Name: Répandre surface et Immunocoloration des chromosomes de levure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Apprenez la technique d'étalement de surface et d'immunocoloration des chromosomes de levure pour visualiser les protéines liées aux chromosomes en microscopie à fluorescence.

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NOTE: Certaines étapes du protocole ci-dessous ont besoin de travailler dans une hotte propre. En outre, la méthode nécessite une dissection microscope levure tétrade équipé d&#39;un objectif à distance 10X long travail chargé de suivre sphéroplastes. Le microscope devrait être mis en place dans la hotte à l&#39;avance. Retirez le bras de micromanipulateur et support de plaque de la portée et de placer ces éléments dans un endroit sûr, loin de la zone de travail. 1. Préparation des sphéroplastes <ol><li> Cultiver la levure dans des conditions souhaitées. Utilisez environ 2 x 10 8 cellules pour chaque échantillon, par exemple 4 ml d&#39;une culture à DO600 = 1,4 x 10 5 7 cellules / ml. Bien que le traitement immédiat d&#39;échantillons peut être préférable dans certains cas, pour la plupart des applications, des aliquotes de cellules peuvent être stockés sur de la glace pendant jusqu&#39;à 8 heures avant d&#39;être traité. </li><li> Transfert suspension de cellules dans un tube de 15 ml centrifugeuse et de spin dans une centrifugeuse clinique à mettre en 5 (2345 tr / 857,5 x g) pendant 3 min pour sédimenter les cellules. </li&gt; <li> Décanter la prise moyenne soin de ne pas perdre des cellules du culot. Resuspendre doucement les cellules dans un tampon de ZK 1 ml, puis ajouter 40 pi 1 M dithiothréitol (DTT). Incuber 2 min en mélangeant doucement. Cellules à granules comme avant (voir l&#39;étape 1.2). </li><li> granulés de remettre en suspension dans un tampon de ZK 1 ml. Ajouter 5 ul d&#39;une solution fraîchement préparée de zymolyase 100T qui a été bien mélangé. Incuber pendant 20-30 min à 30 ° C pour éliminer la paroi cellulaire et produire des sphéroplastes. </li><li> Doser une goutte de 10 pi de suspension de cellules sur une lame de microscope pour déterminer si sphéroplastes est terminée. Cellules vues sous le microscope de dissection sans une lamelle. Les cellules doivent apparaître pléthorique et rond plutôt que légèrement oblongue et devraient lyser après l&#39;addition de 20 pi d&#39;eau. Si les cellules ne parviennent pas à lyser, retourner l&#39;échantillon à 30 ° C et re-test toutes les 10 min jusqu&#39;à ce que l&#39;eau induite par la lyse est facilement observé. Cellules à granules comme avant (voir l&#39;étape 1.2). </li><li> Resuspendre doucement et laver culot cellulaire in 2,5 ml MES / tampon de sorbitol froid. Cellules à granules comme avant (voir l&#39;étape 1.2). Resuspendre doucement culot cellulaire dans 300-400 MES / tampon de sorbitol ul froid. Les cellules peuvent être conservés dans la glace à ce stade pendant plusieurs heures. </li></ol> 2. Chromosome épandage REMARQUE: Les surfaces de verre sur laquelle les chromosomes seront répartis soit-diapositives ou lamelles couvre-devrait être préparée à l&#39;avance. Chaque diapositive ou lamelle devraient être immergés dans l&#39;eau, puis EtOH, puis on le laisse sécher, et poli avec du papier de verre. Si chromosomes seront répartis sur des lamelles, la lamelle doit être apposée sur une diapositive avec du scotch ou du ciment en caoutchouc. Sauf mention contraire, le reste du protocole décrira propagation soit sur une diapositive ou lamelle <ol><li> Aide d&#39;une pipette P20, pipette 20 ul de suspension cellulaire sur la surface d&#39;une lame propre. </li><li> Aide d&#39;une pipette P200, ajouter 40 pi de la PFA / solution de saccharose à 3% et mélanger délicatement la solution par &quot;tourbillonnant&quot; la lame avec la main jusqu&#39;à ce que les lignes disparaissent Schlieren. Placez glisser sous microscope et confirment que les cellules sont en discussion. La solution PFA devrait être fraîchement préparé dans la hotte sur le jour d&#39;utilisation. REMARQUE: si la protéine d&#39;intérêt n&#39;a pas été examiné par la méthode précédemment, il est souhaitable de préparer des diapositives supplémentaires à l&#39;aide de solutions contenant 2 et 4% de PFA afin de déterminer si la rétention de la protéine est sensible aux conditions de fixation. Une solution à 4% PFA / saccharose est utilisé dans les cas où il est souhaitable de visualiser les microtubules de tubuline associés. L&#39;inconvénient de la concentration ultérieure fixateur est que les chromosomes seront &quot;underspread,&quot; 2% de PFA a également tendance à donner chromosomes &quot;underspread&quot;. </li><li> Aide d&#39;une pipette P200, ajouter 80 pi de 1% Lipsol, tourbillonner comme avant de mélanger des solutions aussi complètement que possible, commencer une minuterie. Si Lipsol ne sont pas disponibles, 80 ul de 1% de NP40 ou 80 ul dH 2 O peuvent êtresubstitué (voir résultats représentatifs, Figure 2). </li><li> Regardez les cellules soigneusement et agiter doucement la lame toutes les 15 secondes. Lorsque environ 80% des cellules ont lysées (disparu) arrêter la minuterie, retirer immédiatement la lame du microscope, ajouter 80 pi de PFA / solution de saccharose, et agiter pour mélanger. Lysis devrait se produire à partir de entre 30 et 90 secondes après le démarrage de la minuterie. NOTE: Si plusieurs diapositives montrent lyse à peu près le même temps, on peut éventuellement omettre surveillance microscopique pour le reste des diapositives et simplement du temps soigneusement la période entre l&#39;addition de lipsol et l&#39;ajout de l&#39;aliquote finale de fixateur. Cependant, ce raccourci est fiable que lors de la préparation de plusieurs diapositives à partir du même échantillon. Il est préférable de contrôler la lyse de chaque échantillon au microscope lorsque différentes lames sont préparés à partir d&#39;échantillons prélevés à des moments différents ou de différentes cultures. </li><li> Placez la lame sur une surface plane et propre et répandre le liquide sur toute la surfac non glacése de la diapositive à l&#39;aide du côté d&#39;un propre, des pâturages pipette jetable est tenue au-dessous de la surface du bain de la &quot;flaque&quot;, mais au-dessus de la surface de la glissière elle-même, à savoir. ne pas &quot;ratisser&quot; la surface de la lame avec la pipette. Ne pas réutiliser pipette sur différentes diapositives pour éviter la contamination des échantillons. </li><li> Laisser les lames sécher pendant la nuit dans la hotte. Composants nucléaires insolubles se déposent sur la surface de glissement et de se lier à lui. Pour les grandes expériences, la planification de l&#39;utilisation de l&#39;espace pour l&#39;étape de séchage est important. </li><li> Une fois séchées, des résultats optimaux sont obtenus en progressant à l&#39;étape de immunocoloration le même jour. Cependant, la solution de saccharose séché incorpore les chromosomes d&#39;étalement dans un &quot;miel&quot; qui permet la congélation des échantillons: diapositives peuvent être transférées à une boîte de glissement en matière plastique et stockées à -20 ° C pendant des années. </li></ol> 3. Immunocoloration <ol><li> Tremper les lames à 0,2% Photo-Flo pour 30 sec. pour enlever le miel. Diapositives sur Leanun bord, avec le bord reposant sur une serviette en papier, pour supprimer résiduelle Photo-Flo. </li><li> Tremper les lames en 1x TBS pendant 5 minutes pour se laver. Retirer l&#39;excès de liquide en se penchant diapositives sur un bord, mais ne les laissez pas sécher. </li><li> Lay diapositives givrées vers le haut, pipette 300 ul TBS / BSA sur la lame à travers la partie non glacés de la diapositive. </li><li> Incuber dans une chambre humide à température ambiante pendant 15 min. (Récipient en plastique grande avec des serviettes en papier de l&#39;eau saturée sous une boîte de glissement de plaque de métal ou de plastique perforé avec des serviettes en papier saturées). </li><li> Égoutter diapositives en se reposant un bord court de la lame sur une serviette en papier et appuyé la lame contre un support approprié (comme un porte-tube à essai). Ne pas laisser sécher la surface. </li><li> Appliquer immédiatement 80 pi de tampon TBS / BSA contenant la dilution appropriée de l&#39;anticorps primaire. Si l&#39;anticorps est de limiter, utiliser 40 pi et une lamelle mm 22 x 22. Pour sérum de lapin brut, cela est généralement entre une dilution 1/50 et 1/500. NOTE:Effectuer des titrages pour les nouvelles préparations d&#39;anticorps. La préparation la plus diluée que des rendements élevés signal au-dessus de fond est choisie. Pour contrôler le niveau de la coloration de fond, les noyaux doivent être préparés à partir de la souche mutante de suppression approprié et / ou reproduire des diapositives doivent être colorés avec du sérum pré-immun. </li><li> Placez un poli 22 x 50 mm lamelle sur la lame en évitant les bulles. Pour ce faire, en tenant la lamelle entre le pouce et l&#39;index sur le bord long à des positions proches d&#39;un bord court. Tenir la lamelle à un angle de 30 ° par rapport à glisser, le court le plus éloigné du bord des doigts est abaissée jusqu&#39;à ce qu&#39;il repose sur la diapositive juste à l&#39;intérieur du bord de la &quot;flaque&quot; plus proche de la région dépoli de la lame. Ensuite, abaissez lentement la lamelle dans un mouvement lisse jusqu&#39;à ce que les doigts qui tiennent la lame touche le banc, puis relâchez. Ne pas tenter de régler la position de la lamelle une fois qu&#39;il atterrit. NOTE: Si des étalements de chromosomes ont été préparés surapposés lamelles (plutôt que directement sur la surface des lames), cette lamelle échantillon restera fixée à la glissière au cours des étapes de lavage et de coloration. Une lamelle supplémentaire sera placé sur le dessus de l&#39;échantillon lamelle afin de répartir uniformément la solution d&#39;anticorps pendant la coloration, puis jetés. </li><li> Placer les lames dans une chambre humide scellé et incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Tenir le transfert de bord dépoli les diapositives à un support de coloration de lame de verre et plonger dans un bocal contenant de coloration SCT. </li><li> Plonger doucement la lame de haut en bas pour enlever la lamelle. Essayez de ne pas utiliser trop de force pour ce faire. Laver les lames 2x 10 min en immergeant dans du TBS. Sortir les lames de rack et drainer l&#39;excès de liquide en touchant bord à serviette en papier. Ne pas laisser sécher la surface. </li><li> Travaillant sous une lumière tamisée, ajouter immédiatement 80 pi TBS / BSA contenant un 1 / 1.000 dilution d&#39;anticorps secondaire conjugué fluorochrome (ou 40 pi avec un 22 x 22 mm lamelle). Annonced lamelle comme avant et incuber à 4 ° C pendant 2 heures dans la chambre humide dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirer lamelles comme avant, les égoutter diapositives, et permettre à la surface sécher à l&#39;air de 1 à 2 h dans l&#39;obscurité. Lean diapositives sur des serviettes en papier comme avant. NOTE: Si la diffusion a été effectuée sur une lamelle montée, détachez la lamelle de la lame avant de sécher. Lamelles sont ensuite séchées de la manière décrite pour les diapositives dans l&#39;étape précédente. </li><li> Travaillant sous lumière tamisée, ajouter environ 30 pi de milieu contenant DAPI (trois 10 Les gouttelettes pi) de montage, puis abaissez délicatement une lamelle. Si les écarts sont sur des lamelles, placer les gouttelettes de milieu de montage sur une lame propre et abaisser la lamelle, côté chromosome bas, sur la diapositive. </li><li> Toujours sous lumière tamisée, attendre 2 min pour lamelle de régler et sceller les bords de la lamelle avec vernis à ongles transparent. Placez les diapositives dans une boîte de tiroir plat. NOTE: Pour la microscopie STED, monter avec ProLong Or. Utilisez 30 pi de ProLong Orsans DAPI et laisser sécher durant la nuit. Étanchéité avec le vernis à ongles est inutile. </li><li> Voir les diapositives par microscopie à épifluorescence grand champ avec un 40 ou un objectif 100X en utilisant un filtre approprié pour définir DAPI se concentrer. Éventuellement stocker la lame dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant plusieurs semaines. Ne pas congeler. </li></ol>

<ol><li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li>
<li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li>
<li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li>
<li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li>
<li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+identifies+Monopolin%3A+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li>
<li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+RecA-like+recombinases%3A+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li>
<li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1%2FAurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li>
<li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li>
<li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li>
<li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

L’apparition des noyaux étalés dépend de manière critique de l’équilibre entre la fixation et le traitement par lyse/détergent. Comme nous l’avons vu ci-dessus, la préservation de structures cellulaires variables nécessite l’utilisation de différentes concentrations de PFA. Pour la plupart des protéines, 3 % de PFA est optimal. Cependant, la conservation des broches nécessite l’utilisation de 4 % de PFA. Même avec un seul ensemble de réactifs, le moment de la lyse par rapport à la fixation peut également affecter la qu...

La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae présente de nombreux avantages pour les études des mécanismes moléculaires des processus biologiques, y compris l&#39;étude des protéines qui contrôlent la fonction de chromosome. Bien qu&#39;il existe des avantages bien connus de la levure bourgeonnante pour les études génétiques, moléculaires et biochimiques, les études cytologiques de la distribution des protéines dans le noyau de la cellule est compliquée par sa petite taille. Le noyau de la levure typique a un diamètre de moins d&#39;un micron, ce qui est seulement d&#39;environ 5 fois la limite de résolution de la lumière visible. Ainsi, la quantité d&#39;informations à propos de la distribution des protéines nucléaires qui peuvent être obtenus à partir de immunocoloration classique ou en utilisant les mots-clés de protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP), est limitée. Une approche utile pour caractériser la répartition des protéines est subnucléaire surface de chromosome se propager. Cette approche consiste à enlever la paroi cellulaire, perturbant les membranes cellulaires et nucléaires, et unllowing le contenu insolubles du noyau de se déposer sur la surface d&#39;une lame de microscope. Ces composants insolubles comprennent la matrice nucléaire et les chromosomes. En plus de permettre l&#39;enlèvement des matières nucléaires solubles, ce qui améliore la capacité de détecter les protéines liées de la chromatine, le chromosome d&#39;étalement méthode conduit à une décompression importante des chromosomes tels que les noyaux de propagation ont des diamètres de l&#39;ordre de 3 à 5 um (pour les noyaux méiotiques diploïdes) et 2 à 3 um pour les noyaux mitotiques diploïdes. Cette décompression permet la détection de sous-structure nucléaire qui est relativement difficile, voire impossible à résoudre dans les noyaux intacts. Un inconvénient évident de chromosome d&#39;étalement est la possibilité que la procédure d&#39;étalement peut partiellement ou complètement perturber la structure d&#39;intérêt. Il est particulièrement préoccupant que un chromosome lié protéine particulière pourrait être perdu à la suite de la procédure se propager. Cette shou de complication potentielleld être gardé à l&#39;esprit lors de l&#39;interprétation des données. Un exemple d&#39;une protéine qui est sensible à la procédure d&#39;étalement est la bêta-tubuline. Dans certaines conditions, la broche, qui est constitué principalement de la tubuline, est conservée lors de l&#39;épandage 3. Visualisation de la broche est souvent utile de mettre en scène des noyaux d&#39;intérêt. Cependant, la visualisation de la tubuline nécessite un traitement avec un fixateur haute concentration; les broches sont perdus dans les conditions standards décrites ci-dessous. Cet exemple illustre le fait que, lors de l&#39;analyse de la répartition d&#39;une protéine non caractérisée précédemment, il est important de faire varier la concentration de fixateur afin de déterminer la sensibilité de la protéine est d&#39;une telle variation. En dépit de l&#39;inquiétude quant à l&#39;impact des conditions d&#39;épandage sur la structure des chromosomes, l&#39;utilité et la puissance de la méthode de propagation ont été mis en évidence dans de nombreux contextes et a une large utilité dans la caractérisation des mitotique et, en particulier les cellules méiotiques 4-7. Two méthodes d&#39;épandage ont été largement utilisés. La première de ces méthodes, développées par Dresser et Giroux 8, évite l&#39;utilisation de détergent et peut produire des préparations propagation qui semblent avoir relativement bien conservé la morphologie des chromosomes lors teinté pour le colorant DAPI spécifique d&#39;ADN. Cependant, ce procédé est relativement difficile de mettre au point et à la qualité des noyaux de propagation varie considérablement, quand une zone d&#39;une diapositive est comparée à d&#39;autres régions. Ce problème peut compliquer approches quantitatives qui impliquent l&#39;imagerie de nombreux noyaux non sélectionnés d&#39;une diapositive à éviter que des données biais d&#39;acquisition. La deuxième méthode d&#39;étalement chromosome, développé par Klein et Loidl 1, implique la fixation d&#39;équilibrage par le paraformaldéhyde, avec lyse et la décompression de la chromatine promu par une solution de détergent. Lorsqu&#39;il est correctement effectuée, cette méthode donne des résultats très reproductibles avec moins de variation de région à région par rapport à la méthode Dresser et Giroux. Cette présentation se concentre sur un modifiela version d de la méthode de Loidl et Klein, en raison de sa fiabilité et sa simplicité. Chromosome propagation est pas compliqué ou de temps; jusqu&#39;à 100 diapositives peuvent être préparés par immunocoloration en une seule journée. En outre, les préparations de propagation peuvent être stockés dans le congélateur pendant des années avant immunocoloration, et donc les laboratoires peuvent développer un référentiel des étalements de chromosomes congelés qui peut être utilisé lorsque de nouvelles questions se posent ou biologiques nouveaux réactifs de coloration deviennent disponibles. Le procédé d&#39;étalement de chromosomes est le plus couramment utilisé en combinaison avec une immunocoloration et la microscopie à fluorescence à grand champ, mais il est également possible de préparer des lames pour les méthodes microscopiques super-résolution légers tels que l&#39;épuisement de l&#39;émission stimulée (STED) microscopie.

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>US Biological&nbsp ;</td><td>Z1004</td><td>Préparez une solution à 20 mg/mL dans 50 mM de Tris pH 7,5 complété par 2 % de glucose. Préparez frais chaque expérience et conservez-le à 4 ° C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.</td></tr><tr><td>Lipsol&nbsp ;</td><td>L.I.P. Ltd&nbsp ;</td><td>n’est plus disponible dans le commerce</td><td>Préparer une solution à 1 % (v/v) dans l’eau. Conserver sur de la glace.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Préparez une solution à 1 % (v/v) dans l’eau. Conserver sur de la glace.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles standard</td><td>Fisher</td><td>12-544-E ou 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>Couvertures haute résolution</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 solution</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Préparer une solution à 0,2 % (v/v) dans l’eau.</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 24,7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Préparer une solution à 1 % (p/v) dans du TBS. Conserver à 4&deg ; C pendant un mois au maximum.</td></tr><tr><td>Anticorps</td><td></td><td></td><td></td>primaire</tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) Anticorps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield support de montage avec DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Boîte à lames en plastique</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Stocker les lames contenant des pâtes à tartiner séchées dans des fentes à -20°C. Utilisez-le également comme chambre humide.</td></tr><tr><td>Boîte à diapositives en carton</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>À utiliser pour transporter facilement les lames tachées/scellées ou les stocker à 4°C.</td></tr><tr><td>Pot Coplin</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Utiliser comme lavabo pour toboggans.</td></tr></tbody></table>

répandre surface et immunocoloration des chromosomes de levure

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

La petite taille des noyaux de la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae limite l’utilité de la microscopie optique pour l’analyse de la distribution subnucléaire des protéines liées à la chromatine. L’étalement en surface des noyaux de levure entraîne une expansion de la chromatine sans perte de protéines liées. Procédé d’étalement de surface, équilibre la fixation de protéines liées à l’ADN avec traitement détergent. La méthode démontrée est légèrement modifiée par rapport à celle décrite par Josef Loidl et Franz Klein1,2. La méthode a été utilisée pour caractériser la localisation de nombreuses protéines liées à la chromatine à divers stades du cycle cellulaire mitotique, mais elle est particulièrement utile pour l’étude des structures chromosomiques méiotiques telles que les recombinosomes méiotiques et le complexe synaptonimal. Nous décrivons également une modification qui ne nécessite pas l’utilisation de Lipsol, un détergent exclusif, qui était prévu dans la procédure initiale, mais qui n’est plus disponible dans le commerce. Un protocole d’immunocoloration compatible avec la méthode de propagation des chromosomes est également décrit.

L&#39;apparition de germes de propagation dépend de façon critique de l&#39;équilibre entre la fixation du chromosome et de compactage. Même lorsque les réactifs sont correctement équilibrées, la variation dans le degré de compactage de chromosome peut se produire dans différentes régions de la même lame et / ou entre les différentes lames. Ainsi, la qualité des spreads dans une région donnée d&#39;une diapositive devrait être évaluée avant que les images sont interprétées. Les effets de &qu...

Une méthode de propagation superficielle des chromosomes à partir de levures bourgeonnantes est présentée. Cette méthode est dérivée d’une méthode précédemment décrite par Loidl et Klein. De plus, nous démontrons une procédure d’immunomarquage des chromosomes propagés.

Répandre surface et Immunocoloration des chromosomes de levure

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les protéines liées aux chromosomes par microscopie de fluorescence. Cela est réalisé en premier lieu en éliminant la paroi cellulaire par un traitement aux enzymes. I'm olis.La deuxième étape consiste à lyser la cellule afin de libérer les membranes nucléaires par choc osmotique, généralement à l’aide d’un détergent. Cette étape est réalisée en présence d’une faible concentration d’agent fixateur afin de préserver la structure des protéines. Après la lyse cellulaire, la concentration d’agent fixateur est augmentée pour stabiliser davantage les structures protéiques.Les cellules lysées sont ensuite déposées sur une lame de microscope et les noyaux sont laissés en sédimentation sur la surface de la lame. La dernière étape consiste à réaliser une immunomarquage des échantillons. La méthode d'immunomarquage indirecte présentée ici utilise un anticorps primaire qui se lie à la protéine d'intérêt et un anticorps secondaire marqué par un fluorophore qui se lie à l'anticorps primaire.En fin de compte, la microscopie en immunofluorescence est utilisée pour examiner la répartition des protéines liées aux chromosomes. Ces images représentatives montrent un noyau mitotique étalé, marqué par immunofluorescence pour les protéines de recombinaison DMC1 et RAD51. Le principal avantage de cette technique par rapport à la méthode couramment utilisée introduite par Mike Dresser et Craig Deru est que la majeure partie de la surface de la lame contient des noyaux correctement étalés, ce qui facilite l'obtention d'images d'un grand nombre de noyaux étalés à partir d'une seule lame.Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans l'étude des structures subnucléaires, telles que : deux protéines se co-localisent-elles, ou la formation d'une structure subnucléaire particulière dépend-elle de la fonction d'un gène d'intérêt donné ? Nous soulignons que cette méthode a été initialement développée par Franz Klein et Yosef Lole. Nous espérons que cette vidéo aidera d'autres chercheurs à maîtriser notre version de la technique.Les éclaboussures sont préparées à partir de cellules de levure cultivées dans les conditions souhaitées. Utilisez environ deux fois 10 puissance huit cellules pour chaque échantillon. Transférez la suspension cellulaire dans des tubes de centrifugeuse de 15 millilitres.Faire tourner les tubes dans une centrifugeuse clinique à un réglage de cinq pendant trois minutes afin de former un culot cellulaire. Décanter le milieu en prenant soin de ne pas perdre les cellules du culot. Resuspendre délicatement les cellules dans un millilitre de tampon ZK, puis ajouter 40 microlitres d'une solution de dihi à une molaire.Incubez trois étols pendant deux minutes à température ambiante avec un mélange doux. Faites tomber les cellules en culot comme précédemment après resus. Suspendez chaque culot dans un millilitre de tampon ZK.Ajouter cinq microlitres d'une solution fraîchement préparée de zyliase 100 T, soigneusement mélangée. Incuber à 30 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes afin de retirer la paroi cellulaire et produire des sphéroplastes. Observer 10 microlitres de la suspension cellulaire au microscope pour déterminer si la formation des sphéroplastes est complète.Avant la suppression de la paroi cellulaire, les cellules de levure apparaissent légèrement allongées ; les cellules sphéroplastes doivent être gonflées et rondes. Après l'ajout d'eau, les cellules sphéroplastes doivent être doucement resuspendues ; centrifuger et laver le culot cellulaire dans 2,5 millilitres de tampon orbital MES froid. Après centrifugation, resuspendre à nouveau délicatement le culot cellulaire dans 300 à 400 microlitres de tampon orbital MES froid ; les cellules peuvent être conservées sur glace à ce stade pendant plusieurs heures.Cette procédure nécessite un microscope de dissection de tétrade de levure équipé d'un objectif à longue distance de travail de 10 x installé dans la hotte, l'aiguille de microdissection devant être retirée. La surface en verre sur laquelle seront étalés les chromosomes doit également être préparée à l'avance : à l’aide d’une pipette P 20, déposer 20 microlitres de la suspension cellulaire sur la surface d’une lame propre ; avec une pipette P 200, ajouter 40 microlitres d'une solution fraîchement préparée de paraformaldéhyde 3 % et de saccharose 3,4 %, puis mélanger délicatement la solution en faisant tourner la lame à la main jusqu’à la disparition des lignes de Schlein. Placer la lame sous le microscope et vérifier que les cellules sont bien au point.À l’aide d’une pipette P 200, ajouter 80 microlitres de Lip Sal à 1 %, puis tourbillonner comme précédemment pour mélanger les solutions aussi complètement que possible et démarrer un minuteur. Si le Lip Sal n’est pas disponible, le même volume de 1 % de MP 40 ou d’eau distillée peut être utilisé. Sinon, observer attentivement les cellules et tourbillonner doucement la lame toutes les 15 secondes.Cet extrait vidéo montre ce qui devrait être observé lorsque environ 80 à 90 % des cellules ont subi une lyse. Arrêtez le chronomètre et retirez immédiatement la lame du microscope. La lyse doit survenir entre 30 et 90 secondes.Après avoir démarré le chronomètre, ajoutez 80 microlitres de la solution de paraformaldéhyde-saccharose et mélangez en agitant doucement. Placez la lame sur une surface plane et propre. Utilisez le côté d'une pipette Pasteur jetable propre, tenue sous le ménisque du liquide mais au-dessus de la surface de la lame, pour répartir le liquide sur toute la surface non givrée de la lame.Ne grattez pas la surface de la lame avec la pipette. Utilisez une pipette neuve pour chaque lame afin d'éviter la contamination des échantillons. Laissez les lames sécher toute la nuit dans la hotte. Les composants nucléaires insolubles, y compris les chromosomes, se déposeront sur la surface de la lame et s'y fixeront une fois les lames sèches.Des résultats optimaux sont obtenus en passant à la coloration immunohistochimique le même jour. Plonger les lames dans du Photo flow à 0,2 % pendant 30 secondes. Pour éliminer la solution de saccharose sèche, incliner les lames sur un bord, ce bord reposant sur une serviette en papier, afin d'éliminer l'excès de Photo flow.Immergez les lames dans un bain de XTBS pendant cinq minutes pour les laver. Éliminez l'excès de liquide en inclinant les lames sur un bord, mais veillez à ce qu'elles ne s'assèchent pas. Ensuite, placez les lames côté mat vers le haut et ajoutez 300 microlitres de T-B-S-B-S-A sur chaque lame à l’aide d’une pipette, en recouvrant la partie non mate de la lame.Incubez les lames dans une chambre humide à température ambiante pendant 15 minutes. Après 15 minutes, faites égoutter les lames en posant un bord court de chaque lame sur une serviette en papier et en appuyant la lame contre un support approprié, tel qu'un porte-tubes. Ne laissez pas la surface sécher immédiatement.Appliquez 80 microlitres de tampon T-B-S-B-S-A contenant la dilution appropriée d'anticorps primaire pour le sérum de lapin brut. Cette dilution est généralement comprise entre 1/50 et 1/500. Placez une lame de couverture polie de 22 par 50 millimètres sur la lame porteuse en évitant les bulles.Procédez en tenant la lame couvre-objet entre le pouce et l'index le long du bord long, près de l'une des extrémités courtes. En maintenant la lame couvre-objet à un angle de 30 degrés par rapport à la lame porte-objet, abaissez l'extrémité courte la plus éloignée des doigts jusqu'à ce qu'elle repose sur la lame, juste à l'intérieur du bord de la goutte, près de la zone givrée de la lame.Abaissez lentement la lame de couverture d’un mouvement régulier jusqu’à ce que les doigts touchent la lame, puis relâchez. N’essayez pas d’ajuster la position de la lame de couverture une fois qu’elle est posée. Placez les lames dans une chambre humide hermétiquement fermée et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant, en tenant les lames par le bord mat. Immergez chacune dans un bocal de coloration contenant du TBS.Déplacer doucement les lames immergées vers le haut et le bas pour retirer la lamelle. Éviter d'appliquer une force excessive lors de cette manipulation. Rincer les lames en les immergeant deux fois dans du TBS, pendant 10 minutes à chaque fois.Remplacer le tampon après le premier lavage. Retirer les lames de la platine et éliminer le liquide excédentaire en touchant leurs bords avec des essuie-tout. Ne pas laisser la surface sécher immédiatement.Ajouter sur chaque lame 80 microlitres de T-B-S-B-S-A contenant une dilution au 1/1000 d'anticorps secondaire marqué par un fluorochrome. Placer la lamelle comme précédemment et incuber dans la chambre humide à quatre degrés Celsius pendant deux heures à l'abri de la lumière. Après deux heures, retirer les lamelles, laver comme précédemment et égoutter les lames.Les placer sur des serviettes en papier. Laisser sécher leur surface à l'air libre pendant une à deux heures dans l'obscurité, en travaillant sous une lumière tamisée, avec environ 30 microlitres de milieu de montage contenant du dbi. Abaisser ensuite soigneusement une lame de couverture.Attendre deux minutes encore sous une lumière tamisée pour permettre au couvre-objet de se stabiliser, puis sceller les bords du couvre-objet avec du vernis incolore. Placer les lames dans une boîte à lames plate. Les lames peuvent être conservées à l’obscurité à quatre degrés Celsius jusqu’à leur utilisation.Ne pas congeler. Les lames illustrées à cette étape montrent deux exemples de noyaux méiotiques correctement étalés, avec une double immunomarquage des deux protéines d'échange de brin eucaryotes RAD51 et DMC1, et une contre-coloration de l'ADN au DAPI. Chez les cellules diploïdes, les noyaux méiotiques correctement étalés ont un diamètre d'environ cinq micromètres. Dans un noyau insuffisamment étalé, moins de foyers de RAD51 et de DMC1 sont résolus, et toutes les structures ne peuvent pas être observées dans un même plan focal, car l'échantillon n'est pas suffisamment plat. Dans les noyaux trop étalés,Moins de foyers de RAD51 et de DMC1 persistent en raison d'une fixation insuffisante ou d'un détergent en excès. Des expériences de traitement ont également été réalisées, dans lesquelles le lip-sal, plus disponible commercialement, a été remplacé par du MP-40 ; des résultats satisfaisants ont été obtenus, comme le montre la coloration du noyau méiotique étalé pour RAD51 et Zip1, une composante de la région centrale du complexe synaptonémal. Le remplacement du lip-sal par de l'eau distillée a également donné des résultats satisfaisants.Dans les deux cas, la compaction chromosomique qui se produit lorsque les cellules passent de la leptine NEA à la PAA a été largement conservée. Cette méthode d'étalage est adaptée à une utilisation avec des méthodes de microscopie de type super-résolution. Dans cette image du complexe synaptonémal NEAL, le noyau Paki INE s'est maintenu pour zip un et rouge un.Composants du complexe synaptonémal observés par microscopie à émission stimulée d'exhaustion. Remarquez que l'anticorps zip one utilisé ici, montré en vert, se fixe près des éléments latéraux, comme en témoigne le motif de coloration linéaire parallèle. Les éléments latéraux sont distants d'environ 100 nanomètres et ne peuvent pas être résolus par microscopie conventionnelle.Une fois maîtrisée, la technique de dépôt et d’étalage peut être réalisée en deux à quatre heures, selon le nombre d’échantillons, avec de la pratique ; jusqu’à 100 lames peuvent être préparées selon cette méthode. Il est conseillé de préparer une ou plusieurs lames supplémentaires pour chaque échantillon. Les duplicatas peuvent être conservés pour une utilisation ultérieure à moins 20 degrés Celsius après l’étape de séchage nocturne.Les lames se conservent généralement pendant des années lorsqu'elles sont stockées de cette manière.

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