte. Retirez délicatement le haut, puis retirez le bouchon de fond et laisser l&#39;évacuation de la colonne dans un tube de déchets. </li><li> Laver la colonne avec 5 volumes de résine de la solution de lavage. Surveiller les lavages de la présence de protéines résiduelles en mesurant la abso de l&#39;éluatrbance à 280 nm. Protéines non couplées sont lavés par la forte concentration en sel. </li><li> Laver la résine avec 6 ml de PBS dégazé pH 7,4 contenant de l&#39;azoture de sodium à 0,02%. Garder la colonne à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 4. Purification de l&#39;anticorps spécifiques NURR1 <ol><li> Rincer la colonne couplé Nur77 LBD avec 10 ml de PBS pH 7,4 et laisser l&#39;évacuation de la colonne. Boucher le bas de la colonne et placer la colonne couplé Nur77 LBD drainé dans un nouveau tube de 15 ml de collecte. </li><li> Ajouter 5 ml de la protéine A des anticorps anti-NURR1 purifiés, plafonner la colonne et le placer sur un rotateur à 4 ° C pendant 1 heure. Retirez les capuchons supérieurs et inférieurs et de recueillir l&#39;écoulement à travers. Mettez de côté sur la glace jusqu&#39;à ce que prêt à ajouter à la colonne couplé Nor1 LBD. </li><li> Rincer la colonne couplé Nor1 LBD avec 10 ml de PBS pH 7,4 et laisser l&#39;évacuation de la colonne. Boucher le bas de la colonne et placer la colonne Nor1 LBD couplé à un tube de 15 ml de collecte. </li><li> Ajouter le flux à travers du coup Nur77 LBDcolonne conduite, plafonner la colonne et le placer sur un rotateur à 4 ° C pendant 1 heure. Retirez les capuchons supérieurs et inférieurs et de recueillir l&#39;écoulement à travers. </li><li> Mesurer la concentration d&#39;anticorps en mesurant l&#39;absorbance à 280 nm. </li></ol> Analyse des purifiée d&#39;anticorps anti-Nurr1 à base d&#39;ELISA 5. <ol><li> Ajouter 100 ul de protéine (2,5 pg / ml) dans les puits d&#39;une plaque à 96 puits. Si l&#39;essai 3 protéines différentes, ajouter 100 ul de protéines 1 à godets A1 à H4, 100 pi de la protéine 2, à godets A5 à H8 et 100 pi de la protéine 3 à puits A9 à H12. Couvrir la plaque et incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver deux fois les puits revêtus avec 300 pi par puits de PBS pH 7,4 et ajouter 300 ul de tampon de blocage ELISA pour les antigènes des puits revêtus entiers et incuber 2 heures à température ambiante. </li><li> Bien que la plaque bloque préparer une dilution de départ désirée de l&#39;anticorps purifié anti-Nurr1 (allant de 10 à 100 pg / ml) dans du tampon de blocage ELISA. </li><li> Après 2 h de blocage, remplacer le tampon de bloc ELISA avec 100 pi de tampon frais de bloc ELISA à tous les puits. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;anticorps anti-Nurr1 purifié dilué dans tous les puits dans la ligne A. diluer en série les anticorps en transférant 100 ul de solution de la ligne A dans les puits de la rangée B suivie par le transfert de 100 pi de solution de la ligne B à la ligne C continue jusqu&#39;à la ligne G. Après le mélange des solutions dans les puits dans la rangée G jeter le supplément de 100 pi. Wells dans la rangée H ne reçoivent les premiers 100 pi de tampon de blocage. Incuber à température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Laver la plaque trois (3) fois avec 300 pi par puits de 0,05% de Tween 20 dans du PBS pH 7,4 et épongez la plaque pour éliminer le tampon de lavage en excès. </li><li> Ajouter 100 pi de la peroxydase de raifort (HRP) conjugué de chèvre anti-IgG de lapin dilué dans du tampon de bloc ELISA (1: 8000 dilution; la gamme typique est de 1: 5000 à 1: 25.000). Incuber à température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Laver les e plaqueree (3) fois comme décrit en 5.6. Rincez tous les puits en les remplissant avec 300 pi d&#39;eau déminéralisée. Éponger l&#39;excès d&#39;eau en inversant la plaque sur du papier absorbant. </li><li> Ajouter 100 ul de 3, 3 &#39;, 5, 5&#39; tétraméthylbenzidine (réchauffé à température ambiante) à tous les puits et incuber 15 à 30 min à l&#39;obscurité à température ambiante. </li><li> Arrêter la réaction en ajoutant 50 ul de 2 NH 2 SO 4. </li><li> Lire l&#39;absorbance à 450 nm soustraction du fond à 650 nm. </li></ol>

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<li>Xiao, Q., Castillo, S. O., Nikodem, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+messenger+RNAs+for+the+orphan+nuclear+receptors+Nurr1+and+Nur77+%28NGFI-B%29+in+adult+rat+brain+using+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distribution of messenger RNAs for the orphan nuclear receptors Nurr1 and Nur77 (NGFI-B) in adult rat brain using in situ hybridization.</a> Neuroscience. 75 (1), 221-230 (1996).</li>
</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Le succès de ce protocole repose sur la disponibilité de protéines pures pour la caractérisation des anticorps dirigés contre un membre spécifique de la famille de la protéine d&#39;intérêt. Il n&#39;y a aucune nécessité de purifier les anticorps à l&#39;aide de protéine A / G jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit clairement établi qu&#39;il existe des réactivités croisées significatives par ELISA et Western blot. Comme il est indiqué dans le texte, il est important d&#39;éviter la suspension de la ...

Le facteur de transcription Nurr1 et ses homologues (Nur77 et NOR1) appartiennent à la sous-famille des récepteurs nucléaires 4A (NR4A) 1. Ils sont également des récepteurs orphelins parce que leurs ligands endogènes ne sont pas encore identifiés. Nurr1 a été cloné en 1992 et bien connu pour être exprimé dans le cerveau 2, son rôle essentiel pour le développement et la maintenance des neurones dopaminergiques du mésencéphale a été révélé par des études de souris knockout 3. En outre, son rôle important pour le maintien des neurones dopaminergiques du mésencéphale a récemment été démontré par une étude de knock-out conditionnel 4. En raison de ces études montrent élégantes rôles critiques de NURR1 pour les neurones dopaminergiques du mésencéphale, de nombreuses études ultérieures ont essentiellement porté sur la neurones dopaminergiques du mésencéphale et le trouble neurodégénératif liés à la dopamine, la maladie de Parkinson (PD) 5. Notamment, Nurr1 est exprimée non seulement dans les dopamine mésencéphale (MDA) neurones, mais aussi dans les diles zones du cerveau verset 2, suggérant que cela peut avoir des rôles fonctionnels dans de nombreux domaines non-Da, ce qui est fortement soutenue par des études plus récentes montrent que Nurr1 joue des rôles importants dans diverses fonctions du cerveau. Pour des exemples, il a été montré que les activités de mémoire induisant comme l&#39;apprentissage, ou d&#39;autres tâches de dépendante de l&#39;hippocampe résultat dans la régulation de l&#39;expression Nurr1 dans l&#39;hippocampe 6,7. En outre, abattre d&#39;expression Nurr1 dans l&#39;hippocampe était suffisante pour altérer la mémoire à long terme et / ou la plasticité synaptique 8-11, suggérant fortement que Nurr1 joue divers rôles dans de nombreuses zones du cerveau. Ainsi, afin de mieux comprendre l&#39;expression de type cellule-spécifique et subcellulaire de Nurr1, il est souhaitable d&#39;utiliser des anticorps spécifiques de NURR1, qui ne présentent pas de réactivité croisée à ses homologues Nur77 ou NOR1. Ce document décrit un protocole pré-adsorption pour générer des anticorps spécifiques NURR1 et de présenter des données supplémentaires montrant sa spécificité.

<table><tbody><tr><td>Domaine de liaison de ligand purifié à partir de la colonne Nurr1, Nor 1 et Nur77</td><td></td><td></td><td>Solution de stockage</td></tr><tr><td>Résine de couplage AminoLink et kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>44890</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de spin de protéine A</td><td>Thermo Scientific</td><td>89978</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>96 puits Plaques à fond plat, bride haute, 330 &mu ; l</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>10 % Normal Goat Serum</td><td>KPL</td><td>50-675-69</td><td></td></tr><tr><td>Diluant/Concentré Bloquant de Lait&nbsp ;</td><td>KPL</td><td>50-82-01</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’élution IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Kit de dosage des protéines</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Radis d’Inde Peroxydase conjuguée chèvre anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Résine Ni-NTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>3, 3', 5, 5' Tétraméthylbenzydine</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2N H2SO4</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H381 05</td><td></td></tr><tr><td>Protéine A Tampon de liaison</td><td>IgG Thermo Scientific</td><td>21001</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’élution IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Colonne Solution</td><td></td><td></td> de stockage <td>Phosphate tamponné Solution saline contenant 0,02 % d’azoture de sodium</td></tr><tr><td>Spectra/Por 7 tube de dialyse prétraité</td><td>Spectrum Labs</td><td>132128</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Colonnes jetables</td><td>Thermo Scientific</td><td>29924</td><td></td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> de couplage AminoLink <td>0,1 M phosphate de sodium, 0,05 % NaN3, pH 7,0</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> d’extinction <td>1M Tris. HCI, 0,05 % NaN3, pH 7,4</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td> de lavage <td>1M NaCl, 0,05 % NaN3</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> bloquant ELISA <td>1 % Sérum de cheval normal (NHS), 1 % Sérum de chèvre normal (NGS) dans 1X KPL Diluant</td></tr><tr><td>de lait Solution</td><td></td><td></td> de stockage <td>PBS pH 7,4 contenant 0,02 % d’azoture de sodium</td></tr><tr><td>Micropipettes : 10 &mu ; l; 20 &mu ; l; 200 &mu ; l; 1000 &mu ; </td><td></td><td></td><td></td>l</tr></tbody></table>

production de nurr-1 anticorps polyclonaux spécifiques gratuit de réactivité croisée contre son étroite homologues, nor1 et nur77

Production of Nurr-1 Specific Polyclonal Antibodies Free of Cross-reactivity Against Its Close Homologs, Nor1 and Nur77

La sous-famille des récepteurs nucléaires 4 (NR4A) est composée de 3 protéines apparentées partageant un domaine de liaison à l’ADN (DBD) et un domaine de liaison au ligand (LBD). La protéine 1 liée au récepteur nucléaire (Nurr1 ou NR4A2) joue un rôle clé dans le maintien du système dopaminergique. Les dysfonctionnements de la dopamine associés au gène Nurr1 comprennent la maladie de Parkinson, la schizophrénie et la maniaco-dépression, entre autres. De plus, des preuves récentes indiquent que Nurr1 est également exprimé dans d’autres zones du cerveau telles que l’hippocampe et joue un rôle essentiel pour l’apprentissage et la mémoire. Les autres membres de la famille sont le facteur de croissance nerveuse IB (Nur77 ou NR4A1) et le récepteur orphelin 1 dérivé des neurones (NOR1 ou NR4A3). Pour aider à étudier les rôles fonctionnels précis de Nurr1 dans les dysfonctionnements neuronaux dopaminergiques et d’autres régions du cerveau, des anticorps dépourvus de réactivités croisées contre Nur77 et NOR1 étaient nécessaires. Étant donné que les protéines sont plus divergentes dans leurs DCL que dans leurs domaines de liaison à l’ADN, l’immunisation avec des DCL purifiés devrait produire des anticorps spécifiques de Nurr1 avec des réactivités minimales contre Nur77 et/ou NOR1. Bien que des anticorps anti-Nurr1 aient été générés avec succès, ceux-ci ont montré une immunoréactivité significative contre les autres membres de la famille. La chromatographie d’affinité sur la protéine A immobilisée, suivie d’une pré-adsorption contre les DCL immobilisés de Nur77 et NOR1, a permis d’obtenir des anticorps spécifiques de Nurr1 exempts de réactivité croisée. Ici, nous ciblons sélectivement les anticorps contre un membre spécifique d’une famille de protéines hautement conservée en immunisant les animaux avec leurs régions les plus divergentes, puis en éliminant les anticorps à réaction croisée par pré-adsorption. L’objectif du protocole est d’augmenter la spécificité des anticorps polyclonaux par pré-adsorption contre les antigènes à réaction croisée.

Une comparaison de colonne de protéine A purifiée d&#39;anticorps spécifiques de NURR1 avec la protéine A des anticorps purifiés anti-NURR1 suivis par le passage à travers Nur77 LBD et Nor1 LBD colonnes est illustrée sur la figure 1. Comme on peut le constater, la protéine A purifiée anticorps Nurr1 montré une forte liaison à Nurr1 LBD. Toutefois, il a également montré une liaison significative à Nur77 LBD et Nor1 LBD. Lorsque la protéine d&#39;anticorps A purifié NURR1 ont été encore purifiés contre Nu...

Ici, nous ciblons sélectivement les anticorps contre un membre spécifique d’une famille de protéines hautement conservée en immunisant les animaux avec leurs régions les plus divergentes, puis en éliminant les anticorps à réaction croisée par pré-adsorption.

Production de Nurr-1 anticorps polyclonaux spécifiques gratuit de réactivité croisée contre son étroite homologues, Nor1 et Nur77

The nuclear receptor subfamily 4 (NR4A) is composed of 3 related proteins sharing a DNA binding domain (DBD) and a ligand-binding domain (LBD). The ...

L'objectif général de cette procédure est d'augmenter la spécificité des anticorps dirigés contre des protéines étroitement apparentées en éliminant les anticorps à réaction croisée. Cela est réalisé en identifiant d'abord les domaines protéiques présentant la plus grande divergence entre les protéines homologues. La deuxième étape consiste à exprimer et à purifier ces domaines protéiques.Ensuite, ces domaines protéiques sont couplés, par leur extrémité N- ou C-terminale, à une matrice de chromatographie. Spheros est utilisé dans cette démonstration. La dernière étape consiste à incuber le sérum immun avec des résines couplées à chacun des domaines réactifs croisés.En fin de compte, Eliza et le Western blot sont réalisés pour évaluer l'efficacité de la procédure. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'utilisation d'anticorps monoclonaux ou la purification par affinité, est que nous pouvons conserver l'affinité contre la cible souhaitée tout en éliminant les épitopes connus pour des réactions croisées. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés car la protéine qu'elles tentent d'étudier est instable.Le Dr Uri Kim, chercheur postdoctoral de notre laboratoire, démontrera cette procédure. Cette étude nécessite deux colonnes, une pour le récepteur orphelin dérivé des neurones, ou nor-1, et l'autre pour le facteur de croissance neuronal IB, ou nor-77. Étant donné que le même protocole s'applique aux deux protéines, seule la préparation d'une colonne sera démontrée.Décongelez la protéine à coupler à la résine sur de la glace, puis déterminez la concentration en protéine à l'aide de son coefficient d'extinction molaire et de son absorbance à 280 nanomètres. Utilisez deux millilitres de résine pour deux milligrammes de protéine. Toutes les étapes suivantes concernent deux millilitres de résine.Dans une colonne de 10 millilitres, préparez une colonne de 10 millilitres en poussant un FR jusqu'au fond et en faisant passer du PBS à pH 7,4 à travers celle-ci. Boucher l'extrémité inférieure de la colonne et ajouter deux millilitres de tampon de couplage. Ajouter quatre millilitres de la suspension à la colonne afin d'obtenir deux millilitres de résine.Retirez le bouchon inférieur et laissez s’écouler la colonne. Rincez la colonne avec un volume total de six millilitres, soit trois volumes de gel, de tampon de couplage, puis laissez-la s’écouler. Une fois le tampon de couplage écoulé, remettez le bouchon inférieur en place.Ensuite, ajoutez deux à quatre millilitres de protéine en suspension dans le tampon de couplage sur la colonne. Conservez un aliquot de la solution protéique pour évaluer l'efficacité du couplage. Par la suite, bouchez la colonne et mélangez par retournements successifs.Pour obtenir une solution homogène, mesurez le volume total des réactions en tenant compte du volume de la résine, puis ajoutez 10 microlitres de borohydrure de sodium à 5 M par millilitre de réaction. Boucher la colonne et mélanger bout à bout. Fixer la colonne sur un rotateur de tube et laisser la réaction se poursuivre toute la nuit.Le lendemain matin à quatre degrés Celsius, prenez la colonne et placez-la soigneusement sous la hotte chimique ; retirez le bouchon car un certain gaz peut s'être formé. Élué la colonne dans un tube propre et conservez l'éluat. La concentration en protéines de l'IIT sera mesurée et comparée à la concentration initiale en protéines.Pour évaluer l'efficacité du couplage, lavez la résine avec quatre millilitres de tampon de couplage et laissez s'écouler la colonne. Une fois que le domaine de liaison au ligand, ou LBD, a été couplé à la résine, l'étape suivante consiste à bloquer les sites restants. Pour commencer cette procédure, lavez la résine avec quatre millilitres de tampon d'arrêt, laissez écouler et remplacez le bouchon inférieur.Ajoutez deux millilitres de tampon d'arrêt et mettez en suspension la résine. Évaluez le volume total de la réaction en mesurant le volume de la résine et celui du tampon d'arrêt. Ajoutez 10 microlitres de borohydrure de sodium cyané à cinq molaire par millilitre de volume de réaction.Mélanger doucement à température ambiante pendant 30 minutes. À la fin de cette période, transporter la colonne sous la hotte. Retirer soigneusement le bouchon supérieur, puis le bouchon inférieur, et laisser s’écouler la colonne dans un tube de déchets.Lavez la colonne avec cinq volumes de résine de solution de lavage. Surveillez les lavages en recherchant la présence de protéines résiduelles en mesurant l'absorbance à 280 nanomètres. Les protéines non couplées sont éliminées par la concentration élevée de sel. Enfin, lavez la résine avec six millilitres de PBS DGA contenant 0,02 % d'azoture de sodium, puis conservez la colonne à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation.Commencez la procédure de purification des anticorps spécifiques anti-neuro 1 en rinçant la colonne couplée NORE 77 LBD avec 10 millilitres de PBS et en laissant s'écouler la colonne. Boucher le bas de la colonne et placer la colonne couplée neuro 77 LBD vidée dans un nouveau tube de collecte de 15 millilitres. Ajouter cinq millilitres de protéine, des anticorps anti-neuro 1 purifiés, à la colonne et la boucher. Placer la colonne sur un agitateur rotatif à quatre degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, retirez les bouchons supérieur et inférieur et récupérez l'écoulement. Mettez l'écoulement de côté sur de la glace jusqu'au moment de l'ajouter au nor. Une colonne couplée LBD.Rincez la colonne couplée au LBD « no one » avec 10 millilitres de PBS et laissez s'écouler le liquide ; bouchonnez le bas de la colonne et placez la colonne couplée au LBD « nor one » dans un tube de collecte de 15 millilitres. Ajoutez le liquide percolé provenant de la colonne couplée au LBD « north 77 ». Bouchonnez la colonne et placez-la sur un rotateur à 4 degrés Celsius pendant une heure.Après une heure, retirez les bouchons supérieur et inférieur et récupérez l'écoulement. Mesurez la concentration en anticorps en mesurant l'absorbance à 280 nanomètres.L'anticorps anti-noréone purifié est ensuite analysé par ELISA. Ajoutez 100 microlitres de protéine dans les puits d'une plaque de 96 puits. Si vous effectuez un test avec trois protéines différentes, ajoutez 100 microlitres de la protéine un dans les puits A1 à H4, 100 microlitres de la protéine deux dans les puits A5 à H8, et 100 microlitres de la protéine trois dans les puits A9 à H12.Couvrez la plaque et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius jusqu'au lendemain matin. Lavez deux fois les puits revêtus avec 300 microlitres par puits de PBS. Ajoutez ensuite 300 microlitres de tampon de blocage Eliza dans tous les puits revêtus d'antigène et incubez deux heures à température ambiante.Après deux heures de blocage, remplacez le tampon de blocage ELIZA dans chaque puits par 100 microlitres de tampon de blocage Eliza frais. Ajoutez 100 microlitres d'anticorps anti-EU un purifié dilué dans tous les puits de la rangée A, puis incubez une heure à température ambiante.Lavez la plaque trois fois avec du Tween 20 à 0,05 %. Après le troisième lavage, essuyez la plaque pour éliminer l'excès de tampon de lavage. Ajoutez 100 microlitres de peroxydase de raifort, conjuguée à une immunoglobuline G anti-rabique de chèvre, diluée dans un tampon de blocage Eliza, dans chaque puits, puis incubez une heure à température ambiante. Après une heure, lavez la plaque trois fois avec du Tween 20 à 0,05 %, comme indiqué précédemment, après le troisième lavage.Rincez tous les puits en les remplissant de 300 microlitres d'eau déionisée, puis éliminez l'excès d'eau en retournant la plaque sur du papier absorbant. Ajoutez 100 microlitres de tétraéthylbenzidine trois, trois prime, cinq, cinq prime à tous les puits, portez à température ambiante et incubez de 15 à 30 minutes à l'abri de la lumière à température ambiante. Arrêtez la réaction en ajoutant 50 microlitres d'acide sulfurique deux normaux dans chaque puits.Enfin, lire l'absorbance à 450 nanomètres. Soustraire le fond mesuré à 650 nanomètres pour une comparaison des protéines. Une protéine purifiée sans anticorps spécifiques. Des anticorps anti-Noro un purifiés suivis par un passage à travers des colonnes LBD no 77 et LBD no un montrent que, bien que les anticorps anti-no un purifiés par protéine A aient présenté une forte liaison à LBD no un, ils ont également montré une liaison significative à LBD no 77 et à LBD no un. Une purification supplémentaire des anticorps anti-no un contre LBD no 77 et LBD no un a complètement éliminé cette réactivité croisée. Cette spécificité a été confirmée par analyse Western blot d'extraits de cellules transfectées avec des vecteurs d'expression portant la protéine pleine longueur marquée Mick de nor un, nor un et nor 77. Des anticorps anti-Mick ont révélé que chaque protéine pleine longueur était exprimée à son poids moléculaire attendu. Les anticorps anti-nor un purifiés par protéine A détectaient de manière robuste la protéine pleine longueur nor un, mais détectaient également nor un et nor 77, bien que de façon moins efficace.En revanche, l'anticorps nor one entièrement purifié n'a montré aucune réactivité croisée détectable entre nor one et nor 77. L'analyse immunohistochimique de neurones dopaminergiques du mésencéphale à l'aide de l'anticorps nor one entièrement purifié a confirmé l'expression marquée de nor one. L'utilisation de la tyrosine hydroxylase a révélé en outre que neuro one est également exprimé exclusivement dans le noyau des neurones dopaminergiques du mésencéphale situés dans la région de la substance noire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement. N'oubliez pas que le travail avec l'ion sodium ou l'hydrure peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le travail sous hotte chimique doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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L&#39;identification d&#39;un épitope linéaire des cellules B monoclonales d&#39;anticorps reconnus par le peptide à balayage assistée

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