Un système organotypiques à haut débit pour la caractérisation de la sensibilité des médicaments cellules du myélome multiple primaire

L'objectif général de cette procédure est de quantifier la chimiosensibilité des cellules primaires de myélome multiple à un panel d'agents chimiothérapeutiques. Cela est réalisé en mélangeant d'abord des cellules de myélome multiple isolées à partir d'un prélèvement frais de moelle osseuse avec un stroma dérivé du patient et du collagène en pré-culture. Dans la deuxième étape, le mélange de cellules est ensemencé dans une plaque multipuits.

Les cellules sont ensuite traitées avec les agents chimiothérapeutiques d'intérêt, et la plaque est transférée dans l'incubateur d'un microscope motorisé pour une imagerie séquentielle des cellules sur une période d'incubation de 96 heures. En fin de compte, un algorithme d'analyse d'image numérique peut être utilisé pour générer des courbes de viabilité pour chaque médicament et chaque concentration. Les principaux avantages de cette technique par rapport aux tests de viabilité existants en point final sont qu'elle permet de tester plusieurs agents chimiothérapeutiques contre un seul échantillon provenant d'un patient, et que la viabilité des cellules du patient peut être mesurée de façon longitudinale sur plusieurs jours sans avoir à séparer les cellules du stroma ou de la matrice.

Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie des tumeurs hématopoïétiques, car elle peut théoriquement être utilisée pour prédire la réponse clinique à des régimes chimiothérapeutiques spécifiques. Nous avons eu l'idée de ce protocole lorsque nous avons réalisé que le remplacement de nos anciennes lames microfluidiques par des plaques multi-puits réduirait considérablement le coût et le temps nécessaires pour mener à bien l'expérience. Pour préparer les cocultures primaires de myélome multiple et de cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse à l’aide d’une pipette multicanal, commencez par suspendre les cellules à une concentration six fois supérieure à la concentration finale dans le milieu RPMI 1640.

Ensuite, mélanger 50 microlitres de chaque type cellulaire avec du collagène de type I fraîchement préparé jusqu'à un volume final de 300 microlitres. Puis utiliser une pipette multicanal pour distribuer manuellement huit microlitres du mélange matriciel cellulaire au centre de chaque puits d'une plaque 384. Centrifuger ensuite la plaque afin de concentrer toutes les cellules sur le même plan focal.

Après centrifugation, incuber les plaques dans des conditions de culture cellulaire pendant une heure afin de permettre la polymérisation du gel. Ajouter ensuite 80 microlitres de milieu de croissance complémenté dans chaque puits et incuber la plaque toute la nuit pour permettre au stroma d'adhérer au fond de la plaque. Pour préparer des co-cultures de stroma de myélome multiple à l'aide d'une pipette robotisée, commencer par suspendre 300 microlitres de cellules de myélome multiple positives pour le CD138 et 300 microlitres de cellules stromales dans du RPMI 1640, milieu à six fois la densité finale souhaitée, comme vient d'être illustré.

Ensuite, mélanger les deux types cellulaires dans un tube de 1,5 millilitre étiqueté CD138 positif et placer le tube dans une étuve à culture cellulaire. Puis, suspendre 60 microlitres de la lignée cellulaire de myélome multiple appropriée et 60 microlitres des cellules stromales dans du RPMI 1640, milieu à six fois la densité finale souhaitée, puis mélanger les deux types cellulaires dans un tube de 1,5 millilitre étiqueté « lignée cellulaire de ce second tube » et incuber également à 37 degrés Celsius. Sur le pipeteur robotisé, charger le fichier de script de semis cellulaire.

Ensuite, placez une boîte de pointes de pipette de 200 microlitres dans la station A, une plaque de microtitration dans la station B et une plaque stérile de 384 puits dans la station E du robot. Puis, mélangez le mélange de cellules CD138-positives avec le tube de milieu préparé fraîchement contenant du CD138 prémélangé, et transférez 1,5 millilitre de la solution cellulaire obtenue dans le puits numéro un de la plaque de microtitration.

Placer le reste des cellules sur de la glace et démarrer le programme. Le robot va semer les 176 premiers puits de la plaque de 384 puits, puis faire une pause. Profiter de ce moment pour transférer les cellules CD138 positives restantes dans le puit numéro deux de la plaque microtitration et reprendre le programme.

Le robot détectera les 144 puits restants de la plaque et s'arrêtera à nouveau. Mélangez alors les cellules provenant du tube de lignée cellulaire avec un tube de mélange préparé fraîchement pour la lignée cellulaire, puis transférez le contenu dans le puit numéro trois de la plaque microtitration. Reprenez ensuite le programme, permettant ainsi au robot de semer les 64 puits restants de la plaque 3 en 84 puits.

Une fois que le dernier puits a été ensemencé, centrifuger les cellules et transférer les cocultures dans l'incubateur de culture cellulaire pour la polymérisation du collagène. Après une heure, charger le script de la couche de milieu sur le robot et placer une boîte de pointes de pipette de 120 microlitres dans la station A, un réservoir de réactif contenant 31 millilitres de milieu RPMI 1640 supplémenté en sérum de veau fœtal, plasma de patient et antibiotiques dans la station B, et la plaque CED 3 de 84 puits dans la station E. Ensuite, exécuter le programme. Le robot transférera 81 microlitres du milieu supplémenté dans chaque puits.

Lorsque le robot a terminé, remettez les cellules dans l’incubateur pour permettre au stroma d’adhérer au substrat pendant la nuit. Pour traiter les cellules semées avec le médicament d’intérêt, chargez d’abord le script du plateau de médicament pour la couche de milieu dans l’interface utilisateur du pipeteur robotisé. Ensuite, placez une boîte de pointes de pipette de 120 microlitres sur la station A, un réservoir contenant 21 millilitres de RPMI 1640 supplémenté avec du plasma de patient FPS et des antibiotiques sur la station B, et une plaque vide de 3 84 puits sur la station E, puis lancez le programme ; le pipeteur robotisé ajoutera 30 microlitres de milieu dans chacun des puits.

La plaque 3 84 puits. Ensuite, selon le modèle, ajouter 200 microlitres de médicament à 20 fois la concentration maximale dans chaque puits d'une plaque microtitration pour le témoin. Ajouter du milieu complété avec du plasma de patient FPS et des antibiotiques.

Placez ensuite une boîte de pointes de pipette de 120 microlitres dans la station A, la plaque multidébouchons de médicaments dans la station B et une plaque 384 puits de milieu dans la station C, puis chargez le programme de plaque de médicaments. Le pipeteur robotisé effectuera une dilution sérielle un sur trois, comme illustré sur cette figure. Placez maintenant une nouvelle boîte de pointes de pipette de 120 microlitres dans la station A, la plaque 384 puits contenant le médicament dilué dans la station B et la plaque 384 puits contenant les cellules ensemencées dans la station C, puis lancez le programme d'ajout de médicament.

Le pipeteur robotisé transférera huit microlitres de médicament depuis chaque puits de la plaque de médicament vers le puits correspondant de la plaque de cellules. Une fois le dernier puits traité, transférez immédiatement la plaque de cellules dans l'incubateur du microscope numérique. Ensuite, pour imager les cellules, nettoyez l'intérieur de l'incubateur de paillasse avec une lingette humide imprégnée d'éthanol, puis échangez soigneusement le couvercle de la plaque contre le couvercle de l'incubateur.

Ensuite, suivez les étapes logicielles pour ajouter les points de repère des régions d'intérêt à imager successivement au cours de l'expérience. Enfin, à l’aide d’un objectif de 5 ou 10 x, mettez les cellules au point jusqu’à ce que les cellules de myélome multiple apparaissent comme des disques brillants entourés par un anneau sombre, tandis que les cellules stromales sont à peine visibles. Dans cette expérience, les cellules vivantes de myélome multiple ont été colorées artificiellement en vert, aucune ou très peu de fluorescence verte n’étant observée dans les cellules stromales et les cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines à la fin de l’expérience, à la concentration la plus élevée du médicament, lorsque toutes les cellules de myélome multiple étaient mortes.

Le logiciel du robot a ensuite été utilisé pour analyser la perte progressive de viabilité résultant de l'exposition aux différentes concentrations de médicament au fil du temps. Il est important d'observer attentivement toutes les puits ensemencés avant de commencer le processus d'acquisition d'images, car des artefacts pourraient induire en erreur le logiciel d'analyse d'images et conduire à des résultats erronés. Par exemple, ici, le résultat d'une densité excessive de cellules stromales ou d'un temps trop long entre la trypsination, l'individualisation et l'ensemencement est montré, entraînant la formation d'agrégats cellulaires, comme visible sur cette image.

Si les lignées cellulaires sont ensemencées à deux densités élevées, elles formeront des colonies au fur et à mesure de leur réplication, réduisant ainsi la précision de l'algorithme d'analyse d'image numérique, car il devient de plus en plus difficile de distinguer une cellule d'une autre. Trop peu de cellules de myélome multiple ont été ensemencées lorsque le nombre de cellules de myélome multiple obtenues à partir du prélèvement de moelle osseuse est inférieur à 500 000. Il est nécessaire de déterminer le volume mort du tube utilisé avant l'ensemencement des cellules et d'inclure ce volume dans les calculs de dilution. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à trois heures.

Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de garder le milieu prémélangé contenant le collagène sur de la glace afin d'éviter la polymérisation avant que les cellules ne soient prêtes. Cela a également permis d'explorer comment l'hétérogénéité de la chimiosensibilité de la charge tumorale peut déterminer la profondeur et la durée de la réponse du patient.