Name: Un modèle de tissu 3D Poumon humain pour les études fonctionnelles sur Mycobacterium tuberculosis Infection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-05T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Découvrez la construction d'un modèle tissulaire pulmonaire 3D pour étudier l'infection par Mycobacterium tuberculosis. Cette technique permet d'analyser la formation des granulomes et les interactions immunitaires in vitro.

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Les auteurs remercient la plateforme de microscopie de la Faculté des sciences de la santé de l’Université de Linköping pour avoir donné accès à des systèmes d’imagerie avancés ; Karl-Eric Magnusson (scientifique émérite) du Département de médecine clinique et expérimentale de l’Université de Linköping pour avoir donné accès au logiciel de traitement d’images 3D/4D Imaris (Bitplane, Suisse) ; et S. Braian pour son aide avec le dessin animé sur le modèle de poumon. Ce travail a été soutenu par des fonds du Conseil suédois de la recherche (Alternatives à la recherche animale, 2012-1951) et du Conseil suédois de la recherche (2012-3349) à M.L. et de la Fondation suédoise pour la recherche stratégique à S.B. S.B. reçoivent des subventions du Karolinska Institutet, du Conseil suédois de la recherche, de l’Agence suédoise de coopération internationale au développement (Sida) et de l’Agence suédoise de contingences civiles (MSB), et de la Fondation suédoise du cœur et du poumon (HLF). M.S. a reçu des bourses du Karolinska Institutet et du Conseil départemental de Stockholm.

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

La capacité de recruter et de former des grappes de cellules organisées sur le site de l’infection est la marque de fabrique de la tuberculose humaine 11. Ces structures dynamiques connues sous le nom de granulomes tuberculeux sont principalement constituées de cellules immunitaires (macrophages, monocytes, cellules T et cellules B) et de cellules géantes multinucléées entourant M. tuberculosis. Le rôle du granulome a longtemps été considéré comme une barrière contre l’infection, empêchant ainsi la propagation locale des bactéries. Cependant, des études plus récentes montrent que la formation de granulomes est essentielle à la survie, à la croissance et à la dissémination précoces des bactéries12. Une stratégie des nouvelles études consiste à identifier des molécules ou des voies qui pourraient être efficacement ciblées pour inhiber la migration cellulaire dans la formation du granulome et/ou la dissémination de la tuberculose. 
Une mise en garde pour les nouvelles études sur la tuberculose est le manque de modèles qui récapitulent la tuberculose humaine. Les animaux de laboratoire les plus largement utilisés ne forment pas de véritable granulome lors de l’infection à M. tuberculosis et ne sont donc pas des choix appropriés pour les études sur la tuberculose 13-16. Les primates non humains ressemblent le plus à la tuberculose humaine 17, mais ne sont pas le choix préféré en raison des coûts opérationnels élevés et des questions éthiques. La tuberculose humaine est un processus immunologique complexe et difficile à modéliser in vitro. Les cultures cellulaires de monocouches ou de co-cultures n’ont pas l’environnement 3D et les réponses tissulaires. Par conséquent, nous avons développé un modèle innovant de tissu pulmonaire basé sur des cellules immunitaires primaires humaines et des lignées cellulaires spécifiques aux poumons humains 8,9. Le modèle présente des caractéristiques du tissu pulmonaire humain, notamment des épithéliums avec des macrophages uniformément intégrés, la formation d’une matrice extracellulaire, des épithéliums stratifiés et une sécrétion de mucus 9. 
Le modèle 3D de tissu pulmonaire humain présente plusieurs avantages par rapport aux cultures uniques in vitro ou aux co-cultures ensemencées sur des plaques de culture tissulaire ou des inserts transwell. Tout d’abord, les cellules spécifiques du poumon humain (fibroblastes et cellules épithéliales) ne sont pas couramment incluses dans les cultures uniques ou les co-cultures in vitro . Deuxièmement, les cellules immunitaires et les cellules spécifiques aux poumons sont intégrées dans un contexte physiologique 3D (produits de matrice extracellulaire riches en collagène). La réponse des cellules à un stimulus/infection et le comportement migratoire des cellules, par exemple la formation d’un granulome, diffèrent considérablement entre un environnement 2D et 3D. De plus, la méthode décrite permet la visualisation 3D et l’analyse quantitative 3D robuste qui fournit des informations essentielles sur la distribution spatiale et les interactions cellulaires complexes. 
L’infection expérimentale par M. tuberculosis dans le tissu modèle a entraîné un regroupement des macrophages au site de l’infection, rappelant le granulome précoce de la tuberculose (figures 2 et 3). Nous avons récemment démontré que les souches mutantes défectueuses dans la capacité à sécréter le facteur de virulence ESAT-6 ou Mycobacterium bovis BCG dépourvu d’ESAT-6 n’induisaient pas l’agrégation des monocytes (pas de granulome précoce), contrairement à la virulente M. tuberculosis 9. Ces données sont cohérentes avec les observations faites sur des embryons de poisson-zèbre infectés par Mycobacterium marinum, dont la transparence permet une imagerie élégante en direct de la formation du granulome 12. Comme il n’existe pas de modèle de référence pour la tuberculose, nous avons tiré parti des biopsies tissulaires réséquées chirurgicalement de patients atteints de tuberculose pour valider la méthode 9. Notre modèle de tissu in vitro partage plusieurs caractéristiques avec les biopsies pulmonaires et ganglionnaires de patients atteints de tuberculose, notamment l’agrégation de macrophages dans le granulome, la présence de bactéries intra- et extracellulaires 18 et l’induction de la nécrose 11. 
Bien que le modèle décrit ait une pertinence physiologique pour la tuberculose humaine et présente plusieurs avantages par rapport à d’autres modèles in vitro , il présente certaines limites. Par exemple, sur plus de 20 protéines de collagène identifiées chez l’homme, seul le type I est inclus dans le modèle pour imiter la matrice extracellulaire. Cependant, le collagène de type I est un mélange complexe de produits de la matrice extracellulaire et est le collagène le plus abondant dans le corps humain. De plus, nous avons démontré la présence de collagène IV et de plusieurs protéines de la matrice extracellulaire telles que la tropoélastine, la vimentine et la laminine, qui sont produites par les cellules épithéliales et les fibroblastes dans le modèle tissulaire, indiquant la synthèse de nouveau collagène 8. Actuellement, le modèle de tissu pulmonaire ne comporte que des monocytes et des macrophages, en plus des cellules spécifiques aux poumons. Il manque de neutrophiles et de lymphocytes qui sont également connus pour être présents dans le granulome. Remarquablement, le modèle ne se limite pas à l’introduction de cellules immunitaires supplémentaires et présente un intérêt pour explorer comment elles contribuent aux interactions cellulaires complexes dans la tuberculose humaine. L’implantation de macrophages alvéolaires primaires, de cellules spécifiques de la peau et de cellules de carcinome pulmonaire a déjà été testée dans le modèle. Comme notre objectif était d’utiliser un modèle qui ressemble beaucoup à la tuberculose humaine, l’introduction de cellules de souris n’a pas été tentée.
En résumé, le modèle du tissu pulmonaire a des implications pour les études mécanistes de base et appliquées. Les applications potentielles du modèle pulmonaire comprennent l’étude de l’immunité innée, l’étude des aspects mécanistes des défenses de l’hôte tels que la maturation phagosomale, l’autophagie, la production de cytokines, de chimiokines et de peptides antimicrobiens, et la caractérisation fonctionnelle de types de cellules individuelles. Il est frappant de constater que le modèle tissulaire in vitro permet de manipuler un ou plusieurs types de cellules et fournit un micro-environnement tissulaire pertinent, non seulement pour les études sur la tuberculose, mais aussi pour une variété de maladies infectieuses et non infectieuses qui affectent les poumons.

Chez l&#39;homme, les réponses à l&#39;infection, l&#39;inflammation des tissus, le recrutement cellulaire, remodelage tissulaire et la régulation de l&#39;homéostasie tissulaire sont des événements complexes impliquant différents types de cellules. Par conséquent, ces procédés sont le mieux étudiés dans l&#39;environnement tissulaire local. Auparavant, cela a surtout été possible en utilisant des modèles animaux expérimentaux. Toutefois, les animaux de laboratoire largement utilisés détiennent de nombreux limites car ils répondent souvent à des agents pathogènes d&#39;une manière différente que les humains et affichent également un cours différent de la maladie 1. Un être humain dans le modèle de tissu pulmonaire vitro détient les possibilités d&#39;étudier les réponses immunitaires spécifiques dans le poumon humain. L&#39;infection de la tuberculose humaine (TB) est principalement une maladie affectant les poumons. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), l&#39;agent causal de la tuberculose, atteint le poumon par des gouttelettes d&#39;aérosol qui sont transportés à l&#39;espace alvéolaire, où les bactéries sont engloutis par dendri pulmonairecellules tic et les macrophages alvéolaires dans le cadre de la réponse immunitaire innée à l&#39;infection 2,3. Phagocytose de l&#39;agent pathogène mène à la compartimentation de la bogue dans un phagosome et aboutit à la neutralisation et le meurtre de l&#39;agent pathogène par le phagocyte idéalement. Jusqu&#39;à 50% des personnes exposées à M. la tuberculose sont soupçonnés d&#39;être en mesure d&#39;éliminer l&#39;infection par la réponse immunitaire innée 4. Autres conséquences de l&#39;infection sont un dégagement de la système immunitaire adaptatif à un stade ultérieur, l&#39;infection latente ou dans le pire des cas, la maladie chronique active 5. Auparavant, il n&#39;y a pas eu de modèles in vitro de tissus pour les études de la tuberculose humaine. Des cultures de cellules uniques de macrophages humains ou d&#39;autres cellules du sang périphérique ont souvent été utilisés 6,7. L&#39;inconvénient de cette approche est qu&#39;ils ne peuvent pas tenir compte de la dynamique de différents types de cellules qui fonctionnent ensemble dans un tissu pulmonaire exposé à M. tuberculose </em&gt;. Ainsi, il existe un besoin d&#39;un modèle in vitro pour être en mesure d&#39;effectuer des études mécanistiques et fonctionnels sur la tuberculose. Le modèle en tissu pulmonaire humain in vitro décrit ici à base de cellules a été initialement créé par notre groupe d&#39;études sur les fonctions de cellules dendritiques 8. Nous avons adapté cette méthode pour l&#39;étude de la tuberculose. Le modèle de tissu pulmonaire humain présenté ici est constitué de cellules épithéliales et les fibroblastes 8 spécifiques d&#39;un tissu. Ces cellules sont cultivées dans une matrice de collagène sur le dessus d&#39;une membrane poreuse dans un insert Transwell et des structures de forme ressemblant à un tissu de poumon humain normal (figure 1). Lorsqu&#39;il est exposé à l&#39;air, les cellules commencent à sécréter du mucus sur le côté apical 8. En implantant des macrophages primaires humains infectés par M. la tuberculose au modèle, nous avons observé comment les cellules immunitaires migrent dans le tissu et forment premiers stades de granulomes tuberculeux 9. Ceci est la première descr modèle de tissu humainibed pour la tuberculose et elle pose un outil prometteur pour étudier les réponses immunitaires innées à la tuberculose et d&#39;autres maladies du poumon. À ce jour, nous avons utilisé seulement monocytes et les macrophages en cellules immunitaires dans le modèle, mais le niveau de complexité peut être augmentée par l&#39;inclusion d&#39;autres types de cellules pertinentes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig1.jpg" /> Figure 1. Représentation schématique du modèle de tissu pulmonaire. (A) Le modèle est composé de cellules épithéliales pulmonaires humaines spécifiques, M. tuberculose infectés par l macrophages primaires et le colorant rouge monocytes marqués collagène ensemencés sur des fibroblastes préparés embarqué sur un filtre Transwell. L&#39;exposition du modèle de tissu à l&#39;air initie la production de protéines de la matrice extra-cellulaire, la sécrétion de mucus et de stratification par l&#39;épithélium. Le modèle de tissu 3D ainsi développé est un outil utile pour étudier M. l&#39;infection tuberculeuse dans un environnement qui closely ressemble à un poumon humain. (B) des images microscopiques représentatifs des différentes étapes de la préparation du modèle de tissu. (C) de la structure complète de la section de modèle de tissu du poumon. Scale -. 100 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Inserts de culture cellulaire</td><td>BD Falcon</td><td>353092</td><td></td></tr><tr><td>plaques de culture à 6 puits</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>cellules MRC-5, fibroblastes pulmonaires</td><td></td><td></td><td>ATCC#CCL-171</td></tr><tr><td>16HBE cellules, cellules</td><td></td><td></td> épithéliales pulmonaires <td>Don du Dr Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, Université de Californie, San Francisco, États-Unis.</td></tr><tr><td>5 x Dulbecco' Eagle modifié' s medium (5 x DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Fabriqué à partir de poudre mais ajouter 5 fois moins d’eau. Ajustez le pH à 7,3 et filtrez-le à l’aide d’un micro & ; Filtre M.</td></tr><tr><td>Dulbecco' Eagle modifié' s milieu avec glucose (DMEM) 1x</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM) 1x avec Earle' sels s</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr> Solution <tr><td>d’acides aminés non essentiels, 100x</td><td>Life Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 (71,2 mg/ml)</td><td></td><td></td><td>Préparé sur place</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Chaleur inactivée pendant 30 min, 56 &deg ; C</td></tr><tr><td>Gentamicine (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon Hepes 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine (Pen Streptocoque)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 0,5 M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Collagène bovin traité PA (500 ml)</td><td>Organogenèse</td><td>200-055</td><td></td></tr><tr><td>Solution de collagène bovin purifié par col (100 ml)</td><td>Biomatrice avancée</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Protéine de la matrice extracellulaire, Fibronectine (1 mg)</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Monocytes/macrophages</td><td></td><td></td> humains primaires <td>Isolés du sang total humain ou des couches leucocytaires.</td></tr><tr><td>PKH26 Red fluorescent cell linker</td><td>Sigma</td><td>MINI26</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37Rv exprimant la protéine</td><td></td><td></td> fluorescente verte <td>M. tuberculosis H37Rv de type sauvage a été transformé avec le plasmide pFPV2 exprimant constitutivement la GFP.</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 moyen&nbsp ;</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook ADC Enrichment</td><td>BBL</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine B sulfate (20 &micro ; g/ml)</td><td>Sigma</td><td>B5264</td><td></td></tr><tr><td>Réactif anti=-fade Prolong Gold avec DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine -EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine</td><td></td><td></td><td></td>sérique bovine</tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de traitement d’images 3D/4D iMaris Scientific, version 7.6.8</td><td>Bitplane AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle de tissu 3d poumon humain pour les études fonctionnelles sur<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em&gt; infection

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

La tuberculose (TB) détient toujours une menace majeure pour la santé des personnes dans le monde, et il ya un besoin de modèles de coût-efficacité, mais fiables pour nous aider à comprendre les mécanismes de la maladie et de promouvoir les découvertes de nouvelles options de traitement. Cultures in vitro de cellules de monocouches ou co-cultures ont pas la (3D) environnement tridimensionnel et réponses tissulaires. Ici, nous décrivons un innovant modèle in vitro d&#39;un tissu pulmonaire humain, qui tient promesse d&#39;être un outil efficace pour étudier les événements complexes qui se produisent lors de l&#39;infection par Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). Le modèle de tissu 3D est constitué de cellules épithéliales et les fibroblastes spécifiques d&#39;un tissu, qui sont cultivées dans une matrice de collagène sur le dessus d&#39;une membrane poreuse. Lors de l&#39;exposition de l&#39;air, les cellules épithéliales de stratifier et sécrètent le mucus au côté apical. En introduisant les macrophages primaires humains infectés par M. tuberculose au mode de tissul, nous avons montré que les cellules immunitaires migrer dans le tissu infecté, et forment des premiers stades de la tuberculose granulome. Ces structures récapitulent la caractéristique distincte de la tuberculose humaine, le granulome, qui est fondamentalement différent ou non couramment observé dans des modèles animaux expérimentaux largement utilisés. Cette méthode de culture organotypique permet la visualisation 3D et l&#39;analyse quantitative robuste qui fournit des informations clé sur les caractéristiques spatiales et temporelles des interactions cellulaires hôtes-pathogènes. Pris ensemble, le modèle de tissu pulmonaire fournit un tissu micro-environnement physiologiquement pertinente pour les études sur la tuberculose. Ainsi, le modèle de tissu pulmonaire a des implications potentielles pour les deux études mécanistiques et appliquées de base. Fait important, le modèle permet l&#39;ajout ou la manipulation de types de cellules individuelles, ce qui élargit ainsi son utilisation pour la modélisation d&#39;une variété de maladies infectieuses qui affectent les poumons.

Un modèle de tissu 3D pour la tuberculose pulmonaire humain peut être utilisé efficacement pour étudier les interactions hôte-pathogène dans M. l&#39;infection de la tuberculose. Les étapes de base de cette méthode, les images microscopiques représentatives des différentes étapes et une structure microscopique d&#39;ensemble d&#39;une section de tissu sont présenté sur la figure 1. Le modèle comporte plusieurs éléments de tissu pulmonaire humain, y compris des fibroblastes de poumon, des cellules epitheliales bronchiques et les monocytes primaires / macrophages intégré dans l&#39;environnement de tissu 3D. Outre l&#39;incorporation des composants de tissu pulmonaire humain, le modèle ressemble à savoir stratification des conditions physiologiques de l&#39;épithélium et la sécrétion de mucus. Un exemple de l&#39;utilisation du modèle de tissu pulmonaire dans la surveillance d&#39;une infection par la tuberculose est présentée en figure 2. Pour visualiser l&#39;M. la tuberculose migration cellulaire -immune et l&#39;interaction, nous avons introduit des macrophages infectés par M. la tuberculose qui expriment la GFP(vert) avec les monocytes fraîchement isolés de PKH26 marqué (rouge) dans le modèle de tissu (bleu, DAPI colore les noyaux de). Au jour 7 plus de poste de M. tuberculose cellules infectées par au modèle de tissu, la microscopie confocale révèle regroupement des monocytes rouges sur le site de l&#39;infection (vert) (Figure 2), qui imite les lésions de cachet de la tuberculose humaine 9. Une série d&#39;images représentatives pour la visualisation 3D de M. la tuberculose infectés par l modèle de tissu et la quantification des amas de cellules est représenté en figure 3. La visualisation 3D donne la flexibilité de l&#39;utilisateur d&#39;interagir, d&#39;examiner et de quantifier plusieurs caractéristiques dans une image 3D. La disposition spatiale des bactéries vertes et rouges grappes de monocytes peut être vu à partir de la vue apicale, et de rotation latérale, comme illustré sur la figure 3B, ce qui révèle le regroupement des monocytes au niveau du site de M. la tuberculose. Les groupes ne sont pas observi dans les tissus non infectés (figure 3A). Nous avons quantifié la taille et le nombre de grappes de cellules monocytes et constaté que la taille (volume) des amas de cellules est améliorée (p &lt;0,001), tandis que le nombre de monocytes individuelles a diminué (p &lt;0,01) dans M. la tuberculose infecte les tissus par rapport aux modèles de tissus non infectés (figure 3C et 3D). Ces données valide notre constatation précédente de la formation de granulomes tôt M. l&#39;infection tuberculeuse observée dans les modèles de tissu pulmonaire analysés dans des coupes de tissus 2D 9. Nos données suggèrent que le modèle de tissus fournit un habitat 3D naturel pour enquêter sur l&#39;hôte complexe Cell-M. Réseau de communication de la tuberculose. Nous avons également constaté que la visualisation 3D et l&#39;analyse quantitative sont de meilleurs outils pour étudier les caractéristiques dans le modèle de tissu (Figure 3). Quantification d&#39;un amas de cellules (granulome par exemple) souvent stretch<html> hes à plusieurs couches de cellules et peuvent être complètement capturées par une analyse quantitative 3D. En outre, la visualisation des caractéristiques exactes spatiales et temporelles des cellules individuelles ou des bactéries dans le modèle permet études live-imagerie, de migration et de suivi dans un laboratoire désigné. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig2.jpg" /> Figure 2. monocytes dans le groupe de modèle de tissu autour virulente M. la tuberculose. des images confocales représentatifs de non infecté et M. modèle de tissus infectés de tuberculose est présentée. Panneaux de couleur verte (GFP M. tuberculosis-), rouge (monocytes PKH26-marqué), DAPI (noyaux bleus colorés) et les canaux fusionnés montrent le recrutement des monocytes dans les tissus infectés par rapport aux tissus non infectés. Scale - 100 um.large.jpg &quot;style =&quot; font-size: 14px; line-height: 28px; &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig3.jpg" /> Figure 3. visualisation 3D et l&#39;analyse quantitative d&#39;un modèle de tissu fournissent des informations utiles. Représentatifs de visualisation des images 3D de l&#39;ensemble du modèle de tissu (A) de tissu non infecté, (B) infectées par M. la tuberculose, par sectionnement optique utilisant Zeiss LSM700 microscope confocal et l&#39;analyse quantitative par Imaris logiciel de traitement d&#39;image (version 7.6.8). Ces images ont été acquises à un grossissement de 20x, 14 z-piles couvrant une épaisseur de tissu de 19,5 um à 1,5 um intervalle, permettant la visualisation de apicale, horizontal de rotation, vue verticale et latérale de rotation (A et B). (C) Catntitative analyse des amas de cellules monocytes révèlent améliorée (p &lt;0,0001) taille des grappes début de granulome après M. l&#39;infection tuberculeuse par rapport à l&#39;absence d&#39;infection. (D) de quantification de nombre de monocytes a montré un déclin (p ​​&lt;0,01) dans les tissus infectés par comparaison à un tissu non infecté, réitérant plusieurs grappes dans le tissu infecté. Vert - M. GFP de la tuberculose, Rouge - monocytes PKH26-étiquetés, Bleu - noyaux cellulaires, Scale -. 100 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

L’infection tuberculeuse humaine est un processus complexe, difficile à modéliser in vitro. Nous décrivons ici un nouveau modèle de tissu pulmonaire humain en 3D qui récapitule la dynamique qui se produit pendant l’infection, y compris la migration des cellules immunitaires et la formation précoce de granulomes dans un environnement physiologique.

Un modèle de tissu 3D Poumon humain pour les études fonctionnelles sur<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

L'objectif général de cette procédure est de construire un modèle de tissu pulmonaire in vitro pour l'étude de l'infection par M tuberculosis. Cela est réalisé en superposant d'abord une matrice de collagène contenant des fibroblastes sur le filtre d'un insert de plaque de culture cellulaire. Dans une deuxième étape, des cellules épithéliales pulmonaires et des cellules immunitaires infectées sont ensuite placées sur la couche de collagène contenant des fibroblastes.Le modèle tissulaire tridimensionnel obtenu est ensuite exposé à l’air afin de faciliter la sécrétion de mucus et la stratification de l’épithélium. Dans la dernière étape, le tissu est récolté et monté. Enfin, la microscopie par immunofluorescence est utilisée pour analyser la formation du granulome précoce induit par M. tuberculosis.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la monocouche in vitro de cellules, est que les cellules dans ce système se trouvent dans un microenvironnement tridimensionnel, permettant la formation de granulomes après infection par des mycobactéries virulentes, simulant ainsi la tuberculose humaine. Pour préparer les fibroblastes inclus dans le collagène, commencez par traiter les cellules de fibroblastes pulmonaires avec de la trypsine pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêtez la réaction avec huit millilitres de DMEM complet, puis centrifugez les cellules. Resuspendez les culots à 230 000 cellules par millilitre dans du DMEM frais et placez les cellules sur de la glace. Ensuite, ajoutez un insert par puits dans une plaque à six puits.Plaque de culture et distribuez un millilitre de mélange fraîchement préparé sans cellules dans chaque insert, en veillant à ce que le mélange recouvre entièrement l'insert sans bulles d'air. Ensuite, placez la plaque dans une incubateur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. À la fin de l'incubation, mélangez deux millilitres de collagène avec 615 microlitres de prémélange dans un tube conique stérile placé sur de la glace, afin de neutraliser le pH du collagène par insert.Ensuite, ajouter 58 microlitres de DMEM complet et 327 microlitres de fibroblastes pulmonaires par insert au mélange de collagène. Effectuer plusieurs aspirations et dispensations à l’aide de la pipette afin de répartir uniformément les cellules dans tout le mélange. Ajouter rapidement trois millilitres de la couche cellulaire le long du côté de chaque insert, par-dessus chaque couche de collagène acellulaire.Veiller à éviter les bulles d'air et remettre la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire pendant deux heures supplémentaires. Après la polymérisation du collagène, ajouter deux millilitres de DMEM complet au fond de chaque puits, puis remettre la plaque dans l'incubateur pendant 24 heures supplémentaires. Le lendemain, utiliser une paire de pinces propres pour soulever délicatement les inserts un par un et aspirer le milieu de culture depuis le fond de chacun.Ensuite, ajoutez deux millilitres de DMM complet au fond de chaque puits, et deux millilitres de DMM complet dans chaque insert. Changez les deux volumes de milieu tous les deux jours pendant cinq à sept jours. Pour préparer les macrophages infectés, commencez par incuber une culture de macrophages pendant quatre heures avec M. tuberculosis virulent à une multiplicité d'infection de 10.À la fin de l'incubation, laver les cellules trois fois avec du PBS pour éliminer les bactéries extracellulaires et traiter les macrophages avec deux millimoles de A DTA pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Une fois que les cellules se sont détachées, les resuspendre dans du DMM complet sans antibiotique. Puis aspirer tout le milieu du plateau de matrice de collagène de fibroblastes et ajouter 1,5 millilitre de DMM complet frais sans antibiotique dans les chambres extérieures.Ensuite, mélanger les monocytes marqués de manière fluorescente avec les macrophages infectés dans un rapport de cinq pour un, dans 50 microlitres de DMEM complet sans antibiotique par insert. Ajouter alors 50 microlitres du mélange monocyte-macrophage à l’intérieur de chaque insert et replacer la plaque dans l’incubateur. Après une heure, ajouter lentement deux millilitres de milieu de culture le long des parois des inserts afin d’éviter de détacher les cellules, puis poursuivre l’incubation des cultures pendant 24 heures supplémentaires.Pour ensemencer les cultures avec des cellules épithéliales pulmonaires, ajouter 4 millions de cellules épithéliales par millilitre dans 50 microlitres de DMM complet au-dessus des matrices de collagène contenant les fibroblastes et les cellules immunitaires. Incuber les cellules pendant deux minutes à température ambiante, puis pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajouter délicatement deux millilitres de DMM complet sans antibiotique dans les inserts comme vient de l'être démontré, et cultiver les cellules pendant trois jours supplémentaires.Cinq jours après la mise en culture, aspirez tout le milieu des macrophages infectés à partir de la plaque et ajoutez 1,8 millilitre de DMM complet sans antibiotique dans les chambres extérieures. Ensuite, exposez les modèles de tissu 3D à l'air dans l'incubateur pendant deux jours sans ajouter de milieu dans l'insert au septième jour après la mise en culture.Retirer complètement le milieu de la plaque et mélanger les modèles de tissus avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, séparer les membranes des inserts de puits. Puis, utiliser un scalpel propre pour retirer soigneusement les bords des modèles de tissus et découper chaque tissu en quatre morceaux carrés de taille approximativement égale.Transférez les fragments sur des lames en verre super frosts et laissez-les sécher pendant cinq minutes. Ensuite, à l’aide d’un milieu de montage fluorescent contenant un agent anti-décoloration et du dpi, montez les tissus et recouvrez-les avec des lamelles. Laissez les lames à température ambiante à l’abri de la lumière jusqu’à ce qu’elles soient sèches, puis scellez les bords des lamelles avec du vernis à ongles.Lorsque la laque est sèche, plonger les lames dans de l'éthanol à 70 % pour sortir de l'enceinte de niveau de sécurité biologique 3. Pour visualiser les tissus, acquérir des images 3D de cinq à dix champs différents couvrant l'ensemble du fragment de tissu, avec une résolution de 512 par 512 et une profondeur de Zack d'au moins 20 micromètres, avec un espacement entre les coupes de 1 à 1,5 micromètre, à l'aide d'un microscope confocal à fluorescence, afin de procéder à la quantification 3D des agrégats cellulaires. Ouvrir le logiciel de traitement d'images 3D et charger l'image d'intérêt.Ensuite, à l’aide de l’outil de réglage de l’affichage, ajuster chaque canal pour l’image, le contraste, la luminosité et l’opacité de fusion afin d’optimiser le rendu volumique et de minimiser les interférences dues au bruit. Puis, pour visualiser la surface du tissu, sélectionner le canal des monocytes rouges et définir les seuils appropriés à l’aide des filtres afin de restreindre la sélection des monocytes rouges ou d’exclure le fond au besoin. Enfin, exporter les données vers le programme de tableur approprié pour une analyse complémentaire en aval.Le septième jour, après l'ensemencement des cellules infectées par M. tuberculosis, la microscopie confocale révèle un regroupement de monocytes rouges au site d'infection, observé grâce à la présence des bactéries vertes, imitant les lésions de la tuberculose humaine connues sous le nom de granulomes en 3D. La visualisation offre la souplesse d'interagir, d'examiner et de quantifier plusieurs caractéristiques. Une image en 3D, par exemple, dans ces images illustrant un agrégat de monocytes au site d'infection par M. tuberculosis.La disposition spatiale des bactéries vertes et des agrégats de monocytes rouges peut être observée selon les vues apicale, rotationnelle et latérale. Comme prévu, ces agrégats n'ont pas été observés dans les tissus non infectés. La quantification de la taille et du nombre de monocytes, d'agrégats cellulaires et de tissus infectés par le *M. tuberculosis* a révélé que la taille des agrégats cellulaires est augmentée, tandis que le nombre de monocytes individuels est réduit par rapport aux modèles de tissus non infectés.Les utilisateurs potentiels de ce modèle de tissu pulmonaire incluent l'étude du rôle des différentes cellules immunitaires et de l'immunité tissulaire dans la tuberculose, l'étude des phénotypes de mycobactéries et l'évaluation de candidats médicaments capables d'éliminer les mycobactéries au sein du granulome.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Mueller, A., et al. Un modèle expérimental pour étudier la coinfection tuberculose-paludisme sur la transmission naturelle de Mycobacterium tuberculosis et Plasmodium berghei. J. Vis. Exp. (2014)Cette vidéo montre l’administration en aérosol de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) à la souris en utilisant un système de chambre à base de nébuliseur pour induire une infection pulmonaire, fournissant un modèle contrôlé et reproductible pour étudier la transmission aérienne de la tuberculose...

Délivrance en aérosol de Mycobacterium tuberculosis pour une infection pulmonaire dans un modèle murin

La tuberculose et le paludisme sont deux des infections les plus répandues chez les humains et les principales causes de morbidité et de mortalité dans les populations pauvres dans les zones tropicales. Nous avons établi un système de modèle expérimental pour étudier les résultats de la co-infection tuberculose-paludisme chez la souris après l'épreuve avec les deux agents pathogènes par l'intermédiaire de leur voie naturelle de l'infection.

Un modèle expérimental pour étudier la tuberculose-paludisme co-infection à transmission naturelle de Mycobacterium tuberculosis Et Plasmodium berghei</i

Nous présentons un modèle tridimensionnel (3D) de cancer du poumon basé sur un échafaudage biologique de collagène pour étudier la sensibilité aux thérapies ciblant le cancer du poumon à petites cellules (NSCLC). Nous démontrons différentes techniques de lecture pour déterminer l’indice de prolifération, l’apoptose et l’état de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). Les données collectées sont intégrées dans un modèle in silico pour la prédiction de la sensibilité aux médicaments.

Un tissu combiné 3D Conçu<em&gt; In vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor modèle de prévision de l&#39;efficacité des médicaments dans le Fond mutationnelles spécifiques

Nous avons mis au point un système modulaire de criblage à haut débit pour la découverte de nouveaux composés contre la tuberculose Mycobacterium, ciblant les bactéries à croissance intracellulaire et en bouillon ainsi que cytotoxicité contre la cellule hôte mammifère.

Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Nous décrivons l’imagerie optique des souris infectées par Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) utilisant journaliste enzyme fluorescence (REF). Ce protocole facilite la détection sensible et spécifique de M. tuberculosis dans des modèles animaux précliniques pour recherche de vaccin, la thérapeutique et la pathogenèse.

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Nous présentons ici un protocole à la tuberculose humaine de modèle dans un poisson-zèbre adulte à l’aide de son naturel pathogène Mycobacterium marinum. Extraits ADN et l’ARN des organes internes du poisson-zèbre infecté peuvent servir à révéler que le total mycobactériens charge dans le poisson et les réponses immunitaires de l’hôte avec le qPCR.

Modélisation de la tuberculose chez Mycobacterium marinum adultes infectés poisson zèbre

Nous présentons ici un protocole pour la préparation de tranches de poumon de coupe de précision humain rempli d’agarose de tissus réséqués du patient qui sont aptes à produire des cultures de tissus pulmonaires 3D aux maladies pulmonaires humaines modèle dans études biologiques et biomédicales.

Génération de Cultures de tissus pulmonaires humains de 3D (3D-SFLC) pour la modélisation de la maladie

Galleria mellonella a été récemment établi comme un modèle d'infection reproductible, bon marché et éthiquement acceptable pour le complexe de mycobacterium tuberculosis. Ici nous décrivons et démontrons les étapes prises pour établir l'infection réussie de G. mellonella avec le Mycobacterium bioluminescent bovis BCG lux.

Utilisation de l'invertébré Galleria mellonella comme modèle d'infection pour étudier le complexe mycobacterium de tuberculose

Nous décrivons un protocole pour un modèle tridimensionnel de co-culture des voies respiratoires infectées, utilisant CFBE41o- cellules, macrophages THP-1, et Pseudomonas aeruginosa, établi à l’interface air-liquide. Ce modèle fournit une nouvelle plate-forme pour tester simultanément l’efficacité antibiotique, la fonction de barrière épithéliale, et les marqueurs inflammatoires.

P. aeruginosa Co-culture 3D infectée des cellules épithéliales bronchiques et des macrophages à l’interface air-liquide pour l’évaluation préclinique des anti-infectieux

Les modèles de poumons sur puce surpassent les cultures 2D traditionnelles en imitant l’interface air-liquide et la perfusion de cellules endothéliales, simulant le flux sanguin et l’échange de nutriments essentiels pour les études de physiologie pulmonaire. Cela renforce la pertinence de la recherche pulmonaire, en offrant un environnement dynamique et physiologiquement précis pour faire progresser la compréhension et le traitement des infections respiratoires.

Modèle d’alvéole sur puce immunocompétent pour l’étude des réponses immunitaires de la muqueuse alvéolaire

Ici, nous présentons un protocole pour l’imagerie intravitale d’un Mycobacterium tuberculosis atténué approuvé par BSL-2. Souche dans le poumon murin utilisant une fenêtre pulmonaire permanente. Cette approche permet une analyse longitudinale à résolution unicellulaire des interactions précoces hôte-pathogène, y compris la localisation bacillaire, la dynamique vasculaire et l’absorption des macrophages dans le même microenvironnement pulmonaire.

Imagerie intravitale de Mycobacterium tuberculosis auxotrophe atténué dans le poumon murin lors d’une infection intravasculaire précoce

Découvrez la construction d'un modèle tissulaire pulmonaire 3D pour étudier l'infection par Mycobacterium tuberculosis. Cette technique permet d'analyser la formation des granulomes et les interactions immunitaires in vitro.

Un modèle de tissu 3D Poumon humain pour les études fonctionnelles sur

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