Name: Répandre surface et Immunocoloration des chromosomes de levure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Apprenez la technique d'étalement de surface et d'immunocoloration des chromosomes de levure pour visualiser les protéines liées aux chromosomes en microscopie à fluorescence.

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NOTE: Certaines étapes du protocole ci-dessous ont besoin de travailler dans une hotte propre. En outre, la méthode nécessite une dissection microscope levure tétrade équipé d&#39;un objectif à distance 10X long travail chargé de suivre sphéroplastes. Le microscope devrait être mis en place dans la hotte à l&#39;avance. Retirez le bras de micromanipulateur et support de plaque de la portée et de placer ces éléments dans un endroit sûr, loin de la zone de travail. 1. Préparation des sphéroplastes <ol><li> Cultiver la levure dans des conditions souhaitées. Utilisez environ 2 x 10 8 cellules pour chaque échantillon, par exemple 4 ml d&#39;une culture à DO600 = 1,4 x 10 5 7 cellules / ml. Bien que le traitement immédiat d&#39;échantillons peut être préférable dans certains cas, pour la plupart des applications, des aliquotes de cellules peuvent être stockés sur de la glace pendant jusqu&#39;à 8 heures avant d&#39;être traité. </li><li> Transfert suspension de cellules dans un tube de 15 ml centrifugeuse et de spin dans une centrifugeuse clinique à mettre en 5 (2345 tr / 857,5 x g) pendant 3 min pour sédimenter les cellules. </li&gt; <li> Décanter la prise moyenne soin de ne pas perdre des cellules du culot. Resuspendre doucement les cellules dans un tampon de ZK 1 ml, puis ajouter 40 pi 1 M dithiothréitol (DTT). Incuber 2 min en mélangeant doucement. Cellules à granules comme avant (voir l&#39;étape 1.2). </li><li> granulés de remettre en suspension dans un tampon de ZK 1 ml. Ajouter 5 ul d&#39;une solution fraîchement préparée de zymolyase 100T qui a été bien mélangé. Incuber pendant 20-30 min à 30 ° C pour éliminer la paroi cellulaire et produire des sphéroplastes. </li><li> Doser une goutte de 10 pi de suspension de cellules sur une lame de microscope pour déterminer si sphéroplastes est terminée. Cellules vues sous le microscope de dissection sans une lamelle. Les cellules doivent apparaître pléthorique et rond plutôt que légèrement oblongue et devraient lyser après l&#39;addition de 20 pi d&#39;eau. Si les cellules ne parviennent pas à lyser, retourner l&#39;échantillon à 30 ° C et re-test toutes les 10 min jusqu&#39;à ce que l&#39;eau induite par la lyse est facilement observé. Cellules à granules comme avant (voir l&#39;étape 1.2). </li><li> Resuspendre doucement et laver culot cellulaire in 2,5 ml MES / tampon de sorbitol froid. Cellules à granules comme avant (voir l&#39;étape 1.2). Resuspendre doucement culot cellulaire dans 300-400 MES / tampon de sorbitol ul froid. Les cellules peuvent être conservés dans la glace à ce stade pendant plusieurs heures. </li></ol> 2. Chromosome épandage REMARQUE: Les surfaces de verre sur laquelle les chromosomes seront répartis soit-diapositives ou lamelles couvre-devrait être préparée à l&#39;avance. Chaque diapositive ou lamelle devraient être immergés dans l&#39;eau, puis EtOH, puis on le laisse sécher, et poli avec du papier de verre. Si chromosomes seront répartis sur des lamelles, la lamelle doit être apposée sur une diapositive avec du scotch ou du ciment en caoutchouc. Sauf mention contraire, le reste du protocole décrira propagation soit sur une diapositive ou lamelle <ol><li> Aide d&#39;une pipette P20, pipette 20 ul de suspension cellulaire sur la surface d&#39;une lame propre. </li><li> Aide d&#39;une pipette P200, ajouter 40 pi de la PFA / solution de saccharose à 3% et mélanger délicatement la solution par &quot;tourbillonnant&quot; la lame avec la main jusqu&#39;à ce que les lignes disparaissent Schlieren. Placez glisser sous microscope et confirment que les cellules sont en discussion. La solution PFA devrait être fraîchement préparé dans la hotte sur le jour d&#39;utilisation. REMARQUE: si la protéine d&#39;intérêt n&#39;a pas été examiné par la méthode précédemment, il est souhaitable de préparer des diapositives supplémentaires à l&#39;aide de solutions contenant 2 et 4% de PFA afin de déterminer si la rétention de la protéine est sensible aux conditions de fixation. Une solution à 4% PFA / saccharose est utilisé dans les cas où il est souhaitable de visualiser les microtubules de tubuline associés. L&#39;inconvénient de la concentration ultérieure fixateur est que les chromosomes seront &quot;underspread,&quot; 2% de PFA a également tendance à donner chromosomes &quot;underspread&quot;. </li><li> Aide d&#39;une pipette P200, ajouter 80 pi de 1% Lipsol, tourbillonner comme avant de mélanger des solutions aussi complètement que possible, commencer une minuterie. Si Lipsol ne sont pas disponibles, 80 ul de 1% de NP40 ou 80 ul dH 2 O peuvent êtresubstitué (voir résultats représentatifs, Figure 2). </li><li> Regardez les cellules soigneusement et agiter doucement la lame toutes les 15 secondes. Lorsque environ 80% des cellules ont lysées (disparu) arrêter la minuterie, retirer immédiatement la lame du microscope, ajouter 80 pi de PFA / solution de saccharose, et agiter pour mélanger. Lysis devrait se produire à partir de entre 30 et 90 secondes après le démarrage de la minuterie. NOTE: Si plusieurs diapositives montrent lyse à peu près le même temps, on peut éventuellement omettre surveillance microscopique pour le reste des diapositives et simplement du temps soigneusement la période entre l&#39;addition de lipsol et l&#39;ajout de l&#39;aliquote finale de fixateur. Cependant, ce raccourci est fiable que lors de la préparation de plusieurs diapositives à partir du même échantillon. Il est préférable de contrôler la lyse de chaque échantillon au microscope lorsque différentes lames sont préparés à partir d&#39;échantillons prélevés à des moments différents ou de différentes cultures. </li><li> Placez la lame sur une surface plane et propre et répandre le liquide sur toute la surfac non glacése de la diapositive à l&#39;aide du côté d&#39;un propre, des pâturages pipette jetable est tenue au-dessous de la surface du bain de la &quot;flaque&quot;, mais au-dessus de la surface de la glissière elle-même, à savoir. ne pas &quot;ratisser&quot; la surface de la lame avec la pipette. Ne pas réutiliser pipette sur différentes diapositives pour éviter la contamination des échantillons. </li><li> Laisser les lames sécher pendant la nuit dans la hotte. Composants nucléaires insolubles se déposent sur la surface de glissement et de se lier à lui. Pour les grandes expériences, la planification de l&#39;utilisation de l&#39;espace pour l&#39;étape de séchage est important. </li><li> Une fois séchées, des résultats optimaux sont obtenus en progressant à l&#39;étape de immunocoloration le même jour. Cependant, la solution de saccharose séché incorpore les chromosomes d&#39;étalement dans un &quot;miel&quot; qui permet la congélation des échantillons: diapositives peuvent être transférées à une boîte de glissement en matière plastique et stockées à -20 ° C pendant des années. </li></ol> 3. Immunocoloration <ol><li> Tremper les lames à 0,2% Photo-Flo pour 30 sec. pour enlever le miel. Diapositives sur Leanun bord, avec le bord reposant sur une serviette en papier, pour supprimer résiduelle Photo-Flo. </li><li> Tremper les lames en 1x TBS pendant 5 minutes pour se laver. Retirer l&#39;excès de liquide en se penchant diapositives sur un bord, mais ne les laissez pas sécher. </li><li> Lay diapositives givrées vers le haut, pipette 300 ul TBS / BSA sur la lame à travers la partie non glacés de la diapositive. </li><li> Incuber dans une chambre humide à température ambiante pendant 15 min. (Récipient en plastique grande avec des serviettes en papier de l&#39;eau saturée sous une boîte de glissement de plaque de métal ou de plastique perforé avec des serviettes en papier saturées). </li><li> Égoutter diapositives en se reposant un bord court de la lame sur une serviette en papier et appuyé la lame contre un support approprié (comme un porte-tube à essai). Ne pas laisser sécher la surface. </li><li> Appliquer immédiatement 80 pi de tampon TBS / BSA contenant la dilution appropriée de l&#39;anticorps primaire. Si l&#39;anticorps est de limiter, utiliser 40 pi et une lamelle mm 22 x 22. Pour sérum de lapin brut, cela est généralement entre une dilution 1/50 et 1/500. NOTE:Effectuer des titrages pour les nouvelles préparations d&#39;anticorps. La préparation la plus diluée que des rendements élevés signal au-dessus de fond est choisie. Pour contrôler le niveau de la coloration de fond, les noyaux doivent être préparés à partir de la souche mutante de suppression approprié et / ou reproduire des diapositives doivent être colorés avec du sérum pré-immun. </li><li> Placez un poli 22 x 50 mm lamelle sur la lame en évitant les bulles. Pour ce faire, en tenant la lamelle entre le pouce et l&#39;index sur le bord long à des positions proches d&#39;un bord court. Tenir la lamelle à un angle de 30 ° par rapport à glisser, le court le plus éloigné du bord des doigts est abaissée jusqu&#39;à ce qu&#39;il repose sur la diapositive juste à l&#39;intérieur du bord de la &quot;flaque&quot; plus proche de la région dépoli de la lame. Ensuite, abaissez lentement la lamelle dans un mouvement lisse jusqu&#39;à ce que les doigts qui tiennent la lame touche le banc, puis relâchez. Ne pas tenter de régler la position de la lamelle une fois qu&#39;il atterrit. NOTE: Si des étalements de chromosomes ont été préparés surapposés lamelles (plutôt que directement sur la surface des lames), cette lamelle échantillon restera fixée à la glissière au cours des étapes de lavage et de coloration. Une lamelle supplémentaire sera placé sur le dessus de l&#39;échantillon lamelle afin de répartir uniformément la solution d&#39;anticorps pendant la coloration, puis jetés. </li><li> Placer les lames dans une chambre humide scellé et incuber une nuit à 4 ° C. </li><li> Tenir le transfert de bord dépoli les diapositives à un support de coloration de lame de verre et plonger dans un bocal contenant de coloration SCT. </li><li> Plonger doucement la lame de haut en bas pour enlever la lamelle. Essayez de ne pas utiliser trop de force pour ce faire. Laver les lames 2x 10 min en immergeant dans du TBS. Sortir les lames de rack et drainer l&#39;excès de liquide en touchant bord à serviette en papier. Ne pas laisser sécher la surface. </li><li> Travaillant sous une lumière tamisée, ajouter immédiatement 80 pi TBS / BSA contenant un 1 / 1.000 dilution d&#39;anticorps secondaire conjugué fluorochrome (ou 40 pi avec un 22 x 22 mm lamelle). Annonced lamelle comme avant et incuber à 4 ° C pendant 2 heures dans la chambre humide dans l&#39;obscurité. </li><li> Retirer lamelles comme avant, les égoutter diapositives, et permettre à la surface sécher à l&#39;air de 1 à 2 h dans l&#39;obscurité. Lean diapositives sur des serviettes en papier comme avant. NOTE: Si la diffusion a été effectuée sur une lamelle montée, détachez la lamelle de la lame avant de sécher. Lamelles sont ensuite séchées de la manière décrite pour les diapositives dans l&#39;étape précédente. </li><li> Travaillant sous lumière tamisée, ajouter environ 30 pi de milieu contenant DAPI (trois 10 Les gouttelettes pi) de montage, puis abaissez délicatement une lamelle. Si les écarts sont sur des lamelles, placer les gouttelettes de milieu de montage sur une lame propre et abaisser la lamelle, côté chromosome bas, sur la diapositive. </li><li> Toujours sous lumière tamisée, attendre 2 min pour lamelle de régler et sceller les bords de la lamelle avec vernis à ongles transparent. Placez les diapositives dans une boîte de tiroir plat. NOTE: Pour la microscopie STED, monter avec ProLong Or. Utilisez 30 pi de ProLong Orsans DAPI et laisser sécher durant la nuit. Étanchéité avec le vernis à ongles est inutile. </li><li> Voir les diapositives par microscopie à épifluorescence grand champ avec un 40 ou un objectif 100X en utilisant un filtre approprié pour définir DAPI se concentrer. Éventuellement stocker la lame dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant plusieurs semaines. Ne pas congeler. </li></ol>

<ol><li>Loidl, J., Nairz, K., Klein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+synapsis+in+a+haploid+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome synapsis in a haploid yeast.</a> Chromosoma. 100 (4), 221-228 (1991).</li>
<li>Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+morphological+approaches+for+the+analysis+of+meiotic+chromosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast.</a> Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).</li>
<li>Lydall, D., Nikolsky, Y., Bishop, D. K., Weinert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meiotic+recombination+checkpoint+controlled+by+mitotic+checkpoint+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A meiotic recombination checkpoint controlled by mitotic checkpoint genes.</a> Nature. 383 (6603), 840-843 (1996).</li>
<li>Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA+homologs+Dmc1+and+Rad51+interact+to+form+multiple+nuclear+complexes+prior+to+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RecA homologs Dmc1 and Rad51 interact to form multiple nuclear complexes prior to meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 79, 1081-1092 (1994).</li>
<li>Rabitsch, K. P., Galova, M., Schleiffer, A., Buonomo, S. B., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+identifies+Monopolin%3A+a+kinetochore+protein+required+for+segregation+of+homologs+during+meiosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional genomics identifies Monopolin: a kinetochore protein required for segregation of homologs during meiosis I.</a> Cell. 103 (7), 1155-1168 (2000).</li>
<li>Gasior, S. L., Olivares, H., Ear, U., Hari, D. M., Weichselbaum, R., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+RecA-like+recombinases%3A+Distinct+roles+for+mediator+proteins+in+mitosis+and+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Assembly of RecA-like recombinases: Distinct roles for mediator proteins in mitosis and meiosis.</a> PNAS. 98 (15), 8411-8418 (2001).</li>
<li>Biggins, S., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+budding+yeast+protein+kinase+Ipl1%2FAurora+allows+the+absence+of+tension+to+activate+the+spindle+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The budding yeast protein kinase Ipl1/Aurora allows the absence of tension to activate the spindle checkpoint.</a> Genes & Development. 15 (23), 3118-3129 (2001).</li>
<li>Dresser, M. E., Giroux, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+chromosome+behavior+in+spread+preparations+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiotic chromosome behavior in spread preparations of yeast.</a> The Journal of Cell Biology. , (1988).</li>
<li>Lao, J. P., Cloud, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+crossover+control+by+concerted+action+of+Rad51-Dmc1+in+homolog+template+bias+and+robust+homeostatic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Meiotic crossover control by concerted action of Rad51-Dmc1 in homolog template bias and robust homeostatic regulation.</a> PLOS Genetics. 9 (12), e1003978-e1003978 (2013).</li>
<li>Vonesch, C., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+thresholded+landweber+algorithm+for+wavelet-regularized+multidimensional+deconvolution.+IEEE+transactions+on+image+processing+%3A+a+publication+of+the%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Signal+Processing+Society%22%5BJournal%5D)">A fast thresholded landweber algorithm for wavelet-regularized multidimensional deconvolution. IEEE transactions on image processing : a publication of the.</a> IEEE Signal Processing Society. 17 (4), 539-549 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

L’apparition des noyaux étalés dépend de manière critique de l’équilibre entre la fixation et le traitement par lyse/détergent. Comme nous l’avons vu ci-dessus, la préservation de structures cellulaires variables nécessite l’utilisation de différentes concentrations de PFA. Pour la plupart des protéines, 3 % de PFA est optimal. Cependant, la conservation des broches nécessite l’utilisation de 4 % de PFA. Même avec un seul ensemble de réactifs, le moment de la lyse par rapport à la fixation peut également affecter la qu...

La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae présente de nombreux avantages pour les études des mécanismes moléculaires des processus biologiques, y compris l&#39;étude des protéines qui contrôlent la fonction de chromosome. Bien qu&#39;il existe des avantages bien connus de la levure bourgeonnante pour les études génétiques, moléculaires et biochimiques, les études cytologiques de la distribution des protéines dans le noyau de la cellule est compliquée par sa petite taille. Le noyau de la levure typique a un diamètre de moins d&#39;un micron, ce qui est seulement d&#39;environ 5 fois la limite de résolution de la lumière visible. Ainsi, la quantité d&#39;informations à propos de la distribution des protéines nucléaires qui peuvent être obtenus à partir de immunocoloration classique ou en utilisant les mots-clés de protéines fluorescentes telles que la protéine fluorescente verte (GFP), est limitée. Une approche utile pour caractériser la répartition des protéines est subnucléaire surface de chromosome se propager. Cette approche consiste à enlever la paroi cellulaire, perturbant les membranes cellulaires et nucléaires, et unllowing le contenu insolubles du noyau de se déposer sur la surface d&#39;une lame de microscope. Ces composants insolubles comprennent la matrice nucléaire et les chromosomes. En plus de permettre l&#39;enlèvement des matières nucléaires solubles, ce qui améliore la capacité de détecter les protéines liées de la chromatine, le chromosome d&#39;étalement méthode conduit à une décompression importante des chromosomes tels que les noyaux de propagation ont des diamètres de l&#39;ordre de 3 à 5 um (pour les noyaux méiotiques diploïdes) et 2 à 3 um pour les noyaux mitotiques diploïdes. Cette décompression permet la détection de sous-structure nucléaire qui est relativement difficile, voire impossible à résoudre dans les noyaux intacts. Un inconvénient évident de chromosome d&#39;étalement est la possibilité que la procédure d&#39;étalement peut partiellement ou complètement perturber la structure d&#39;intérêt. Il est particulièrement préoccupant que un chromosome lié protéine particulière pourrait être perdu à la suite de la procédure se propager. Cette shou de complication potentielleld être gardé à l&#39;esprit lors de l&#39;interprétation des données. Un exemple d&#39;une protéine qui est sensible à la procédure d&#39;étalement est la bêta-tubuline. Dans certaines conditions, la broche, qui est constitué principalement de la tubuline, est conservée lors de l&#39;épandage 3. Visualisation de la broche est souvent utile de mettre en scène des noyaux d&#39;intérêt. Cependant, la visualisation de la tubuline nécessite un traitement avec un fixateur haute concentration; les broches sont perdus dans les conditions standards décrites ci-dessous. Cet exemple illustre le fait que, lors de l&#39;analyse de la répartition d&#39;une protéine non caractérisée précédemment, il est important de faire varier la concentration de fixateur afin de déterminer la sensibilité de la protéine est d&#39;une telle variation. En dépit de l&#39;inquiétude quant à l&#39;impact des conditions d&#39;épandage sur la structure des chromosomes, l&#39;utilité et la puissance de la méthode de propagation ont été mis en évidence dans de nombreux contextes et a une large utilité dans la caractérisation des mitotique et, en particulier les cellules méiotiques 4-7. Two méthodes d&#39;épandage ont été largement utilisés. La première de ces méthodes, développées par Dresser et Giroux 8, évite l&#39;utilisation de détergent et peut produire des préparations propagation qui semblent avoir relativement bien conservé la morphologie des chromosomes lors teinté pour le colorant DAPI spécifique d&#39;ADN. Cependant, ce procédé est relativement difficile de mettre au point et à la qualité des noyaux de propagation varie considérablement, quand une zone d&#39;une diapositive est comparée à d&#39;autres régions. Ce problème peut compliquer approches quantitatives qui impliquent l&#39;imagerie de nombreux noyaux non sélectionnés d&#39;une diapositive à éviter que des données biais d&#39;acquisition. La deuxième méthode d&#39;étalement chromosome, développé par Klein et Loidl 1, implique la fixation d&#39;équilibrage par le paraformaldéhyde, avec lyse et la décompression de la chromatine promu par une solution de détergent. Lorsqu&#39;il est correctement effectuée, cette méthode donne des résultats très reproductibles avec moins de variation de région à région par rapport à la méthode Dresser et Giroux. Cette présentation se concentre sur un modifiela version d de la méthode de Loidl et Klein, en raison de sa fiabilité et sa simplicité. Chromosome propagation est pas compliqué ou de temps; jusqu&#39;à 100 diapositives peuvent être préparés par immunocoloration en une seule journée. En outre, les préparations de propagation peuvent être stockés dans le congélateur pendant des années avant immunocoloration, et donc les laboratoires peuvent développer un référentiel des étalements de chromosomes congelés qui peut être utilisé lorsque de nouvelles questions se posent ou biologiques nouveaux réactifs de coloration deviennent disponibles. Le procédé d&#39;étalement de chromosomes est le plus couramment utilisé en combinaison avec une immunocoloration et la microscopie à fluorescence à grand champ, mais il est également possible de préparer des lames pour les méthodes microscopiques super-résolution légers tels que l&#39;épuisement de l&#39;émission stimulée (STED) microscopie.

<table><tbody><tr><td>Zymolyase</td><td>US Biological&nbsp ;</td><td>Z1004</td><td>Préparez une solution à 20 mg/mL dans 50 mM de Tris pH 7,5 complété par 2 % de glucose. Préparez frais chaque expérience et conservez-le à 4 ° C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.</td></tr><tr><td>Lipsol&nbsp ;</td><td>L.I.P. Ltd&nbsp ;</td><td>n’est plus disponible dans le commerce</td><td>Préparer une solution à 1 % (v/v) dans l’eau. Conserver sur de la glace.</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>USB</td><td>19628</td><td>Préparez une solution à 1 % (v/v) dans l’eau. Conserver sur de la glace.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles standard</td><td>Fisher</td><td>12-544-E ou 12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>Couvertures haute résolution</td><td>Fisher</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 solution</td><td>Kodak</td><td>P-7417</td><td>Préparer une solution à 0,2 % (v/v) dans l’eau.</td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 24,7 mM Tris, pH 8</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Préparer une solution à 1 % (p/v) dans du TBS. Conserver à 4&deg ; C pendant un mois au maximum.</td></tr><tr><td>Anticorps</td><td></td><td></td><td></td>primaire</tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>IgG (H+L) Anticorps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield support de montage avec DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Boîte à lames en plastique</td><td>Fisher</td><td>03-448-1</td><td>Stocker les lames contenant des pâtes à tartiner séchées dans des fentes à -20°C. Utilisez-le également comme chambre humide.</td></tr><tr><td>Boîte à diapositives en carton</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td>À utiliser pour transporter facilement les lames tachées/scellées ou les stocker à 4°C.</td></tr><tr><td>Pot Coplin</td><td>Fisher</td><td>08-816</td><td>Utiliser comme lavabo pour toboggans.</td></tr></tbody></table>

répandre surface et immunocoloration des chromosomes de levure

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

La petite taille des noyaux de la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae limite l’utilité de la microscopie optique pour l’analyse de la distribution subnucléaire des protéines liées à la chromatine. L’étalement en surface des noyaux de levure entraîne une expansion de la chromatine sans perte de protéines liées. Procédé d’étalement de surface, équilibre la fixation de protéines liées à l’ADN avec traitement détergent. La méthode démontrée est légèrement modifiée par rapport à celle décrite par Josef Loidl et Franz Klein1,2. La méthode a été utilisée pour caractériser la localisation de nombreuses protéines liées à la chromatine à divers stades du cycle cellulaire mitotique, mais elle est particulièrement utile pour l’étude des structures chromosomiques méiotiques telles que les recombinosomes méiotiques et le complexe synaptonimal. Nous décrivons également une modification qui ne nécessite pas l’utilisation de Lipsol, un détergent exclusif, qui était prévu dans la procédure initiale, mais qui n’est plus disponible dans le commerce. Un protocole d’immunocoloration compatible avec la méthode de propagation des chromosomes est également décrit.

L&#39;apparition de germes de propagation dépend de façon critique de l&#39;équilibre entre la fixation du chromosome et de compactage. Même lorsque les réactifs sont correctement équilibrées, la variation dans le degré de compactage de chromosome peut se produire dans différentes régions de la même lame et / ou entre les différentes lames. Ainsi, la qualité des spreads dans une région donnée d&#39;une diapositive devrait être évaluée avant que les images sont interprétées. Les effets de &qu...

Une méthode de propagation superficielle des chromosomes à partir de levures bourgeonnantes est présentée. Cette méthode est dérivée d’une méthode précédemment décrite par Loidl et Klein. De plus, nous démontrons une procédure d’immunomarquage des chromosomes propagés.

Répandre surface et Immunocoloration des chromosomes de levure

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser les protéines liées aux chromosomes par microscopie de fluorescence. Cela est réalisé en premier lieu en éliminant la paroi cellulaire par un traitement aux enzymes. I'm olis.La deuxième étape consiste à lyser la cellule afin de libérer les membranes nucléaires par choc osmotique, généralement à l’aide d’un détergent. Cette étape est réalisée en présence d’une faible concentration d’agent fixateur afin de préserver la structure des protéines. Après la lyse cellulaire, la concentration d’agent fixateur est augmentée pour stabiliser davantage les structures protéiques.Les cellules lysées sont ensuite déposées sur une lame de microscope et les noyaux sont laissés en sédimentation sur la surface de la lame. La dernière étape consiste à réaliser une immunomarquage des échantillons. La méthode d'immunomarquage indirecte présentée ici utilise un anticorps primaire qui se lie à la protéine d'intérêt et un anticorps secondaire marqué par un fluorophore qui se lie à l'anticorps primaire.En fin de compte, la microscopie en immunofluorescence est utilisée pour examiner la répartition des protéines liées aux chromosomes. Ces images représe

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Délétion du gène et surexpression de la protéine sont des méthodes courantes pour l'étude des fonctions des protéines. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l'analyse du développement phénotype en fonction de la concentration de protéines au niveau de la population et une seule cellule...

Analyse du développement d&#39;un phénotype morphologique en fonction de la concentration de protéines dans la levure bourgeonnante

Une méthode pour l'intégration des colonies de levures permettant la coupe pour la microscopie optique et électronique. Ce protocole permet la détermination de la distribution de cellules et les cellules sporulées pseudohyphal au sein des colonies fournissant un nouvel outil pour comprendre l'organisation de types de cellules dans une communauté fongiques.

Méthode d&#39;insertion de levure Colony

Dans ce protocole d'expression génique, chez la levure...

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

Nous présentons un protocole de congélation et de découpe au cryostat communautés de levure pour observer les modèles internes de cellules fluorescentes. La méthode repose sur la fixation et le méthanol octobre-enrobage à préserver la répartition spatiale des cellules sans inactivation des protéines fluorescentes dans une communauté.

Découpe au cryostat Communautés de levure pour examen des caractéristiques de fluorescence

Nous fournissons une méthode de base reproductible pour la microscopie à long terme du cycle de vie sexuel de la levure à fission. Avec des ajustements mineurs décrits, le protocole présenté permet de concentrer la recherche sur différentes étapes du processus de reproduction.

Microscopie de levure Fission Lifecycle sexuelle

Ici, nous présentons l'imagerie à cellules vivantes qui est une méthode de microscopie non toxique qui permet aux chercheurs d'étudier le comportement des protéines et la dynamique nucléaire dans les cellules vivantes de levure de fission pendant la mitose et la méiose.

Examen de la dynamique nucléaire de levure de fission mitotique et méiotique par fluorescence Microscopie à cellules vivantes

Le but de ce protocole est de visualiser la forme et la localisation des cellules de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal des mammifères.

Visualisation de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal murine utilisant l'hybridation fluorescente in Situ

La microscopie time-lapse est un outil précieux pour étudier la méiose chez la levure bourgeonnante. Ce protocole décrit une méthode qui combine la synchronisation du cycle cellulaire, la microscopie accélérée et l’épuisement conditionnel d’une protéine cible pour démontrer comment étudier la fonction d’une protéine spécifique pendant la ségrégation chromosomique méiotique.

Utilisation de la microscopie accélérée et de l’épuisement nucléaire spécifique au stade des protéines pour étudier la méiose chez S. cerevisiae

La levure de fission est utilisée ici comme hôte hétérologue pour exprimer des protéines cytosquelettiques bactériennes telles que FtsZ et MreB en tant que protéines de fusion translationnelle avec GFP pour visualiser leur polymérisation. De plus, les composés qui affectent la polymérisation sont identifiés par imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence.

La levure de fission comme plate-forme pour le criblage de médicaments antibactériens ciblant les protéines du cytosquelette bactérien

Ce protocole détaille deux méthodes d’arrêt du cycle cellulaire de levure et de libération facultative, et développe l’utilisation de la microscopie à fluorescence pour étudier les processus dépendants du cycle cellulaire chez S. cerevisiae.

Manipulation et analyse des processus dépendants du cycle cellulaire chez les levures bourgeonnantes

Apprenez la technique d'étalement de surface et d'immunocoloration des chromosomes de levure pour visualiser les protéines liées aux chromosomes en microscopie à fluorescence.

Répandre surface et Immunocoloration des chromosomes de levure

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