Name: miRNA expression analyses en cancer de la prostate tissus cliniques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Découvrez une méthode simplifiée d'analyse de l'expression des microARN dans les tissus cliniques de cancer de la prostate par PCR quantitative et hybridation in situ. Ce protocole permet d'identifier des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques.

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Nous remercions le Dr Roger Erickson pour son soutien et aide à la préparation du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Cancer Institute à la National Institutes of Health (Grant Nombre RO1CA177984; RO1CA138642), le projet de programme de VA sur cancer de la prostate (BX001604).

Échantillons frais cancer de la prostate congelés fixés à la formaline, inclus en paraffine (FFPE) ou ont été obtenues à partir de la SFVAMC. Les échantillons provenaient de patients atteints de cancer de la prostate qui ont subi une prostatectomie radicale SFVAMC. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients et l&#39;étude a été approuvée par le Comité sur la recherche humaine UCSF. Alternativement, les tissus de cancer de la prostate puces ont été achetés auprès de sources commerciales et utilisés pour miARN analyses par ISH. Informations clinico-pathologique et le suivi des patients atteints de cancer de la prostate analysées ont été recueillies. 1. Les échantillons de tissus <ol><li> Couper des échantillons de tissu de cancer de la prostate dans 10 um sections à l&#39;aide d&#39;un microtome et coloration à l&#39;H &amp; E en suivant le protocole du fabricant. </li><li> Revoir lames colorées pour l&#39;identification de la prostate foyers de cancer ainsi que épithélium glandulaire normal adjacent. Remarque: Un conseil certifié pathologiste doit examiner les diapositives H &amp; E colorées et mark de zones normales et tumorales. Utilisez les diapositives marqués comme guides dans les sections suivantes pour miARN analyses de la tumeur vs zones normales. </li></ol> 2. miRNA expression analyses par PCR quantitative en temps réel Remarque: Ce flux de travail comprend les étapes suivantes: microdissection laser, l&#39;isolement de l&#39;ARN total (y compris les miARN et ARNm), le dosage des miARN matures en utilisant les tests d&#39;expression TaqMan microARN comme détaillé dans les sections suivantes. <ol><li> Extraction de l&#39;ARN <ol><li> Isolement des miARN de Cancer de la prostate tissus FFPE <ol><li> Microdissection laser (LCM) Remarque: Effectuer les étapes 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 dans une hotte chimique. <ol><li> Préparer des lames de tissus (10 um sections) pour LCM. Sections Deparrafinize de tissu par trempage dans du xylene (2 x), pendant 10 minutes chacun, puis réhydrater les tissus en incubant les lames pendant 5 min chacun dans de l&#39;éthanol à gradient (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), suivie de distillation eau(5 min). </li><li> Après réhydratation, les sections de tache avec de l&#39;hématoxyline pendant 30 secondes puis de l&#39;eau. </li><li> La place les tissus dans de l&#39;éthanol gradué (70%, 95% à 90%, 80%, 70%) (5 min chacun) et du xylene (5 min). </li><li> Diapositives sec dans une hotte et les placer dans l&#39;instrument de LCM pour microdissection. </li><li> Effectuer microdissections avec le système LCM en conformité avec les instructions du fabricant 24. Utiliser pathologiste balisé diapositives comme guides pour l&#39;identification de la prostate foyers de cancer ainsi que le tissu normal adjacent. Utiliser le faisceau laser à impulsions d&#39;un diamètre de 10-20 pm avec une puissance de 70 à 90 mW. </li><li> Les zones de capture d&#39;intérêt avec des impulsions laser infrarouges sur un bouchon d&#39;LCM. Combiner les cellules de 2-5 bouchons pour l&#39;extraction miARN par échantillon. Pour garantir l&#39;intégrité de l&#39;ARN extrait, traiter immédiatement cellules capturées pour l&#39;extraction miARN. </li><li> En variante, des cellules de lyse dans le tampon d&#39;extraction miRNA (selon le protocole du fabricant) et store lysats à -80 ° C. </li></ol></li><li> Extraction miARN et Analyses de LCM microdisséquées tissus <ol><li> Extraire l&#39;ARN total à partir de tissus FFPE microdisséquées utilisant un kit commercial en suivant les instructions du fabricant. Remarque: Le rendement de l&#39;ARN à partir de capture laser miscrodissection est généralement faible. Par conséquent, l&#39;ARN est élue dans de faibles volumes (20-30 pi) et utilisé pour le profilage d&#39;expression en utilisant Taqman microARN essais d&#39;expression suivant les instructions du fabricant (également décrits dans la section 2.2). Optimisation de l&#39;ARN d&#39;entrée pour la détection de PCR en temps réel de miARN matures suggère que 5 ul de l&#39;ARN élue est optimale pour chaque réaction de transcription inverse spécifiques à des miARN. Comme un contrôle endogène, RNU48 / RNU24 est utilisé. Pour les réactions témoins, 2 ul de l&#39;ARN élue est utilisé pour la réaction de transcription inverse. </li></ol></li></ol></li><li> Isolement des miARN de Cancer de la prostate tissus congelés <ol><li> Homonize tissus prostatiques réséquées congelés par broyage des tissus dans de l&#39;azote liquide en utilisant un mortier et un pilon. Transfert homogénéisés de tissu un tube de microcentrifugation en utilisant une spatule refroidi. Maintenir le mortier / pilon et spatule à la même température en plongeant dans l&#39;azote liquide afin tissu homogénéisé peut être facilement transféré. </li><li> Ajouter commercial isothiocyanate de guanidine-phénol réactif (1 ml / 0,1 g de tissu) dans le tissu homogénéisé et incuber à température ambiante pendant 5 min. Remarque: les tissus homogénéisés dans la guanidine réactif isothiocyanate-phénol commerciale peuvent être conservés à -80 ° C pendant plusieurs mois. </li><li> Ajouter le chloroforme à l&#39;homogénat (0,2 ml de chloroforme / ml) et agiter vigoureusement pendant 30 sec. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 3-5 min, suivie d&#39;une centrifugation à 10 000 xg pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube stérile frais 1,5 ml sans RNase. </li><li> Ajouter un volume égal d&#39;alcool isopropylique. Mélanger et laisser incuber pendant 10 min à température ambiante suivie par centrifugation à 12.000 g pendant 20 min à 4 ° C pour sédimenter l&#39;ARN. </li><li> Aspirer le surnageant et laver le culot d&#39;ARN avec 1 ml d&#39;éthanol à 70%. Centrifugeuse à 12.000 g pendant 10 min à 4 ºC. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant. Culots d&#39;ARN à sec à température ambiante pendant 5-10 min. Dissoudre ARN dans 50-100 eau sans nucléase ul. </li><li> Effectuer la quantification de l&#39;ARN à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre NanoDrop et de déterminer l&#39;intégrité de l&#39;ARN avec un bioanalyseur. Ajuster la concentration d&#39;ARN de 10 ng / ul. Utilisez 10-50 ARN ng pour miRNA- réaction d&#39;ADNc spécifique suivie en temps réel par les analyses PCR (section 2.2). </li></ol></li></ol></li><li> PCR quantitative en temps réel pour miRNA expression Analyses Remarque: miARN matures dosage en utilisant un protocole de RT-PCR en deux étapes comme décrit ci-dessous. <ol><li> Transcription inverse (RT) <ol><li> Transcription inverse de l&#39;ARN à partir de l&#39;ADNc en utilisant un kit de transcription inverse miRNA conformément aux instructions du fabricant.Utilisez 10-50 ng d&#39;ARN total avec miARN amorce spécifique du kit microARN dosages et RT. Utilisez RNU48 / RNU24 / RNU6B comme témoins. Diluer ADNc 1: 5 à 1:10 (en fonction de l&#39;abondance du miRNA analysé) et utiliser dans la détection en temps réel PCR comme décrit dans l&#39;étape suivante. </li></ol></li><li> PCR en temps réel pour la détection de miARN mûr <ol><li> Amplifier les produits de PCR à partir d&#39;échantillons d&#39;ADNc en utilisant les tests de microARN avec un mélange maître universel rapide en conformité avec les instructions du fabricant. Normaliser échantillons à RNU48 / RNU24 / contrôle de RNU6B. Utilisez la méthode comparative Ct (cycle seuil) pour calculer les changements relatifs dans l&#39;expression des gènes sur le système de PCR en temps réel rapide. Analyser chaque échantillon en triple exemplaire. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. miRNA expression analyses par hybridation in situ (ISH) <ol><li> Pré-traitement des tissus <ol><li> Couper coupes de 5 um à partir de blocs de tissus cancéreux de la prostate FFPE utilisant un microtome. </li><li&gt; fix coupes de tissu par incubation des lames à 56 ° C pendant 1 heure. Remarque: Les diapositives peuvent être stockées à température ambiante pendant plusieurs semaines pour les analyses de miARN. </li><li> Deparrafinize les tissus en trempant les lames avec du xylene (2 x), pendant 15 minutes chaque. </li><li> Réhydrater les tissus en incubant les lames pendant 5 min dans de l&#39;éthanol gradué chaque (de 100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) puis de l&#39;eau distillée (5 min). </li><li> Fixer les lames avec 4% de paraformaldehyde dans PBS à la température ambiante pendant 20 min. </li><li> Laver les lames avec du PBS (2x) à la température ambiante pendant 5 minutes chacun. </li><li> Traiter les lames avec 10 ug / ml de proteinase K à 37 ° C pendant 10 min dans du tampon K proteinase préchauffé (Tris-HCl 5 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, 1 mM de NaCl). </li><li> Après le traitement à la protéinase-K, rincer les lames avec 0,2% de glycine dans du PBS pendant 30 sec. </li><li> Laver les lames dans du PBS (1x) à la température ambiante pendant 5 min. </li><li> Fixer les lames avec 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant 15 min. </li><li> Rincer les lames avecPBS pendant 5 min. </li></ol></li><li> Hybridation <ol><li> Pré-hybrider les diapositives avec solution de pré-hybridation pendant 3-4 heures à 55 ° C dans une chambre humidifiée. Utiliser des lingettes de laboratoire de tissus imbibés de formamide à 50% / 50% 5x SSC de garder la chambre humidifié. </li><li> Utilisez 5 &#39;des sondes marquées à la digoxigénine à une concentration de 20 à 50 nM dans du tampon d&#39;hybridation. Diluer sonde spécifique miARN (20-50 nM) et une petite sonde de contrôle de U6 ARN nucléaire (20 nM), la chaleur à 90 ° C pendant 4 min, placez-le sur la glace, et d&#39;ajouter de la glace tampon d&#39;hybridation à froid (2-4 ng / pl ). </li><li> Retirer solution de pré-hybridation, ajouter la solution d&#39;hybridation (sonde + tampon d&#39;hybridation, 100 pi par diapositive), incuber pendant 12-16 h à la température d&#39;hybridation spécifique sonde (température = hybridation sonde-Tm 21 ºC). Effectuer des hybridations dans une chambre humidifiée (50% de formamide / 50% 5x SSC). </li></ol></li><li> Les étapes de lavage <ol><li> Laver les lames avec 2x SSC pendant 10 min à 45 ° C. </li><li> Laver til glisse avec 1,5x SSC pendant 10 min à 45 ° C. </li><li> Laver les lames avec 0,2x SSC (2x) à 37 ºC pendant 20 minutes chacun. </li><li> Incuber les lames avec une solution de blocage de 1x pendant 1-2 heures à la température ambiante </li></ol></li><li> Détection <ol><li> Incuber les lames avec 1: 100 PBS dilué anticorps anti-digoxigénine conjugué AP-pour 1-4 heures ou une nuit à 4 ºC. </li><li> Laver les lames avec du PBS (3x) à température ambiante pendant 10 minutes chacun. </li><li> Laver les lames (2x) avec de la phosphatase alcaline tampon (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20) à température ambiante pendant 5 min chacun. </li><li> Incuber les lames dans le substrat BM Violet AP dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 1-20 h. </li><li> Rincer les lames avec du PBS contenant 0,1% de Tween-20 et lavage (2x) dans l&#39;eau. </li><li> Monter les lames en utilisant un milieu de montage aqueux et d&#39;examiner sous un microscope. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n’ont pas de divulgations financières.

Dans cet article, nous décrivons un flux de travail simplifié pour l&#39;expression du miARN profilage dans FFPE archivé ou tissus cliniques sur le cancer de la prostate frais congelé. Dans le cancer de la prostate, plusieurs études suggèrent un rôle important des microARN dans cancer de la prostate initiation, la progression et les métastases. Cependant, des résultats contradictoires sont souvent obtenus sur un miRNA spécifique 22 depuis l&#39;extraction des miARN et analyses méthodes diffèrent largement. Co...

Cancer de la glande de la prostate est une tumeur maligne mâle fréquemment diagnostiqué qui est l&#39;une des principales causes de mortalité liée au cancer chez les hommes. Aux États-Unis, on estime que 220,800 nouveaux cas et 27,540 décès seront rapportés en 2015 1. Cancer de la prostate est une maladie hétérogène avec une maladie très variable Cours-tumeurs peuvent être indolent ou très agressif. Un défi majeur dans le cancer de prostate gestion clinique est posé par l&#39;insuffisance des méthodes actuellement utilisées / biomarqueurs pour le dépistage de la maladie, le diagnostic, le pronostic et le traitement 2. Méthodes de dépistage actuelles comprennent l&#39;antigène (PSA) des tests spécifiques de la prostate et un toucher rectal (DRE), suivi par biopsies de la prostate 3. Antigène spécifique de la prostate (PSA) est le biomarqueur du cancer de la prostate le plus largement utilisé qui a considérablement révolutionné la gestion clinique et l&#39;amélioration des taux de survie 4. Toutefois, en raison des limites inhérentes de PSA incluant le lack de spécificité, le dépistage à base de PSA-dessus a conduit à un diagnostic et un traitement sur de la maladie. Dans cette perspective, des efforts intensifs sont dirigés vers la recherche de biomarqueurs du cancer de la prostate de rechange, en particulier ceux qui peuvent prédire l&#39;agressivité de la maladie et de conduire de meilleures décisions de traitement 4,5. Au cours des quelques dernières années, les microARN (miARN) sont apparus comme des biomarqueurs du cancer de la prostate alternatives prometteuses. Les microARN (miARN) constituent une classe évolutif conservé de petits ARN non-codants qui suppriment l&#39;expression génique post-transcriptionnelle par des interactions spécifiques de séquence avec les régions non traduites 3 &#39;UTR () de cibles d&#39;ARNm apparentés. On estime que&gt; 60% des ARNm cibles sont conservées de miARN 6. miRNA gènes sont situés dans les régions intergéniques ou dans des introns ou exons de protéines / non-protéique gènes codant 7. Ces gènes sont préférentiellement transcrites par l&#39;ARN polymérase II dans primamiARN ry (pri-miARN, plusieurs kilobases de long) qui forment en épingle à cheveux en forme de tige-boucle structures secondaires. Ces pri-miARN sont transformées en précurseurs miARN (pré-miARN, 60-75 nucléotides de long) qui sont exportés vers le cytoplasme et traitées ultérieurement dans miARN matures (18-25 nucléotides de long) 8-10. miARN régulent les processus cellulaires clés, y compris la prolifération, le développement, la différenciation et l&#39;apoptose 11. Des études suggèrent une dérégulation généralisée des profils d&#39;expression de miARN dans diverses affections malignes humaines, notamment le cancer de la prostate de 12 à 15. les profils d&#39;expression de miARN ont été rapportés pour être largement dérégulée dans le cancer de la prostate primaire et métastatique. L&#39;expression du miARN modifié ont été liés à la progression du cancer de la prostate, de l&#39;agressivité et de la récurrence soulignant le potentiel pronostique des miARN 12,14,16-19. Un nombre croissant de preuves indique que miARN jouent des rôles importants dans l&#39;initiation mécanistes de cancer de la prostate, le développement, le progrèsion et les métastases. Globalement, miARN sont en train de biomarqueurs suppléants prometteuses pour le diagnostic du cancer de la prostate et le pronostic qui peuvent distinguer entre les tissus normaux et cancéreux et de l&#39;aide dans la stratification des tumeurs de la prostate 12. Aussi, miARN sont des cibles importantes pour le développement de traitements efficaces contre le cancer de la prostate 20. En raison de leur petite taille et de résistance à l&#39;activité de RNase endogène, miARN sont biomarqueurs stables qui peuvent être facilement détectés dans les tissus fixés au formol et 21 biopsies de la prostate 22. En outre, les profils d&#39;expression des miARN ont été comparés dans les tissus fixés au formol et congelés et ont été trouvés à être fortement corrélé 21. Toutefois, l&#39;expression des miARN profilage dans les tissus cliniques sur le cancer de la prostate est souvent difficile en raison de l&#39;hétérogénéité tumorale, les erreurs d&#39;échantillonnage, la contamination du stroma etc. Le développement des miARN comme biomarqueurs efficaces pour cancer de la prostate fortement relies sur leur détection précise dans les tissus cliniques. Nous décrivons ici un workflow simplifié utilisé dans notre laboratoire pour l&#39;expression des miARN profilage dans FFPE archivé ou échantillons cliniques de cancer de la prostate frais congelé. Nous employons une combinaison de PCR quantitative en temps réel et l&#39;hybridation in situ pour les miARN dans les analyses d&#39;échantillons cliniques, avec l&#39;ancien donnant davantage d&#39;informations quantitatives et celui-ci pour visualiser l&#39;expression différentielle des biomarqueurs miARN potentiels dans un éventail de tissus. Dans ce flux de travail, nous optimisons les méthodologies existantes pour l&#39;extraction miARN de FFPE et les tissus de la prostate congelés, les analyses d&#39;expression par TaqMan sonde basée miARN RT-PCR et miARN technique d&#39;hybridation in situ en utilisant l&#39;acide nucléique verrouillé (LNA) à base de sondes 23. Sondes à base de LNA offrent une sensibilité et une spécificité accrue par rapport à l&#39;ADN ou de l&#39;ARN sondes basées et permet une détection robuste de toutes les séquences de miARN, quelle que soit leur teneur en GC et permettent également discrimination des familles de miARN. Notre protocole optimisé ISH miARN peut être appliquée sur les lames de cancer de la prostate ou de tissus microarrays de tissu de cancer de prostate (TMA), ce dernier offrant la possibilité d&#39;accélérer la découverte de biomarqueurs miARN.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems&nbsp ;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix pour LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>Alternativement, le système Arcutus Xt de Life Technologies® peut être utilisé.&nbsp ;</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps Life</td><td>Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE Kit&nbsp ;</td>Système PCR rapide en temps réel <td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR master mix&nbsp ;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>Sonde LNA marquée DIG pour U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP substrat</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Solution de pré-hybridation&nbsp ;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hybridation&nbsp ;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td><td></td></tr><tr><td>Solution de blocage&nbsp ;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-digoxigénine conjugué à l’AP</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td><td></td></tr><tr><td>Milieux de montage aqueux&nbsp ;</td><td>Laboratoires Vecteurs&nbsp ;</td><td>H-5501&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (réactif isothiocyanate-phénol de guanidine)&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a></td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&nbsp ;</td><td>Statlab</td><td>SL201 ;</td><td></td></tr></tbody></table>

mirna expression analyses en cancer de la prostate tissus cliniques

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Un défi essentiel à cancer de la prostate (CaP) prise en charge clinique est posé par l&#39;insuffisance des biomarqueurs actuellement utilisés pour le dépistage de la maladie, le diagnostic, le pronostic et le traitement. Au cours des dernières années, les microARN (miARN) ont émergé biomarqueurs suppléants prometteuses pour le diagnostic du cancer de la prostate et le pronostic. Cependant, le développement de biomarqueurs miARN comme efficaces pour cancer de la prostate repose en grande partie sur leur détection précise dans les tissus cliniques. miARN analyse des spécimens cliniques sur le cancer de la prostate est souvent difficile en raison de l&#39;hétérogénéité tumorale, les erreurs d&#39;échantillonnage, la contamination du stroma, etc. Le but de cet article est de décrire un flux de travail simplifié pour miARN analyse en FFPE archivé ou spécimens cliniques sur le cancer de la prostate frais congelé en utilisant une combinaison de quantitative PCR en temps réel (RT-PCR) et l&#39;hybridation in situ (ISH). Dans ce flux de travail, nous optimisons les méthodologies existantes pour l&#39;extraction de miARN FFPE et tissu de la prostate gelées et l&#39;expression analyses par TaqMan sonde basée miARN RT-PCR. En outre, nous décrivons une méthode optimisée pour ISH analyse de la détection formiRNA dans les tissus de la prostate à l&#39;aide de l&#39;acide nucléique verrouillé (LNA) - sondes basées. Notre protocole optimisé ISH miARN peut être appliquée sur les lames de cancer de la prostate ou de tissus microarrays de tissu de cancer de prostate (TMA).

Expression profiling de miR-203 dans des échantillons cliniques LCM prostate primaire de cancer par analyse RT-PCR (Figure 1) Les analyses par RT-PCR de l&#39;expression par rapport miR-203 dans des tissus de cancer de la prostate primaire LCM et les régions adjacentes appariées normales a été réalisée comme décrit dans l&#39;Saini et al. RNU48 15 a été utilisé comme témoin. Le tableau suivant résume l&#39;expression relative miR-203 dans des tissus de tu...

Nous décrivons ici un protocole simplifié pour l’analyse de l’expression des microARN (miARN) dans des tissus cliniques archivés de cancer de la prostate (FFPE) ou de cancer de la prostate (PCa) fraîchement congelés utilisant la PCR quantitative en temps réel (RT-PCR) et l’hybridation in situ (ISH).

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A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

L'objectif général de cette vidéo est de décrire un flux de travail simplifié pour l'analyse des microARN dans des échantillons cliniques de cancer de la prostate archivés, en combinant une PCR quantitative en temps réel et une hybridation NC deux avec l'utilisation de sondes à acide nucléique bloqué. Ce résultat est obtenu en isolant d'abord le tissu à partir de coupes de cancer de la prostate en inclusion paraffine (FFPE) à l'aide de la microdissection par capture laser, suivie d'une extraction des microARN. Ensuite, une RT-PCR en deux étapes est utilisée pour quantifier les microARN dans le tissu, et pour localiser les microARN, une analyse d'hybridation C deux est réalisée à l'aide de sondes LNA marquées à la digoxygénine et d'un anticorps anti-dig conjugué à la phosphatase alcaline, révélé par BM purple.Les résultats présentés montrent l'expression d'un microARN dans des tissus cliniques de cancer de la prostate. Grâce à ces techniques, les microARN se sont récemment imposés comme des biomarqueurs alternatifs prometteurs pour le cancer de la prostate. Toutefois, l'analyse de l'expression des microARN et des échantillons cliniques de cancer de la prostate est souvent difficile en raison de facteurs perturbateurs tels que l'hétérogénéité des tumeurs prostatiques et la contamination par des éléments stromaux.Nous travaillons dans le domaine des microARN et des ARN non codants depuis 10 ans. Nous avons optimisé les conditions d'expression des microARN à différents stades du cancer de la prostate. Nous pensons que l'expression des microARN peut être utilisée comme biomarqueur diagnostique et pronostique, car elle est corrélée au résultat clinique du cancer de la prostate.Nous pensons également que les microARN peuvent être utilisés pour le traitement du cancer de la prostate à l'aide de la technologie des nanoparticules. Le profilage précis de l'expression dans le carcinome de la prostate est souvent entravé par l'hétérogénéité des lésions. Ce problème est en partie résolu en utilisant la microdissection par capture au laser ou LCM afin de recueillir des cellules épithéliales bénignes ou malignes pures et de réduire leur mélange avec les cellules stromales.La microdissection laser (LCM) de tissus FFP archivés, suivie d’un profilage de l’expression des microARN, s’est révélée être une technique sensible, fiable et rentable, utilisée comme méthode complémentaire. L’hybridation in situ optimisée permet d’obtenir une vue d’ensemble des localisations d’expression des microARN. Une fois les tissus collectés et découpés en sections de 10 microns, enlever le paraffine sous hotte chimique, tremper les lames dans du xylène pendant 10 minutes, deux fois, puis réhydrater les tissus en les transférant dans une série de bains d’alcool de plus en plus aqueux. Ensuite, appliquer une coloration à l’hématoxyline pendant 30 secondes et rincer les lames à l’eau.À présent, réhydratez les tissus en les faisant passer par une autre série alcoolique progressive, en commençant par 70 %. Ensuite, immergez les sections dans du xylène pendant cinq minutes et laissez-les sécher à l'air libre. Apportez les lames sèches à l'appareil de microdissection par capture laser. Utilisez les lames annotées par un pathologiste pour identifier les foyers de cancer de la prostate ainsi que les zones bénignes ou normales.Suivez les directives du fabricant pour effectuer la microdissection par capture au laser. Réglez la largeur du faisceau entre 10 et 20 micromètres et appliquez des impulsions de 70 à 90 milliwatts. Utilisez des impulsions infrarouges pour capturer les zones d'intérêt sur les capsules de microdissection par capture au laser.Pour chaque échantillon, ajouter le contenu du bouchon dans un tube de collecte et traiter immédiatement les cellules pour l'extraction d'ARN micro. Extraire l'ARN total à l'aide d'un kit commercial conformément aux instructions du fabricant. Éluer l'ARN dans 20 à 30 microlitres d'eau sans nucléase et poursuivre rapidement.Ensuite, utilisez un kit de réaction de transcriptase inverse pour synthétiser des ADNc à l'aide d'amorces spécifiques des microARN. Préparez chaque réaction en utilisant de 10 à 100 nanogrammes d'ARN total. Une fois obtenus, diluez l'ADNc d'un facteur cinq à 10 pour atteindre une concentration d'environ un à 20 nanogrammes.Préparez maintenant les réactions de PCR en triple exemplaire à partir de l'ADNc en utilisant des tests d'ARN micro avec un mélange maître universel rapide pour le témoin. Utilisez RNU 48 comme matrice pour calculer la variation relative de l'expression génique. Utilisez la méthode comparative du CT pour commencer à prétraiter les coupes tissulaires de cinq micromètres d'épaisseur.Fixer les lames à 56 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, déparaffiner les lames à l'aide de deux bains de xylène de 15 minutes chacun à température ambiante. Après les xylènes, réhydrater les tissus à l'aide d'une série d'éthanol à concentration décroissante. Puis, laisser les tissus tremper dans l'eau pendant cinq minutes.Ensuite, fixez les tissus avec du PFA à 4 % dans du PBS à température ambiante pendant 20 minutes. Éliminez le fixateur par deux lavages de cinq minutes dans du PBS. Chargez maintenant la protéinase K puissante à 10 microgrammes par millilitre dans le tampon de protéinase K préchauffé, et incubez les tissus à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Après le traitement, rincer les lames avec du glycine 0,2 % dans du PBS pendant 30 secondes et laver les lames dans du PBS à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, les imbiber à nouveau dans du PFA 4 % pendant 15 minutes. Puis, éliminer le fixateur par deux bains de PBS de cinq minutes chacun.Les tissus sont désormais prêts à être hybridés. Dessinez d'abord un cercle hydrophobe autour du tissu à l'aide d'un stylo à traceur afin que la solution des étapes suivantes reste sur la section de tissu. Incubez les tissus dans du tampon de pré-hybridation pendant trois à quatre heures à 55 degrés Celsius.Effectuez cette étape dans une chambre humidifiée par des serviettes imbibées d'une solution contenant 50 % de formamide et 50 % de solution SSC 5×. Préparez maintenant le diggène et la sonde marquée spécifique de micro ARN, ainsi que la sonde témoin. Prévoyez une dilution comprise entre 20 et 50 nanomolaires, mais diluez d'abord les sondes avec seulement 25 microlitres de tampon d'hybridation, soit moins que nécessaire pour la dilution finale. Ensuite, chauffez les sondes à 90 degrés Celsius pendant environ quatre minutes.Ensuite, placez les sondes sur de la glace. Enfin, diluez davantage les sondes avec du tampon d'hybridation glacé jusqu'à leurs concentrations finales de 20 à 50 nanomolaires. Appliquez maintenant 100 à 400 microlitres de solution de sonde sur chaque lame.Incubez-les ensuite pendant 12 à 16 heures à la température d'hybridation appropriée. Le jour suivant, effectuez un lavage avec une solution SSC en plusieurs étapes après les hybridations. Incubez les lames dans la solution de blocage à température ambiante pendant une à deux heures après le blocage.Imprégnez les tissus d'anticorps anti-digoxigénine conjugué à la phosphatase alcaline à une dilution comprise entre 1/1 et 1/100 dans du PBS. Incubez pendant une à quatre heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, éliminez l'excès d'anticorps par trois lavages au PBS, de dix minutes chacun.Procéder à deux lavages de cinq minutes dans un tampon urinaire à température ambiante. Incuber ensuite les lames dans le substrat BM Purple AP, protégé de la lumière, à température ambiante pendant une heure à vingt heures. Le jour suivant, éliminer le BM Purple par un rinçage dans du PBS à 0,1 %.Ensuite, les laver deux fois dans de l'eau et les monter avec des milieux de montage aqueux en utilisant le protocole décrit d'extraction de microARN et de RT-PCR. Le microARN 203 a été examiné dans des tissus cancéreux de la prostate et dans des tissus adjacents normaux. L'expression relative a varié dans une fraction importante des tissus.RNU 48 a été utilisé comme témoin. Les tissus de cancer de la prostate ont été soit microdisséqués au microscope, soit soumis à la microdissection par capture laser (LCM), puis l'expression relative des microARN a été analysée. L'expression de miR-383 dans les tissus tumoraux a été comparée à celle des témoins normaux appariés.Les tissus préparés par MLC ont permis de détecter l'expression des microARN de manière plus fiable. Dans le cadre du système C deux, une hybridation avec le microARN 203 a été réalisée sur des tissus cancéreux prostatiques normaux et métastatiques osseux. U six. La détection d'ARN a été utilisée comme contrôle en fonction de l'intensité de la coloration. L'expression du microARN 2 0 3 a été notée de un à quatre dans les cellules de chaque tissu. L'expression s'est donc révélée statistiquement plus faible dans le tissu métastatique osseux.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment évaluer l'expression des microARN dans des échantillons cliniques de cancer de la prostate au cours de l'ensemble du protocole. Il est primordial de maintenir un environnement exempt d'ARN. De plus, manipuler le paraformaldéhyde et la solution saline peut présenter des risques extrêmement élevés, et des précautions telles que travailler sous une hotte aspirante et porter des équipements de protection individuelle doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.Après avoir suivi cette procédure, nous effectuons une analyse statistique afin d'évaluer si les profils d'expression des microARN sont corrélés aux variables clinico-pathologiques de la maladie, ce qui nous permet de répondre à des questions essentielles, telles que savoir si l'expression d'un microARN particulier présente un potentiel pronostique ou diagnostique. Notre protocole optimisé d'hybridation in situ des microARN peut être appliqué à des lames de tissu de cancer de la prostate ou à des puces tissulaires de cancer de la prostate. Ce protocole peut également être adapté à d'autres types de tissus moyennant des optimisations.

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Quantitative de réaction en chaîne polymérase en temps réel (qPCR) est une méthode rapide et sensible pour enquêter sur les niveaux d'expression de microARN (miARN différents) des molécules dans des échantillons tumoraux. En utilisant cette expression méthode de centaines de molécules différentes miARN peuvent être amplifiés, quantifiés, analysés et partir du même modèle d'ADNc.

Détection MicroRNA dans les tumeurs prostatiques par quantitative PCR en temps réel (qPCR)

Rétrovirus endogènes humains (HERV), qui occupent 8% du génome humain, conservent les capacités de codage rares mais une centaine de milliers de longues répétitions terminales (LTR). Une coutume Affymetrix microarray a été conçu pour identifier les individus expression du locus HERV et a été utilisé sur les tissus de cancer de la prostate comme une preuve de concept pour de futures études cliniques.

Identification à base de microréseaux de HERV individuelle Loci Expression: Demande de Découverte de biomarqueurs dans le cancer de la prostate

Moléculaire de signalisation par des œstrogènes et les microARN sont essentiels dans le développement du cancer du sein et de la croissance. L'œstrogène active les récepteurs d'oestrogène, qui sont des facteurs de transcription. De nombreux facteurs de transcription peuvent réguler l'expression de microARN, et microARN régulés par les œstrogènes peuvent être profilée en utilisant différentes techniques de grande envergure.

Profilage de microARN œstrogène réglementés dans les cellules du cancer du sein

L’objectif de ce protocole est d’utiliser la micro-dissection par capture laser comme méthode efficace pour isoler des populations pures de types cellulaires à partir de tissus prostatiques hétérogènes pour l’analyse de l’ARN en aval.

Laser-microdissection de la prostate humaine épithélium pour l&#39;analyse de l&#39;ARN

L’immunohistochimie est une technique de laboratoire puissante pour évaluer la localisation et l’expression des protéines dans les tissus. Les méthodes semi-automatisées actuelles de quantification introduisent de la subjectivité et créent souvent des résultats irreproductibles. Nous décrivons ici des méthodes d’immunohistochimie multiplexée et de quantification objective de l’expression et de la co-localisation des protéines à l’aide de l’imagerie multispectrale.

Quantification de l&#39;expression protéique et co-localisation utilisant multiplexé Immuno-histochimie Coloration et multispectrale Imaging

Ici, nous présentons un protocole pour détecter l’expression de miARN dans des échantillons de patientes atteintes d’un cancer du sein en utilisant l’hybridation in situ de miARN.

Analyse clinicopathologique de miRNA expression dans le cancer du sein à l&#39;aide de tissus miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; hybridation

Ce protocole d’extraction modifié améliore les rendements en ARN et en ADN à partir de régions d’intérêt plus précisément ciblées dans les blocs de tissus histopathologiques.

Préparation de Cores de tissus enrobés de paraffine fixés au formol pour les ARN et d&#39;extraction d&#39;ADN

Dégradation de l’acide nucléique dans les tissus d’archivage, l’hétérogénéité tumorale et un manque d’échantillons de tissus congelés frais peut nuire aux services de diagnostic du cancer dans les laboratoires de pathologie dans le monde entier. Ce manuscrit décrit l’optimisation d’un panel de biomarqueurs à un dosage de multiplex de billes magnétiques pour classer les cancers du sein.

Optimisation d’un test d’Expression de base d’ARN Multiplex à l’aide de documents d’archives de Cancer du sein

Nous présentons un protocole pour évaluer les niveaux d’expression des microARN (miARN) en circulation dans les échantillons de plasma de patients atteints de cancer. En particulier, nous avons utilisé un kit disponible dans le commerce pour faire circuler l’extraction de miRNA et transcriptase inverse. Enfin, nous avons analysé un panel de 24 miARN sélectionnés à l’aide de plaques personnalisées sonde préalablement repéré en temps réel.

Détection d’un Panel de micro-ARN Custom circulant chez les Patients atteints de Cancer Colorectal métastatique

La résistance de thérapie se développe souvent dans les patients présentant le cancer de la prostate avancé, et dans certains cas, le cancer progresse à un sous-type mortel appelé cancer de la prostate neuroendocrine. L'évaluation des petits changements moléculaires non codants à médiation d'ARN qui facilitent cette transition permettrait une meilleure stratification de la maladie et l'identification des mécanismes causals qui mènent au développement du cancer de la prostate neuroendocrine.

Séquençage de petits ARN non codants à partir de tissus fixeds et d'exosomes dérivés du sérum provenant de patients atteints d'un cancer de la prostate résistant à la castration

Le protocole décrit un test d’hybridation par immunofluorescence en tandem avec du tissu fixé au formol et inclus dans de la paraffine pour détecter et quantifier simultanément les microARN et les protéines multiplexées.

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Découvrez une méthode simplifiée d'analyse de l'expression des microARN dans les tissus cliniques de cancer de la prostate par PCR quantitative et hybridation in situ. Ce protocole permet d'identifier des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques.

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