Un modèle de tissu 3D Poumon humain pour les études fonctionnelles sur

L'objectif général de cette procédure est de construire un modèle de tissu pulmonaire in vitro pour l'étude de l'infection par M tuberculosis. Cela est réalisé en superposant d'abord une matrice de collagène contenant des fibroblastes sur le filtre d'un insert de plaque de culture cellulaire. Dans une deuxième étape, des cellules épithéliales pulmonaires et des cellules immunitaires infectées sont ensuite placées sur la couche de collagène contenant des fibroblastes.

Le modèle tissulaire tridimensionnel obtenu est ensuite exposé à l’air afin de faciliter la sécrétion de mucus et la stratification de l’épithélium. Dans la dernière étape, le tissu est récolté et monté. Enfin, la microscopie par immunofluorescence est utilisée pour analyser la formation du granulome précoce induit par M. tuberculosis.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la monocouche in vitro de cellules, est que les cellules dans ce système se trouvent dans un microenvironnement tridimensionnel, permettant la formation de granulomes après infection par des mycobactéries virulentes, simulant ainsi la tuberculose humaine. Pour préparer les fibroblastes inclus dans le collagène, commencez par traiter les cellules de fibroblastes pulmonaires avec de la trypsine pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêtez la réaction avec huit millilitres de DMEM complet, puis centrifugez les cellules. Resuspendez les culots à 230 000 cellules par millilitre dans du DMEM frais et placez les cellules sur de la glace. Ensuite, ajoutez un insert par puits dans une plaque à six puits.

Plaque de culture et distribuez un millilitre de mélange fraîchement préparé sans cellules dans chaque insert, en veillant à ce que le mélange recouvre entièrement l'insert sans bulles d'air. Ensuite, placez la plaque dans une incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. À la fin de l'incubation, mélangez deux millilitres de collagène avec 615 microlitres de prémélange dans un tube conique stérile placé sur de la glace, afin de neutraliser le pH du collagène par insert.

Ensuite, ajouter 58 microlitres de DMEM complet et 327 microlitres de fibroblastes pulmonaires par insert au mélange de collagène. Effectuer plusieurs aspirations et dispensations à l’aide de la pipette afin de répartir uniformément les cellules dans tout le mélange. Ajouter rapidement trois millilitres de la couche cellulaire le long du côté de chaque insert, par-dessus chaque couche de collagène acellulaire.

Veiller à éviter les bulles d'air et remettre la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire pendant deux heures supplémentaires. Après la polymérisation du collagène, ajouter deux millilitres de DMEM complet au fond de chaque puits, puis remettre la plaque dans l'incubateur pendant 24 heures supplémentaires. Le lendemain, utiliser une paire de pinces propres pour soulever délicatement les inserts un par un et aspirer le milieu de culture depuis le fond de chacun.

Ensuite, ajoutez deux millilitres de DMM complet au fond de chaque puits, et deux millilitres de DMM complet dans chaque insert. Changez les deux volumes de milieu tous les deux jours pendant cinq à sept jours. Pour préparer les macrophages infectés, commencez par incuber une culture de macrophages pendant quatre heures avec M. tuberculosis virulent à une multiplicité d'infection de 10.

À la fin de l'incubation, laver les cellules trois fois avec du PBS pour éliminer les bactéries extracellulaires et traiter les macrophages avec deux millimoles de A DTA pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Une fois que les cellules se sont détachées, les resuspendre dans du DMM complet sans antibiotique. Puis aspirer tout le milieu du plateau de matrice de collagène de fibroblastes et ajouter 1,5 millilitre de DMM complet frais sans antibiotique dans les chambres extérieures.

Ensuite, mélanger les monocytes marqués de manière fluorescente avec les macrophages infectés dans un rapport de cinq pour un, dans 50 microlitres de DMEM complet sans antibiotique par insert. Ajouter alors 50 microlitres du mélange monocyte-macrophage à l’intérieur de chaque insert et replacer la plaque dans l’incubateur. Après une heure, ajouter lentement deux millilitres de milieu de culture le long des parois des inserts afin d’éviter de détacher les cellules, puis poursuivre l’incubation des cultures pendant 24 heures supplémentaires.

Pour ensemencer les cultures avec des cellules épithéliales pulmonaires, ajouter 4 millions de cellules épithéliales par millilitre dans 50 microlitres de DMM complet au-dessus des matrices de collagène contenant les fibroblastes et les cellules immunitaires. Incuber les cellules pendant deux minutes à température ambiante, puis pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajouter délicatement deux millilitres de DMM complet sans antibiotique dans les inserts comme vient de l'être démontré, et cultiver les cellules pendant trois jours supplémentaires.

Cinq jours après la mise en culture, aspirez tout le milieu des macrophages infectés à partir de la plaque et ajoutez 1,8 millilitre de DMM complet sans antibiotique dans les chambres extérieures. Ensuite, exposez les modèles de tissu 3D à l'air dans l'incubateur pendant deux jours sans ajouter de milieu dans l'insert au septième jour après la mise en culture.

Retirer complètement le milieu de la plaque et mélanger les modèles de tissus avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, séparer les membranes des inserts de puits. Puis, utiliser un scalpel propre pour retirer soigneusement les bords des modèles de tissus et découper chaque tissu en quatre morceaux carrés de taille approximativement égale.

Transférez les fragments sur des lames en verre super frosts et laissez-les sécher pendant cinq minutes. Ensuite, à l’aide d’un milieu de montage fluorescent contenant un agent anti-décoloration et du dpi, montez les tissus et recouvrez-les avec des lamelles. Laissez les lames à température ambiante à l’abri de la lumière jusqu’à ce qu’elles soient sèches, puis scellez les bords des lamelles avec du vernis à ongles.

Lorsque la laque est sèche, plonger les lames dans de l'éthanol à 70 % pour sortir de l'enceinte de niveau de sécurité biologique 3. Pour visualiser les tissus, acquérir des images 3D de cinq à dix champs différents couvrant l'ensemble du fragment de tissu, avec une résolution de 512 par 512 et une profondeur de Zack d'au moins 20 micromètres, avec un espacement entre les coupes de 1 à 1,5 micromètre, à l'aide d'un microscope confocal à fluorescence, afin de procéder à la quantification 3D des agrégats cellulaires. Ouvrir le logiciel de traitement d'images 3D et charger l'image d'intérêt.

Ensuite, à l’aide de l’outil de réglage de l’affichage, ajuster chaque canal pour l’image, le contraste, la luminosité et l’opacité de fusion afin d’optimiser le rendu volumique et de minimiser les interférences dues au bruit. Puis, pour visualiser la surface du tissu, sélectionner le canal des monocytes rouges et définir les seuils appropriés à l’aide des filtres afin de restreindre la sélection des monocytes rouges ou d’exclure le fond au besoin. Enfin, exporter les données vers le programme de tableur approprié pour une analyse complémentaire en aval.

Le septième jour, après l'ensemencement des cellules infectées par M. tuberculosis, la microscopie confocale révèle un regroupement de monocytes rouges au site d'infection, observé grâce à la présence des bactéries vertes, imitant les lésions de la tuberculose humaine connues sous le nom de granulomes en 3D. La visualisation offre la souplesse d'interagir, d'examiner et de quantifier plusieurs caractéristiques. Une image en 3D, par exemple, dans ces images illustrant un agrégat de monocytes au site d'infection par M. tuberculosis.

La disposition spatiale des bactéries vertes et des agrégats de monocytes rouges peut être observée selon les vues apicale, rotationnelle et latérale. Comme prévu, ces agrégats n'ont pas été observés dans les tissus non infectés. La quantification de la taille et du nombre de monocytes, d'agrégats cellulaires et de tissus infectés par le *M. tuberculosis* a révélé que la taille des agrégats cellulaires est augmentée, tandis que le nombre de monocytes individuels est réduit par rapport aux modèles de tissus non infectés.

Les utilisateurs potentiels de ce modèle de tissu pulmonaire incluent l'étude du rôle des différentes cellules immunitaires et de l'immunité tissulaire dans la tuberculose, l'étude des phénotypes de mycobactéries et l'évaluation de candidats médicaments capables d'éliminer les mycobactéries au sein du granulome.